Name: 低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶ低頻度体細胞突然変異検出法。サンガーシーケンシングと野生型ブロッキングPCRを組み合わせ、血管免疫芽球性リンパ腫において高感度・低コストで突然変異を検出する手法を解説。他の血液疾患への応用可能性も示唆される。

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<meta charset="utf8"></head><body>野生型ブロッキングPCRによる低頻度変異検出の最適化

<ol><li>Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. 
 <a target="_blank" href="https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd">https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd</a> (2019).</li>
<li>Xie, Y., Elaine, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+I+diagnose+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).</li>
<li>Mariko, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).</li>
<li>Daniel, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute+lukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Rita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5th+edition+of+the+World+Health+Organization+Classification+of+Haematolymphoid+Tumours+%3A+Lymphoid+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms.</a> Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).</li>
<li>Hae, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+inactivating+mutation+in+RHOA+GTPase+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).</li>
<li>Lee, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHOA+G17V+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%3AA+potential+biomarker+for+cytological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment.</a> Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).</li>
<li>Mamiko, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).</li>
<li>Palomero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+epigenetic+regulators%2C+RHOA+and+FYN+kinase+in+peripheral+T+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas.</a> Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).</li>
<li>Fujisawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RHOA-VAV1+signaling+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).</li>
<li>Voena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHO+family+GTPases+in+the+biology+of+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">RHO family GTPases in the biology of lymphoma.</a> Cells. 8 (7), 646(2019).</li>
<li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+an+40%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing an 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li>
<li>Athanasios, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Sanger+sequencing%2C+pyrosequencing%2C+and+melting+curve+analysis+for+the+detection+of+KRAS+mutations%3A+diagnostic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications.</a> J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).</li>
<li>Wu, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+enrichment+of+rare+DNA+variants+via+sequence-selective+and+temperature-robust+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification.</a> Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).</li>
<li>John, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Coren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Eliza, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+in+B-cell+lymphoma%3A+technical+advances%2C+clinical+applications%2C+and+perspectives+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research.</a> Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot-spot-specific+probe+%28HSSP%29+for+rapid+and+accurate+detection+of+KRAS+mutations+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer.</a> Biosensors. 12 (8), 597(2022).</li>
<li>Matsubara, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+G17V+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma+and+related+lymphomas+using+quantitative+allele-specific+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR.</a> PLoS One. 9 (10), e109714(2014).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%223730%2F3730xl+DNA+Analyzer%22">3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>自動DNA抽出器</td><td>9001301</td><td>Qiagen</td><td></td></tr><tr><td>DNA核酸検出器</td><td>Q32854</td><td>サーモフィッシャーPCR</td><td></td></tr><tr><td>増幅キット</td><td>P4600</td><td>メルク</td><td></td></tr><tr><td>PCR機器</td><td>C1000 タッチ</td><td>バイオラッド</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK溶液</td><td>D3001-2-A</td><td>ザイモ研究</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK保存緩衝液</td><td>D3001-2-C</td><td>zymo research</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシング増幅酵素キット</td><td>P7670-FIN</td><td>Qiagen</td><td></td></tr></tbody></table>

