Name: マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析のための硬質パーム種子の調製(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶ硬質パーム種子のMALDI-IMS分析用試料調製法。低水分含量を維持し、アナライトの分布と豊度を保持することで、高品質なシグナルと空間分解能を得る手法を解説。植物バイオマスの成分局在解析に有用。

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この研究は、セラピリェイラ研究所(Serra-1708-15009)とリオデジャネイロ州におけるカルロス・シャーガス・フィーリョ研究支援財団(FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021)から資金提供を受けました。セラピリヘイラ研究所と国家科学技術開発評議会(CNPq)は、フェリペ・ロペス・ブルム博士とガブリエル・R・マーティンス博士(制度的能力開発プログラム/ INT/MCTI)に奨学金を授与しました。高等教育要員の改善のための調整(CAPES)は、Davi M.M.C.da Silva氏に修士奨学金を授与したことが認められています。Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) は、MALDI-IMS 分析で提供されたサービスで認められており、MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ grant Nº 442604/2019 の資金提供を受けた Alan Menezes do Nascimento 氏と Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT) は、元素組成分析に感謝しています。

Euterpe precatoria の種子は、Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia(ブラジル、マナウス)から寄贈され、 Euterpe edulis の種子は、産業パルプ化プロセスの後、Silo - Arte e Latitude Rural(Resende、ブラジル)から寄贈されました。種子は密封されたプラスチックの箱に室温で維持した。
1. マトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージング質量分析法(MALDI-IMS)
<ol><li>種子セクショニングプロトコル<ol><li>各種から3つの種子を脱イオン水に24時間置きます。</li>
		<li>翌日、クライオスタット( 材料表参照)の電源を入れ、-20°Cにします。</li>
		<li>湿った種を水から取り出します。ミクロトームブレードを使用して種子を半分に切ります( 材料表を参照)。</li>
		<li>新鮮で温かい(10%)ゼラチン溶液を調製します( 材料表を参照)。</li>
		<li>種の半分を型に置き、作りたてのゼラチンを入れます。クライオスタットに移す前に、-80°Cで2時間凍結します。</li>
		<li>最適な切断温度コンパウンド(OCT、 材料表を参照)を使用して、埋め込まれたシードをクライオスタット支持体に付着させ、OCT硬化のためにクライオスタット内に10分間放置します。</li>
		<li>酸化インジウムスズでコーティングされたスライドガラス(ITOスライド、材料表参照)に銅両面粘着テープ(材料表参照)を追加します。</li>
		<li>各種から20μm厚の切片を作製し、ITOスライドガラスに貼付した銅製両面粘着テープ上に貼付する。 注:この時点で、スライドに集められたスライスは-80°Cの冷凍庫に保存できます。または、マトリックス堆積に進みます。スライドはホルダースライドボックスに入れ、ガス状のN2で洗い流し、サンプルの酸化を防ぐためにフィルムで密封する必要があります( 材料表を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>マトリックス堆積<ol><li>スライスを含むスライドを真空デシケーターに入れ、室温に達するまで置きます。</li>
		<li>各スライドの隅に修正ペンを使用してティーチングマークを作成します。テーブルスキャナーを使用してスライドをスキャンします。解像度を 4,800 ppi に設定します。</li>
		<li>分析天びんを使用して、30 mgの2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB、 材料表を参照)を秤量し、1:1メタノール:0.1%トリフルオロ酢酸(TFA; 資料表)DHBを溶解する溶液。</li>
		<li>1 mLのガラスシリンジ( 材料表を参照)にDHB溶液を充填し、流速0.8 mL/hに設定したシリンジポンプ( 材料表を参照)に入れます。</li>
		<li>PEEKチューブを使用して、シリンジを大気圧化学イオン化(APCI)針に接続します( 材料表を参照)。</li>
		<li>N2 を APCI ニードルに接続し、 12.5 psi の流量に設定します。</li>
		<li>APCIニードルをxyモーションプラットフォームに取り付けます( 材料表を参照)。APCI針の先端がスライドから 4cm 上にあることを確認します。</li>
		<li>描画ソフトウェア( 材料表 と 補足図1を参照)を使用して、xyモーションプラットフォームをテンプレートに従うように設定します。テンプレートは、1mm間隔の水平平行線で構成されています。</li>
		<li>マトリクス堆積を実現するには、xyモーションプラットフォームがテンプレートを20回繰り返すのを待ちます。 注意: マトリックス堆積は、化学ドラフトで実行する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>画像取得<ol><li>スライドを質量分析計に置きます( 材料表を参照)。</li>
