Name: 免疫組織化学とデジタル画像解析に基づく子宮内膜免疫細胞の定量的検出のためのプラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶ 免疫組織化学とデジタル画像解析を用いた子宮内膜免疫細胞の定量的検出法。CD56陽性細胞などの免疫細胞構成を正確に解析し、反復流産患者の生殖不全原因解明に貢献する新規プラットフォームです。

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著者らは、この研究に同意し、サンプルを提供してくれたすべての女性に感謝しています。

研究内容とプロトコルは、深セン中山泌尿器科病院の研究倫理委員会によって倫理的にレビューされ、承認されています。研究に参加したすべての女性(20〜40歳)は、サンプルの収集と使用についてインフォームドコンセントを提供しました。
1.病理組織の獲得
<ol><li>ティッシュ採取用のツール、つまり測定定規、ピンセット、埋め込みカセット、埋め込み紙、ティッシュバスケットを準備します。</li>
	<li>ピペルカテーテルによる標準的なアプローチを使用して収集された子宮内膜組織(緑豆よりも大きい)の量が十分であるかどうかを観察します。</li>
	<li>子宮内膜組織をホルマリンからピンセットで包埋紙に転写し、定規で子宮内膜組織の寸法を測定します。</li>
	<li>子宮内膜組織を包埋紙で包み、包埋カセットに入れます。</li>
	<li>包埋カセットをティッシュバスケットに入れて脱水します。</li>
</ol>2.組織の脱水
<ol><li>組織バスケットを脱水機の反応チャンバーに入れ( 材料表を参照)、日常的な組織脱水の手順を開始します:ホルマリンを100分間。ホルマリンを100分間。アルコール度数75%で60分。アルコール度数85%で60分。アルコール度数95%で60分。アルコール度数100%で60分。アルコール度数100%で60分。アルコール度数100%で60分。キシレンで35分。キシレンで20分。キシレンで20分。80分間ワックスをかけます。80分間ワックスをかけます。80分間ワックスを塗る。このプロセスには約15時間かかります。</li>
	<li>組織脱水手順の最後に、脱水機の反応室を開き、組織バスケットを取り外します。</li>
</ol>3. 組織包埋
<ol><li>試料の大きさに応じて適当な包埋型を取り出し、70°Cでパラフィンワックスを充填する。</li>
	<li>ティッシュを型にすばやく入れ、ティッシュが型の中心に配置されるように慎重に調整します。</li>
	<li>金型を冷却プレートにスムーズに移動し、底のパラフィンが固まるまでティッシュをそっと押します。</li>
	<li>型の上に埋め込みカセットを置き、さらにワックスを補充します。</li>
	<li>金型を冷却プレートに置き、パラフィンが完全に固まったら、カセットを取り付けたブロックを金型から取り外します。</li>
</ol>4. 組織切片
<ol><li>ブロックをミクロトームのサンプルクリップに挿入し、ブレードをホルダーに置き、ブロックの平面とブレードの間の角度を調整し、セクションの厚さを4μmに調整し、ハンドホイールを回してスライスを開始します。</li>
	<li>ブロックからいくつかの薄い切片を切り取って、適切な組織表面を露出させます。ブラシで連続したセクションと完全なセクションを取り出します。</li>
	<li>十分な切片が切断されたら、ハンドホイールを回すのをやめ、ピンセットで前端の不適格な切片を取り除き、ピンセットとブラシでウォーターバス内の42°Cの水の表面に切片を浮かせます。</li>
	<li>切片が完全に平らになったら、剥離防止スライドで切片を選び、65°Cのスライドウォーマーに移して60分間焼きます。</li>
	<li>焼きが終わったら、スライドウォーマーからスライドガラスを取り出します。</li>
</ol>5. 免疫組織化学的染色
<ol><li>一次抗体を抗体希釈液で作業溶液に希釈します。詳しくは、 表 1 を参照してください。</li>