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングpcr

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

試験サンプルの配列と参照配列を比較して、試験サンプルの変異状態を取得します。BDAベースのWBT-PCR技術は、アップストリームおよびダウンストリームプライマーの増幅間隔で既知のRHOA G17V変異およびその他の低頻度変異を検出できます。 図 1 を参照してください。さらに、 IDH2 と JAK1の2つの遺伝子も、それぞれ 図2 と 図3のこの方法を使用して分析されました。その結果、この方法は低頻度の突然変異の検出に非常に敏感であることが示されています。
<img alt="DNAシーケンシングクロマトグラム;RHOA変異検出の比較を示す従来のPCRとWBT-PCR。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:RHOAのシーケンシング結果。図は上から順に、WBT-PCRで増幅したRHOA G17部位の塩基変異と、野生型RHOA G17に対応する従来のPCR増幅後のシーケンシング結果を示しています。中央の写真は、検出感度が0.5%の場合のWBT-PCRプライマーで増幅した後のc.50G&gt;T変異のシーケンシング結果を示しています。下の写真は、検出感度が0.5%の場合、WBT-PCRプライマーで増幅した後のc.49-50delinsTT変異のシーケンシング結果を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="WBT-PCRと従来のPCRクロマトグラムの比較、c.515G&gt;A変異検出、IDH2遺伝子" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2: IDH2のシーケンシング結果。 上から下へ、WBT-PCRで増幅した IDH2 R172部位の塩基変異と、野生型 IDH2 R172に対応する従来のPCR増幅後のシーケンシング結果を示しています。上の写真は、検出感度が0.5%の場合のWBT-PCRプライマーによる増幅後のc.515G&gt;A変異のシーケンシング結果を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="DNA 配列決定の比較、JAK1 変異分析チャートの WBT-PCR と従来の PCR。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3: JAK1のシーケンシング結果。 上図は、上から順に、WBT-PCRで増幅した JAK1 S703部位の塩基変異と、野生型 JAK1 S703に対応する従来のPCR増幅後のシーケンシング結果を示しています。上の写真は、検出感度が0.5%の場合のWBT-PCRプライマーによる増幅後のc.2108G&gt;T変異のシーケンシング結果を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>入門</td>
			<td colspan="2">プライマー配列</td>
		</tr><tr><td>ローア-VF</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VRの</td>
			<td colspan="2">GCTGAAGACTATGAGCAAGCA</td>
		</tr><tr><td>RHOA-WTBの</td>
			<td colspan="2">AGCAAGCATGTCTTTCCACAGGCAAAA</td>
		</tr><tr><td>シーケンシングプライマー</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr></tbody></table>表1: RHOAの最終的なデザインプライマーリスト。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>IDH2 R172プライマー</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>入門</td>
			<td>プライマー配列</td>
		</tr><tr><td>品番:IDH2-VF</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VRの</td>
			<td>TACCTGGTCGCCATGGGC</td>
		</tr><tr><td>IDH2-WTBの</td>
			<td>GCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT</td>
		</tr><tr><td>シーケンシングプライマー</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>JAK1遺伝子プライマー</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>入門</td>
			<td>プライマー配列</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VFシリーズ</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VRの</td>
			<td>CCATTATGGACATCAGGACATTC</td>
		</tr><tr><td>JAK1-WTBの</td>
			<td>GGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA</td>
		</tr><tr><td>シーケンシングプライマー</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT</td>
		</tr></tbody></table>表2: IDH2 および JAK1の最終的な設計プライマーリスト。

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-sanger-sequencing-for-detection

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

プールされたDNAシーケンシングは、大規模コホートで複雑な表現型に関連付けられている稀な亜種を検出するための迅速かつ費用対効果の高い戦略である。ここでは、スプリンターソフトウェアパッケージを使用して、32のがん関連遺伝子のプールされた、次世代シーケンシングの計算分析を記述します。このメソッドは、スケーラブルで、目的の任意の表現型にも適用可能である。...

SPLINTERを使用してプールされたシーケンスからレアゲノム変異の検出

このビデオでは、体細胞変異を検出する野生型ブロッキングポリメラーゼ連鎖反応(WTB-PCR)について説明しています。PCRベースの手法では、相補的な野生型対立遺伝子に結合して伸長をブロックするオリゴヌクレオチドであるロック核酸(LNA)を使用します。ブロッキングにより、サンプル中の野生型バリアントに対する低レベルの変異対立遺伝子の増幅が選択的になります。...

低頻度の体細胞変異を検出するための野生型ブロッキングPCR

我々は、超並列「次世代」配列決定による臨床腫瘍標本における主要癌関連変異の検出のためのバーコードDNAライブラリーおよびその後のハイブリダイゼーションに基づくエクソンキャプチャの製造を記載し​​ている。標的エクソン配列決定は、低周波の変異を検出するための高感度を得、高スループット、低コスト、かつ深い配列カバーの利点を提供しています。...

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

この原稿は、2つの次世代シーケンシングパネルの臨床プロトコルについて説明しています。1つのパネルは血液悪性腫瘍を調査し、もう1つのパネルは固形腫瘍で一般的に変異した遺伝子を対象としています。ヒト悪性腫瘍におけるドライバー変異の分子分類は、貴重な予後および予測情報を提供します。...

固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング

腫瘍学検体の標的次世代シーケンシングのための統合システムが説明されています。このクロスプラットフォームシステムは、低品質および少量の腫瘍生検に最適化されており、低DNAインプットに対応し、十分に特徴付けられた多変量コントロールを含み、定量的な分析前品質管理手段によって通知される新しいバリアントコーラーを備えています。...

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

野生型ブロッキングPCRとそれに続く直接シーケンシングは、さまざまなサンプルタイプにおける低頻度の体細胞突然変異を高感度に検出する方法を提供します。...

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々...

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。...

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

この記事では、所定の患者から異なる検体間のクローンおよびサブクローンの変化を同定する方法について説明する。ここで説明する実験は特定の腫瘍タイプに焦点を当てていますが、このアプローチは他の固形腫瘍に広く適用可能です。...

目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析

学ぶ低頻度体細胞突然変異検出法。サンガーシーケンシングと野生型ブロッキングPCRを組み合わせ、血管免疫芽球性リンパ腫において高感度・低コストで突然変異を検出する手法を解説。他の血液疾患への応用可能性も示唆される。

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

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