		<li>修正ペンマークを使用して、参照先のソフトウェアにティーチングポイントを設定します( 材料表を参照)。</li>
		<li>レーザー出力(60%)、レーザーフォーカス(中)、ショット数(100)、極性をソフトウェアで設定します( 材料表を参照)。 99%のデータ削減係数 を設定し、事後データキャリブレーション用にFIDファイルを保存します。メソッドを保存します。</li>
		<li>質量分析計ソフトウェアの add polygon measurement region ツールを使用して、分析する領域を区切ります。前のステップで保存した方法を示す測定領域パラメータを編集し、 ラスター幅を100μmにします (補足図S4A)。</li>
		<li>画像取得を開始します。</li>
	</ol></li>
	<li>データ解析<ol><li>マトリックスクラスターと既知の汚染物質を使用して、参照ソフトウェア( 材料表を参照)の キャリブラント タブ(補足図S4B)で質量リストを作成します。<ol><li>参照されているソフトウェアでキャリブレーションするデータを開きます( 材料表を参照)。 キャリブレーション タブで、作成した質量リストを開き、右クリックしてダイアログボックスを開き、 ロック質量の設定 オプションを選択します(補足図S4C)。</li>
			<li>0.5 ガウス幅拡大と 3.5 線幅拡大のガウス ウィンドウ モードを選択します。オンラインキャリブレーションはオフのままにします。モード(単一)、しきい値(1,000)、質量許容差(5 ppm)を選択します。プロセスでデータをキャリブレーションし、2Dデータツールを保存します(補足図S4C)。</li>
		</ol></li>
		<li>キャリブレーション後、データをSCiLS labまたはその他の互換性のあるソフトウェアにエクスポートし、目的の m/z 値のしきい値を設定します(選択範囲:150〜2,500)。 メモ: ファイルサイズやコンピュータの特性によっては、この処理に時間がかかる場合があります。</li>
		<li>総イオン数(TIC)または二乗平均平方根(RMS)から正規化方法を選択します。 注:この分析では、TICを選択しました。</li>
		<li>マッピングする分析対象物がわかっている場合は、各分析対象物の各 m/z 値をプロットし、生成された画像とスペクトル平均プロットを保存します。 注:この研究では、ヘキソースオリゴマーの m/z 値は、カリウム付加物を考慮して選択されました。</li>
	</ol></li>
</ol>2. エネルギー分散型分光法(EDS)
<ol><li>種子セクショニングプロトコル<ol><li>セクショニングソーマシンで薄いシードスライスを取得します( 材料表を参照)。</li>
		<li>500 RPMの切断速度、100 Nの負荷チャージ、および15 HCダイヤモンドウェーハブレード(材料表を参照)でシードを切断します。 注意: ゴニオメーターに取り付けられた精密バイスのホールドに必要な接着のために、シードからの繊維の手動除去を処理します。使用前にブレードを清掃し、種子の一部を切断して、分析中に望ましくない鉱物が添加されないようにします。</li>
		<li>圧縮空気でサンプルを除去し、切断からすべての粒子の残留物を取り除きます( 材料表を参照)。</li>
		<li>支持体のカーボン両面導電性テープ( 材料表を参照)でシードセクションを固定します。</li>
	</ol></li>
	<li>解析条件<ol><li>EDSと組み合わせた走査型電子顕微鏡(SEM)の真空チャンバー内にシードセクションを備えたサポートを取り付けます( 材料表を参照)。</li>
		<li>加速度20kV、スポットサイズ4.0の模型顕微鏡で、二次電子信号(材料表参照)、反射電子(極片に固定された固体検出器)、およびこれら2種類の信号の混合(MIX)を使用して電子顕微鏡写真を取得し、人工的に着色された画像を構築します。</li>
		<li>EDSスペクトルの取得には、前述のSEMと組み合わせた分光計( 材料表を参照)を使用します。EDSからの画像取得の条件構成はSEMと同じです。</li>
		<li>傾斜角度、仰角、方位角をそれぞれ 0.0、35.0、0.0 に設定します。</li>
	</ol></li>
	<li>データ・アクイジション<ol><li>シード部を91倍の倍率で3つの異なる領域に設定してデータを取得します。</li>
		<li>アクイジション終了時またはアクイジション中のスペクトラムのピークを特定します。 Confirm Elementsステップ ボタンを使用して、ピークを手動で同定します。</li>
		<li>選択した領域ごとに取得時間を60秒に設定します。処理時間を 5 に設定します。パラメータは、1 から 6 の処理時間で使用できます。 注:要素の兆候は一定で加算されますが、ノイズはランダムで有害です。処理時間が長いほど、ノイズは低くなります。</li>
		<li>有意な定量的結果を表示するためのデフォルト設定は、2シグマ(標準偏差)を超えています。2 つのシグマを 0 に設定して、望ましくない結果を減らします。</li>
		<li>要素の各強度を正規化します。これは、ソフトウェアで標準化されたパラメータです( 材料表を参照)。</li>
		<li>データを分析するには、DOCファイルにエクスポートします。</li>
	</ol></li>
	<li>データ解析<ol><li>定量的な元素分析のためにピーク強度を正確に測定します。</li>
		<li>ピークが重なり合っている場合は、ピーク分離を改善するためにデコンボリューションが必要です。必要に応じて、ノイズの多い背景を減算します。</li>
		<li>オーバーラップがない場合は、ゲインを上げて信号を増幅し、スペクトル品質を向上させます。</li>
	</ol></li>
</ol>