	<li>希釈した抗体溶液を専用の試薬ボトルに入れ、検出キットを自動IHC染色装置の試薬室に入れます( 材料表を参照)。</li>
	<li>スライドを特殊なカバータイルで覆われたスライドホルダーに置き、装置の実験反応コンパートメントに挿入します。</li>
	<li>スライド上の試薬と実験情報が自動的に認識されたら、[ 開始 ]ボタンをクリックして免疫組織化学染色を開始します。実験は約3時間続きます。</li>
</ol>6.スライドの脱水と密封
<ol><li>免疫組織化学的染色後、スライドホルダーを取り出し、特殊なカバータイルをはがし、染色したスライドをスライドホルダーに入れ、スライドに残っている染料をきれいな水で洗い流します。</li>
	<li>スライドホルダーを自動カバースリッパ( 材料表を参照)に移し、脱水および密封手順を選択して実行します。</li>
	<li>脱水と密封後にスライドを取り出します。</li>
</ol>7.スキャニングスライド
<ol><li>スライドをパノラマ病理画像スキャナーのスライドラック( 材料表を参照)に置き、パノラマ病理画像スキャン用の機器スライドスキャンコンパートメントに置きます。スキャンには2分かかります。 図 1 を参照してください。</li>
</ol>8. 画像の解析
<ol><li>画像をインポート<ol><li>病理画像解析ソフト( 資料表参照)を開き、新規フォルダを作成します。分析する免疫組織化学的画像をインポートします。</li>
	</ol></li>
	<li>組織分類器の構築<ol><li>複数の組織と空白の注釈をマークして、組織と空白領域をそれぞれ識別するための分類器をトレーニングおよび確立します。</li>
		<li>リアルタイムチューニングを使用して、マーク注釈中にソフトウェアの認識能力をリアルタイムで観察します。認識がタイムリーでない場合は、注釈をメモし、組織認識が正確になるまで再度トレーニングします。</li>
	</ol></li>
	<li>ビルド分析アルゴリズム<ol><li>実験の種類に応じて、ソフトウェアで標準アルゴリズム(マルチプレックスIHC)を選択します。</li>
		<li>典型的なネガティブピクセルとポジティブピクセルを選択して、セル認識の色パラメータを設定します。 これに基づいて、核、細胞質、および細胞膜のパラメータを設定し、画像に最適なパラメータが見つかるまで、細胞認識状況をリアルタイムで観察します。</li>
		<li>正の細胞認識閾値を設定し、適切な閾値が調整されるまでリアルタイムに認識状況を観察します。</li>
		<li>アルゴリズムで組織分類器を選択し、組織分類器で組織部分をチェックして、組織に基づいて細胞を識別します。この時点で、解析アルゴリズムの確立は完了です。</li>
	</ol></li>
	<li>画像解析の実行<ol><li>解析エリアを選択します。確立されたアルゴリズムを使用して画像を解析します。</li>
	</ol></li>
	<li>ソフトウェア解析が終了したら、組織認識、陰性および陽性の細胞認識など、画像認識が正確かどうかを手動で確認します。</li>
	<li>画像認識が正確でない場合は、アルゴリズムとパラメーターのしきい値を再度調整し、成功するまで画像解析を再実行します。解析結果をエクスポートします。 図 1 を参照してください。</li>
	<li>他の免疫細胞も、上記の手順に従って分析できます(図1を参照)。さまざまな子宮内膜免疫マーカー(CD56 + uNK細胞、Foxp3 + Treg、CD68 +マクロファージ、CD163 + M2マクロファージ、CD1a + DCおよびCD8 + T細胞25,26)の実際の発現に応じて、さまざまな分析パラメーターを設定します。</li>
	<li>ソフトウェアの計算を通じて、子宮内膜免疫細胞の割合を取得します( 表2を参照)。これを使用して、反復流産患者の子宮内膜内のさまざまな免疫細胞のレベルを評価します。</li>
</ol>