MALDI-IMS分析用のハードパームシードの準備に関する詳細ガイド

<ol><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%3A+a+review+of+emerging+advancements+and+future+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li>
<li>Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeeren%2C+RMA+%22Encyclopedia+of+Spectroscopy+and+Spectrometry%22">Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry</a>. , Elsevier Ltd. (2017).</li>
<li>Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+an+emerging+technology+in+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).</li>
<li>Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+mass+spectrometry+imaging+%28MALDI-MSI%29+for+in+Situ+analysis+of+endogenous+molecules+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants.</a> Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).</li>
<li>Bhandari, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+mass+spectrometry+imaging+of+plant+tissues%3A+Towards+a+plant+metabolite+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas.</a> Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).</li>
<li>Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+for+plant+biology%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging for plant biology: a review.</a> Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).</li>
<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+mass+spectrometry+imaging+of+plant+tissues%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 60(2016).</li>
<li>Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+and+effective+sample+preparation+protocol+of+MALDI-TOF-MSI+for+lipids+imaging+analysis+in+hard+and+dry+cereals%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals.</a> Food Chemistry. 398, 133911(2023).</li>
<li>Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+thin+sections+of+a%C3%A7a%C3%AD+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+seed+with+elevated+potassium+content+for+molecular+mapping+by+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474(2023).</li>
<li>Martins, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+characterization%2C+antioxidant+and+antimicrobial+activities+of+a%C3%A7a%C3%AD+seed+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+extracts+containing+A-+and+B-type+procyanidins%5BTitle%5D)+AND+%22LWT%22%5BJournal%5D)">Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins.</a> LWT. 132, 109830(2020).</li>
<li>Martins, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+profile+and+antioxidant+properties+in+extracts+of+developing+a%C3%A7a%C3%AD+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).</li>
<li>Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A%C3%A7a%C3%AD+waste+valorization+via+mannose+and+polyphenols+production%3A+techno-economic+and+environmental+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Conversion+and+Biorefinery%22%5BJournal%5D)">Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment.</a> Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).</li>
<li>Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jussa%C3%AD+%28Euterpe+edulis%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Jussaí (Euterpe edulis): a review.</a> Food Science and Technology. 42, (2022).</li>
<li>Yamaguchi, K. K. dL., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amazon+acai%3A+chemistry+and+biological+activities%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review.</a> Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).</li>
<li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+adhesive+tape+attached+to+the+reverse+side+of+a+non-conductive+glass+slide+to+achieve+protein+MALDI-imaging+in+FFPE-tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections.</a> Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).</li>
<li>Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+salt+doping+and+matrix+sublimation+for+high+spatial+resolution+MALDI+imaging+mass+spectrometry+of+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids.</a> Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).</li>
<li>Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morfo-anatomia+da+semente+de+Euterpe+precatoria+Mart+%28Palmae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Sementes%22%5BJournal%5D)">Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae).</a> Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).</li>
<li>Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+structure+and+histochemistry+in+the+palm+Euterpe+edulis%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Journal+of+the+Linnean+Society%22%5BJournal%5D)">Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).</li>
<li>Alves, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Provenient+residues+from+industrial+processing+of+a%C3%A7a%C3%AD+berries+%28Euterpe+precatoria+Mart%29%3A+nutritional+and+antinutritional+contents%2C+phenolic+profile%2C+and+pigments%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments.</a> Food Science and Technology. 42, (2022).</li>
<li>Inada, K. O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+the+chemical+composition+and+occurring+antioxidants+in+jabuticaba+%28Myrciaria+jaboticaba%29+and+jussara+%28Euterpe+edulis%29+fruits+and+their+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+FunctionalFoods%22%5BJournal%5D)">Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions.</a> Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).</li>
<li>Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentration+and+yield+production+of+mannose+from+a%C3%A7a%C3%AD+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+seeds+via+mannanase-catalyzed+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10939(2019).</li>
</ol>

著者は利益相反がないことを宣言します。

植物は、特定の生化学的機能のために特殊な組織で構成されています。したがって、MALDI-IMSのサンプル調製プロトコルは、サンプルが高品質のシグナルと空間分解能のために元の分析種の分布と存在量を維持する必要があるため、特定の物理化学的特性を持つさまざまな植物組織に従って設計する必要があります8。
MALDI-IMS分析の前に、サンプルを適切に収集して保存することが主な考慮事項です。しかし、植物では、分析した組織によってサンプル調製が異なることがよくあります。例えば、植物組織における細胞壁の木質化および含水量は、試料7の形態の正確な表現を維持するために、切片化中に課題を提起する可能性がある。
MALDI-IMS解析は、組織調製と切片作成、マトリックスコーティング、およびデータ解析からなるワークフローに分けることができます。しかし、イメージング結果の品質と信憑性は、重要なステップであるサンプル前処理方法に直接影響されます。この研究で使用...

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析(MALDI-IMS)は、2次元の生体分子の割り当てを可能にし、イオン化可能な化合物のノンターゲット調査を提供し、特に生体試料におけるそれらの空間分布を決定する強力な方法です1,2。20年間にわたり、この技術により、脂質、ペプチド、炭水化物、タンパク質、その他の代謝物、および治療薬などの合成分子の同時検出と同定が可能になりました3,4。MALDI-IMSは、生体試料の抽出、精製、分離、標識、染色剤を介さずに、組織試料表面の化学分析を容易にします。しかし、分析を成功させるためには、この手法の極めて重要なステップは、特に環境順応のために広範囲にわたる複雑な器官に特殊化され、修飾された植物組織におけるサンプル調製です5。
植物組織の固有の物理化学的特性のため、MALDI-IMS分析の要件に適合し、切片作成中に組織の元の形状を維持するための適応プロトコルが必要です6,7。種子などの型破りなサンプルの場合、これらの組織は細胞壁が硬く、水分含有量が少ないため、切片の断片化を引き起こしやすく、化合物の非局在化を引き起こす可能性があるため、確立されたプロトコル8は適用できません9。
私たちの研究グループは、レンタル可能なアサイーパルプ13 の生産中に大量に生成される副産物であるアサイー (Euterpe oleracea Mart.) 種子 10,11,12 の分子マッピングと MALDI-IMS 分析に適合したプロトコルに関する実験データを公開しました。アイデアは、アサイー種子のさまざまな代謝産物の in situ マッピングのプロトコルを開発し、現在商業的に調査されていないこの農業廃棄物の可能な用途を提案することでした。しかし、アサイーシードの抵抗性により、MALDI-IMS 分析から適切なサンプル切片を得るためのプロトコルをオーダーメイドする必要がありました。
これに関連して、経済的に重要なアサイーパルプは、同様の感覚特性を持つエウテルペ属のヤシの木からの他の果物の商業化の増加を動機付けました。アサイー14,15 の代替として工業規模で生産されている 2 つの新興ヤシの木の果実は、アマゾンの乾燥地で育つ E. precatoria (アサイー ド アマゾナスとして知られている) と、大西洋岸森林から典型的な E. edulis (ジュサラとして知られている) です。それにもかかわらず、アサイー・ド・アマゾナスとジュサラの消費は、役に立たず、それらの詳細な化学組成に関してこれまで研究されていなかった耐性のある食べられない種子の同じ蓄積につながります。
したがって、MALDI-IMSによる分子マッピングのために E.precatoria および E.edulis 種子を分析するために、以前に考案されたプロトコルをほとんど適応せずに使用できることをここで実証し、これらのリソースの組成の分析に使用できる強力なツールであり、それらの潜在的なバイオテクノロジーの使用を決定するのに役立つことを証明します。さらに、ここでの詳細な説明は、MALDI-IMS分析用の耐性材料を調製する際に同様の困難を抱えている他の人に役立ちます。