免疫組織化学的に染色された子宮内膜組織の画像解析

<ol><li>Practice Committee of the American Society for Reproductive. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+treatment+of+recurrent+pregnancy+loss%3A+a+committee+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion.</a> Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).</li>
<li>Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Recurrent pregnancy loss.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98(2020).</li>
<li>Kavvadas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Evaluation+of+CD3%2C+CD4%2C+CD8%2C+and+CD20+in+Decidual+and+Trophoblastic+Tissue+Specimens+of+Patients+with+Recurrent+Pregnancy+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss.</a> 12 (2), 177-193 (2022).</li>
<li>Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexplained+repeated+pregnancy+loss+and+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Obstetrics%2C+Gynecology%2C+and+Reproductive+Biology%22%5BJournal%5D)">Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells.</a> European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).</li>
<li>Du, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+percentage+of+CD3%28%2B%29T+cells+and+pregnancy+outcome+in+women+with+recurrent+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss.</a> Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).</li>
<li>Faas, M. M., de Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+NK+cells+and+macrophages+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Uterine NK cells and macrophages in pregnancy.</a> Placenta. 56, 44-52 (2017).</li>
<li>Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variety+of+opportunities+for+immune+interactions+during+trophoblast+development+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).</li>
<li>Meyer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chymase-producing+cells+of+the+innate+immune+system+are+required+for+decidual+vascular+remodeling+and+fetal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth.</a> Scientific Reports. 7, 45106(2017).</li>
<li>Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+immune+cell+involvement+in+decidual+spiral+arteriole+remodeling+in+early+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).</li>
<li>Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+CD56%2B+natural+killer+cells+in+women+with+recurrent+miscarriage%3A+a+histomorphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study.</a> Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+uterine+natural+killer+cell+percentage+in+the+periimplantation+endometrium+from+fertile+women+and+women+with+recurrent+reproductive+failure%3A+establishment+of+a+reference+range%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).</li>
<li>Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells+in+peri-implantation+endometrium+from+women+with+repeated+implantation+failure+after+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF.</a> Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).</li>
<li>Laird, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+immune+cells+and+molecules+in+women+with+recurrent+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).</li>
<li>Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+miscarriages+and+the+association+with+regulatory+T+cells%3B+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review.</a> Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105(2020).</li>
<li>Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endometrial+immune+environment+of+women+with+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">The endometrial immune environment of women with endometriosis.</a> Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).</li>
<li>Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Function+and+Composition+Changes+of+Immune+Cells+During+Normal+and+Pathological+Pregnancy+at+the+Maternal-Fetal+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2317(2019).</li>
<li>Hey-Cunningham, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+utilizing+flow+cytometry+and+immunohistochemistry+reveals+inflammatory+changes+in+local+endometrial+and+systemic+dendritic+cell+populations+in+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis.</a> Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Immune+Infiltration+in+Endometriosis+and+Their+Relationship+to+r-AFS+Stages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages.</a> Frontiers in Genetics. 12, 631715(2021).</li>
<li>Attems, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+consensus+criteria+for+the+evaluation+of+Lewy+pathology+in+post-mortem+brains%3A+a+multi-centre+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologic%22%5BJournal%5D)">Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study.</a> Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).</li>
<li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+Assessment+of+Aging-Related+Tau+Astrogliopathy+%28ARTAG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG).</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).</li>
<li>Modis, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+changes+in+corneal+opacification+vary+depending+on+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology.</a> Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+quantitative+immunohistochemistry+method+for+precise+protein+measurements+directly+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+specimens%3A+analytical+performance+measuring+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2.</a> Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).</li>
<li>Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Immunohistochemistry+and+Digital+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).</li>
<li>Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Immune+Cells+in+Recurrent+Spontaneous+Abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion.</a> Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).</li>
<li>Diao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+endometrial+immune+cell-based+score+%28EI-score%29+for+the+prediction+of+implantation+success+for+patients+undergoing+IVF%2FICSI%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI.</a> Placenta. 99, 180-188 (2020).</li>
<li>Hewitt, S. C., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology.+A+hand+to+support+the+implantation+window%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell biology. A hand to support the implantation window.</a> Science. 331 (6019), 863-864 (2011).</li>
<li>Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chorionic+gonadotropin+and+Notch1+in+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).</li>
<li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+multiplex+immunohistochemistry%2Fimmunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communication+%28London%2CEngland%29%22%5BJournal%5D)">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).</li>
<li>Algars, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+and+location+of+tumor-infiltrating+macrophages+and+lymphatic+vessels+predict+survival+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients.</a> International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).</li>
<li>Carey, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+analysis+reveals+a+PD-L1-associated+microenvironmental+niche+for+Reed-Sternberg+cells+in+Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).</li>
<li>Ascierto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Mechanisms+of+Resistance+to+Anti-PD-1+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).</li>
<li>O'Rourke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+peripherally+infused+EGFRvIII-directed+CAR+T+cells+mediates+antigen+loss+and+induces+adaptive+resistance+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma.</a> Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984(2017).</li>
<li>Canesin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+the+WNT5A-mimicking+peptide+Foxy-5+effectively+reduces+the+metastatic+spread+of+WNT5A-low+prostate+cancer+cells+in+an+orthotopic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model.</a> PLoS One. 12 (9), e0184418(2017).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