<table><tbody><tr><td>1 mL ガスタイト シリンジ モデル 1001 TLL、PTFE ルアー ロック</td><td>ハミルトン カンパニー</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>2,5-ジヒドロキシ安息香酸</td><td>Sigma Aldrich Co, MO, USA</td><td>149357</td><td></td></tr><tr><td>APCI needle</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>602193</td><td></td></tr><tr><td>AxiDraw V3 xy motion platform</td><td>Evil Mad Scientist, CA, USA</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>カーボン両面導電性テープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンパスデータ解析ソフトウェア&nbsp;</td><td></td><td></td><td>質量リストの作成</td></tr><tr><td>圧縮空気</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>銅両面粘着テープ</td><td>3M, USA</td><td>1182-3/4"X18YD</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat CM 1860 UV</td><td>Leica&nbsp;Biosystems, Nussloch, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Wafering Blade 15 HC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Everhart-Thornley detector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td></td><td>画像取得</td></tr><tr><td>FTMS Processing</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td></td><td>データキャリブレーション</td></tr><tr><td>ウシの皮膚からゼラチン</td><td>Sigma Aldrich Co., MO, USA</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>High Profile Microtome Blades Leica 818</td><td>Leica&nbsp;Biosystems, Nussloch, Germany</td><td>0358 38926</td><td></td></tr><tr><td>酸化インジウム錫コーティングガラススライド</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>8237001</td><td></td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IsoMet 1000 precision cutter</td><td>Buehler, Illinois, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9093-03</td><td></td></tr><tr><td>ミリQ</td>ウォーター18.2M<td></td><td></td><td>&オメガ;。cm</td></tr><tr><td>オイル真空ポンプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>最適な切断温度 コンパウンド</td><td>Fisher HealthCare, Texas, USA</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" Sealing Film</td><td>Amcor</td><td>HS234526B</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 450 FEG</td><td>FEI Co, Hillsboro, OR, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software&nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software INCA Suite 4.14 V</td><td>Oxford Instruments, Ableton, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solarix 7T</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>kdScientific, MA, USA</td><td>78-9100K</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic</td> acid <td>Sigma Aldrich Co, MO, USA</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>X-Max spectrometer</td><td>Oxford Instruments、Ableton、イギリス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析のための硬質パーム種子の調製(英語)

Preparation of Hard Palm Seeds for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Imaging Mass Spectrometry Analysis

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析(MALDI-IMS)は、天然環境で化合物を同定するために適用されます。現在、MALDI-IMSは臨床解析で頻繁に使用されています。しかし、この手法を応用して、植物組織における化合物の生理学的情報を理解するための優れた展望が存在します。しかし、MALDI-IMSでは、適切なデータ取得と分析を成功させるために薄片(12-20 μm)を必要とするため、植物材料からの特定のサンプルの調製が困難な場合があります。この意味で、私たちは以前、 Euterpe oleracea (アサイーパーム)の硬い種子の薄切片を得るためのサンプル調製プロトコルを開発し、MALDI-IMSによる分子マッピングを可能にしました。
ここでは、開発されたプロトコルが、同じ属の他の種子を調製するのに適していることを示します。簡単に言うと、このプロトコルは、種子を脱イオン水に24時間浸し、サンプルをゼラチンで埋め込み、順応クライオスタットで切片化することに基づいていました。次に、マトリックス堆積のために、1:1(v/v)2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)と0.1%トリフルオロ酢酸(30 mg/mL)のメタノール溶液を使用して、エレクトロスプレーイオン化(ESI)ニードルスプレーにxyモーションプラットフォームを結合しました。 E. precatoria と E. edulis の 種子データは、ソフトウェアを使用して処理され、代謝物パターンがマッピングされました。
ヘキソースオリゴマーは、これらの種子に大量のマンナン(ヘキソースマンノースのポリマー)が含まれていることが知られているため、これらのサンプルのプロトコルの妥当性を証明するために、サンプルスライス内にマッピングされました。その結果、(Δ=162Da)の[M+K]+ 付加物で表されるヘキソースオリゴマーのピークが同定された。したがって、 以前に E. oleracea 種子用に開発されたサンプル前処理プロトコルにより、他の 2 つの硬いヤシ種子の MALDI-IMS 分析も可能になりました。要するに、この方法は、植物材料の形態解剖学と生理学、特に耐切創性サンプルの研究のための貴重なツールを構成する可能性があります。

考案されたプロトコルにより、E. precatoria および E. edulis 種子の MALDI-IMS 解析が可能になりました。その結果、部分的な構造解明として、糖質の分子量と重合度(DP)を確認することができました。MALDI-IMS分析(図1および図2)で得られた分子情報では、マトリックスに塩を添加することなく、ヘキソースオリゴマー(Δ = 162 Da)の[M+K]+付加物を表すピークが示されました。ヘキソース二量体(m/z 381)、三量体(m/z 543)、四量体(m/z 705)、五量体(m/z 867)、六量体(m/z 1029)、および最大14単位のオリゴマー(m/z 2325)が両方の種子組織で同定されました。両方のサンプルの箱ひげ図(図 3</stron...

このプロトコールは、MALDI-IMS分析用の水分含有量の少ない硬いシードサンプル切片の調製、分析種の元の分布と存在量の維持、高品質のシグナルと空間分解能の提供に関する詳細なガイダンスを説明することを目的としています。

Matrix-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) is applied to identify compounds in their native environments. ...

私たちの研究は、熱帯の生物多様性から植物バイオマスの価値を高めることに焦点を当てています。そのためには、それらの材料をうまく特徴付けて、それらに最高の価値を与え、最適な目的地を提案できるようにすることが非常に重要です。そのため、この研究では、生体組織の分子特異的イメージングが可能な非常に正確な方法であるため、特性評価技術としてMALDIイメージング質量分析を採用しています。この結果から、この植物バイオマスの主成分とその局在性を概観することができ、その材料からの新製品やプロセスの探索の指針となります。しかし、非常に優れたMALDI画像質量分析を行うためには、優れたサンプル前処理方法を持つことが非常に重要であり、この研究ではまさにそれについて説明します。技術の進歩により、イメージング質量分析には多くの課題が生じています。特に植物組織は、その特殊な器官のために複雑な課題を提起します。この技術、つまりサンプル前処理では、サンプル前処理が不十分な場合、シグナルが検出されなかったり、アーチファクトが発生したりして、不正確な結果につながります。これらのプロトコルにより、腸に耐性のあるヤシの種子の薄切りを調製することができ、生きた種子組織内の分子マッピングの概念実証として機能します。したがって、この手法は、これらの種子に存在するオリゴ糖に関する貴重な洞察を提供します。ですから、この手法が同じような障害を抱える研究者のお役に立てば幸いです。この技術は、他の硬い種子や、ヒレスライスにカットすることが困難な他の生物学的材料の研究に役立ちます。例えば、このプロトコルは、1つが堅い種子を研究している場合、種子の開発と発芽の研究に関するツールになることができます。