このプロトコルは、RM患者の子宮内膜免疫細胞を定量的に分析するためのデジタル免疫組織化学画像解析プラットフォームを確立しました。ここでは、RM患者の子宮内膜免疫微小環境を評価するために、6つの子宮内膜免疫マーカーが検出されました。
黄体中期の受容性子宮内膜は、着床と妊娠を成功させるための鍵です27,28。したがって、子宮内膜免疫細胞の割合の評価は、子宮内膜受容性を推定する上で重要な役割を果たします。子宮内膜免疫細胞の分析は、従来の病理学的方法による予測的であるため、臨床応用には役立ちません。現在、免疫細胞の割合を測定するための標準化された方法はなく、妊娠におけるこれらの細胞の役割を理解する上で障壁となっています。従来のIHC分析は、選択された視野と手動カウントに基づいています。免疫細胞の正確な組織セグメンテーションと局在化は、手動分析が主観的であり、観察者のバイアスにつながるため、従来のIHCでは評価できません29。<...

不定育症(RM)とは、2回以上連続して妊娠ができない病気で、近年、臨床医から注目されている複雑な疾患です。出産可能年齢の女性におけるRMの発生率は1%〜5%です1。以前の研究の結果は、免疫因子がRM2,3,4,5の病因と密接に関連していることを示しています。母体と胎児の界面における免疫ホメオスタシスの維持は、胚の着床と発育に必要です。子宮内膜免疫細胞は、栄養膜浸潤の促進、螺旋動脈のリモデリング、胎盤の発達への寄与など、この恒常性を維持するためにいくつかの調節的役割を果たします6,7,8,9。
RMの女性における子宮内膜免疫細胞の異常は以前に報告されています。結果は、高密度の子宮ナチュラルキラー細胞(uNK)とRM10,11,12の発生との間に密接な関連があることを示しています。RMの女性の子宮内膜では、生児出産の女性と比較して、マクロファージの数の増加が報告されています13。制御性T細胞(Treg)は、胚に対する母体の免疫寛容に関与しており、RM患者の脱落膜ではそのレベルと機能が低下している14。細胞傷害性T細胞(CTL)と樹状細胞(DC)も妊娠の免疫調節に関与しています15,16。したがって、黄体期中期の局所子宮内膜免疫細胞の包括的な定量分析は、RMの病因をよりよく理解するのに役立ちます。子宮内膜免疫細胞の定量分析のためのいくつかの現在の方法は、複数のマーカーで免疫細胞を正確に標識できるフローサイトメトリーを使用しています17,18。しかし、フローサイトメトリーは新鮮な組織にしか実施できないため、臨床応用は限られています。新鮮な組織を得ることは、大量の過剰腫瘍が利用可能である場合にのみ実行可能ですが、子宮内膜ではまれに発生します。免疫組織化学は、組織の形態をその場でよく観察でき、さまざまな免疫細胞を標識することもできますが、従来の免疫組織化学的手法では免疫細胞の定量分析を行うことができません。
従来の免疫組織化学実験と比較して、子宮内膜内の免疫細胞の定量的免疫組織化学的分析は重要な臨床的意義を持っています。IHC強度スコアリングは、通常、病理学的診断および研究において4段階評価または強弱でランク付けされます19,20,21。しかし、この半定量的手法は主観的であり、非常に不正確であり、観察者内および観察者間の有意な変動性を示している22。考えられる解決策の1つは、デジタル画像解析23,24で貴重な機械学習の応用です。定量的な測定を行うことで、子宮組織内の免疫細胞の浸潤、分布、密度をより正確に評価することができます。この定量的情報は、月経周期中およびさまざまな病理学的状態における免疫細胞集団の動的変化を解明するのに役立ちます。全体として、免疫組織化学を通じて子宮内膜の免疫細胞を定量的に分析する能力は、子宮の免疫微小環境に関する貴重な洞察を提供します。
したがって、プロトコルは、デジタル免疫組織化学画像分析プラットフォームを開発および検証して、 RM患者の黄体中期にuNK細胞、Treg、マクロファージ、DC、細胞傷害性T細胞などの子宮内膜免疫細胞を定量的に分析します。

<table><tbody><tr><td>自動カバースリッパー</td><td>さくらus</td><td>DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2</td><td></td></tr><tr><td>CD163</td><td>GrowGn バイオテクノロジー</td><td>NCL-L-CD163</td><td></td></tr><tr><td>CD1a</td><td>Gene Tech</td><td>GM357129</td><td></td></tr><tr><td>CD56</td><td>Gene Tech</td><td>GT200529</td><td></td></tr><tr><td>CD8</td><td>Novocastra</td><td>NCL-L-CD8-4B11</td><td></td></tr><tr><td>脱水機</td><td>サーモフィッシャー</td><td>エクセルシオール ES</td><td></td></tr><tr><td>デジタルパソロジーと</td><td>インディカラボ</td><td>HALO</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3</td><td>YILIFANG生物学的</td><td>14-477-82</td><td></td></tr><tr><td>IHCステイナー</td><td>ライカ</td><td>BOND III</td><td></td></tr><tr><td>画像分析プラットフォーム</td><td>インディカラボ</td><td>HALO</td><td></td></tr><tr><td>スライドスキャナー</td><td>オリンパスライフサイエンス</td><td>VS200</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫組織化学とデジタル画像解析に基づく子宮内膜免疫細胞の定量的検出のためのプラットフォーム

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

反復流産(RM)患者の子宮内膜免疫微小環境を評価するために、黄体中期の子宮内膜免疫細胞を定量的に分析するためのデジタル免疫組織化学画像解析プラットフォームが開発され、検証されました。すべての子宮内膜サンプルは、月経周期の黄体中期に収集されました。パラフィン包埋子宮内膜組織を厚さ4 μmのスライドに切片化し、CD56+ uNK細胞、Foxp3+ Treg、CD163+ M2マクロファージ、CD1a+ DC、CD8+ T細胞などの子宮内膜免疫細胞を検出するために免疫組織化学(IHC)染色を実施しました。パノラマスライドはデジタルスライドスキャナーでスキャンし、定量分析には市販の画像解析システムを使用しました。子宮内膜免疫細胞の割合は、子宮内膜細胞全体の免疫細胞数を割って算出しました。市販の画像解析システムを用いることで、従来の画像解析では解析が困難または不可能であった子宮内膜免疫細胞の定量的評価を簡便かつ正確に解析することが可能となりました。この方法論は、免疫細胞間の相互作用を含む子宮内膜微小環境、およびさまざまな生殖不全患者の不均一性を定量的に特徴付けるために適用できます。子宮内膜免疫細胞の定量的評価のためのプラットフォームは、RM患者の診断と治療にとって重要な臨床的意義を持つ可能性があります。

子宮内膜免疫細胞を定量的に評価し、人為的な操作ミスによる不安定性を低減するために、免疫組織化学の自動検出とデジタル定量評価システムを用いた子宮内膜免疫細胞のデジタル定量分析プラットフォームを構築しました。不振流産(RM)患者の子宮内膜免疫細胞を着床時に定量的に解析するために、免疫組織化学画像解析プラットフォームを確立しました。すべての子宮内膜組織は、月経周期の黄体中期に収集されました。パラフィン包埋子宮内膜組織を厚さ4 μmのスライドに切片化し、CD56+uNK細胞、Foxp3+Treg、CD163+M2マクロファージ、CD1a+ DC、CD8+ T細胞などの子宮内膜免疫細胞を検出するためにIHC染色を行いました。パノラマスライドをデジタルスライドスキャナーでスキャンし、デジタル画像解析システムで定量分析を行った。子宮内膜免疫細胞の割合を計算するには、免疫細胞の数を子宮内膜細胞の総数で割ります。 (図1および<stron...