preparation-hard-palm-seeds-for-matrix-assisted-laser

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

精密質量測定は、タンパク質の研究における重要なステップである。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法（MS）は、そのような決定のために使用することができ、その主要な利点は、塩、界面活性剤および汚染に対する耐性である。ここでは、MALDI-MSによって100kDaのより大きなタンパク質の分析のためにアクセス可能なアプローチを示している。...

フライトのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（MALDI-TOF）100kDaのより大きなインタクトタンパク質の質量分析

ジスラノール（DT、1,8  - ジヒドロキシ-9,10  - ジヒドロアントラセン-9  - オン）は、以前に小分子の組織イメージングのためのMALDIマトリックスとして報告されている上に、内因性脂質​​のMALDIイメージングのためのDTの使用のためのプロトコル超高分解能四重極-FTICR機器上の正イオンMALDI-MSによる組織切片の表面は、ここで提供される。...

変換にマトリックス支援レーザー脱離/イオンイメージングのためのマトリックスとしてジスラノールはイオンサイクロトロン共鳴質量分析計をフーリエ

不死化された癌細胞株は、3次元細胞培養物、生物学的研究のための貴重なモデルとして成長させることができる。このプロトコルは、サンプル調製プラットフォームの改善を含む、三次元細胞培養物の質量分析イメージングを記述する。このプロトコルの目的は、質量分析イメージング解析のために3次元細胞培養物を調製するためにユーザーに指示することである。...

3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略

大気圧で動作する質量分析イメージング(MSI)光源は、中赤外レーザー脱離とエレクトロスプレーポストイオン化を組み合わせることによって開発されました。外因性氷マトリックスは、組織関連物質の共鳴脱着を促進するためのエネルギー吸収マトリックスとして使用されました。この原稿は、全身新生児マウスのIR-MALDESI MSIを実施するための段階的なプロトコルを提供します。...

赤外線マトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化することにより、全身質量分析イメージング（IR-MALDESI）

このプロトコルでは、ホルマリン固定組織イメージング質量分析向けの昇華ベース準備の再現性と信頼性の高い方法について説明します。...

ペプチド ベースのマトリックスのためにサンプルを固定ホルマリンの最適な準備支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング ワークフロー

合成高分子の質量分析法 (MALDI-TOF MS)...

マトリクスによる合成高分子のキャラクタリゼーション支援レーザー脱離イオン化時間 (MALDI Tof) 質量分析装置

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化に基づくイメージング質量分析法 (MALDI 分子研) 分子イメージングは、生体試料中の複数検体の同時マッピングをことができます。ここでは、アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー サンプル MALDI IMS を使用しての脳組織のアミロイド β タンパク質の可視化と検出のためのプロトコルを提案する.

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化

サンプル準備プロセス中に改革の結晶構造により MALDI...

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法における炭水化物イオン信号を強化する効率的なサンプル調製法

このプロトコルの目的は、生物学的サンプル中の代謝および分子検出を最大化するためにMALDI MSIを使用した実験を計画する際のサンプル調製に関する詳細なガイダンスを提供することです。...

MALDI質量分析イメージングを用いた代謝プロファイリングのサンプル調製

このプロトコルの目的は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析イメージングを使用して、 ショウジョウバエ 脳などの小組織における脂質および代謝産物分析のための適切なサンプル調製に関する詳細なガイダンスを提供することです。...

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析イメージングを用いた ショウジョウバエ 脳における迅速な脂質分析のためのサンプル調製

学ぶ硬質パーム種子のMALDI-IMS分析用試料調製法。低水分含量を維持し、アナライトの分布と豊度を保持することで、高品質なシグナルと空間分解能を得る手法を解説。植物バイオマスの成分局在解析に有用。

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析のための硬質パーム種子の調製(英語)

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