ここでは、着床期間中に反復流産した患者の子宮内膜免疫細胞を定量的に分析するために、デジタル免疫組織化学画像解析プラットフォームが開発され、検証されました。

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...

現状では、一定範囲内で解析を安定させることが課題となっています。また、実験の品質管理を維持することも困難です。私たちの研究は、免疫の異常な子宮内膜感受性を持つ患者が生殖不全の原因を見つけるのに役立ちます。子宮内膜における免疫細胞の局所的な割合を安定して繰り返し検出することができます。本研究成果は、着床不全を繰り返す患者における子宮内膜感受性評価の研究の進展を促進する可能性があります。

platform-for-quantitative-detection-endometrial-immune-cells-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み腫瘍組織切片における免疫細胞の可視化、定量、およびマッピングのための簡単でアクセス可能な戦略について述べている。この方法論は、既存のイメージングおよびデジタル解析技術と、イメージングアッセイの多重化能力と多パラメータ分析を拡大することを目的と組み合わせたものです。...

腫瘍微小環境における免疫細胞集団の可視化、定量化、およびマッピング

多重免疫体化学とマルチスペクトルイメージングの進歩にもかかわらず、子宮内膜における主要な免疫細胞の密度とクラスタリングを同時に特徴付けるのは依然として課題です。本論文では、子宮内膜における4種類の免疫細胞の同時局在化のための詳細な多重染色プロトコルとイメージングについて述べている。...

再発流産における4種類の子宮内膜免疫細胞型の多重化蛍光免疫物質化学的染色

ここでは、ホールマウント免疫染色、多光子顕微鏡、および3D可視化および分析を使用した定量的および定性的な分析のために、卵巣全体をイメージングするための最適化されたプロトコルを紹介します。このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイに適用可能な、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応します。...

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

このプロトコルは、遺伝子発現および組織学的分析のためのマウス子宮内膜上皮オルガノイドを確立するための方法論を説明しています。...

マウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイドの確立

このプロトコルは、マルチプレックス免疫組織化学を用いた腫瘍微小環境の免疫細胞特性評価がどのように行われるかを詳細に説明しています。...

腫瘍微小環境の空間免疫細胞ランドスケープのマルチプレックス免疫組織化学的解析

この研究は、高度なマルチプレックス蛍光免疫組織化学染色技術を使用して、移植期間中に子宮ナチュラルキラー細胞サブセットを定量化するための先駆的な方法を提示します。...

移植失敗を繰り返す女性におけるマルチプレックス蛍光免疫組織化学染色を用いた4つの子宮NK細胞サブタイプの測定

記載された比較、定量的プロテオミクスアプローチは、異なる条件下で多タンパク質複合体の組成物への洞察を得ることを目的と遺伝的に異なる菌株を比較することによって実証される。定量分析のためにショ糖密度勾配とは異なる画分の等し​​い体積を質量分析によって混合し、分析する。...

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

NGSシーケンシングのためのgDNA濃縮は、体質的突然変異の研究のための簡単で強力なツールです。この記事では、DNA損傷修復に関与する11個の遺伝子の完全な配列を簡単に解析する手順を紹介します。...

の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント BRCA1 BRCA2、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9

このプロトコルは、組織や腫瘍からECMタンパク質を濃縮し、ECM濃縮調製物を脱グリコシル化してペプチドに消化し、質量分析によってそれらのタンパク質組成を分析する手順を説明しています。...

質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

この論文は、蛍光標識ナノ粒子のエンドサイトーシス後の細胞内遺伝子発現を直接生細胞内で検出することを可能にする新しい技術について説明しています。この方法は、細胞の操作を必要とせず、標的遺伝子または種に関して制限されない。...

蛍光標識ナノ粒子を用いたマウス、ヒトおよびブタ起源のライブ細胞の細胞内遺伝子発現の検出

学ぶ 免疫組織化学とデジタル画像解析を用いた子宮内膜免疫細胞の定量的検出法。CD56陽性細胞などの免疫細胞構成を正確に解析し、反復流産患者の生殖不全原因解明に貢献する新規プラットフォームです。

免疫組織化学とデジタル画像解析に基づく子宮内膜免疫細胞の定量的検出のためのプラットフォーム

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