Name: 中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 学ぶSARS-CoV-2偽型ウイルス製造法と中和アッセイによるワクチン接種後の抗体評価。BSL-2対応の安全な分子ツールでウイルス・宿主相互作用を解析し、免疫維持メカニズムの理解に貢献します。

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私たちは、医療従事者のボランティアの貢献に感謝します。このプロジェクトは、イタリアのMURにあるDepartment of Excellence 2023/2027の支援を受けました。ARとDZはPRIN2022(EUの資金援助;ネクストジェネレーションEU)

現在のプロトコルは、ヴェローナ大学の倫理委員会(承認プロトコル番号1538)によって承認され、それに従っています。インフォームドコンセントは、研究に参加している被験者から得られました。全血サンプルは、抗SARS-CoV-2ワクチンの接種過程にあった医療従事者(HCW)ボランティアから採取されました。これらのサンプルは、その後の血清15の単離のために抗凝固剤を含むプラスチックチューブに収集されました。
以下のすべてのプロセスは、クラス2の生物学的フードで実行し、無菌条件下で作業する必要があります。ウイルスの取り扱いは慎重に行う必要があり、すべての廃棄物は希釈された漂白剤溶液で中和する必要があります。プロトコルの概要を 図 1 に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig01v2.jpg"> 図1:中和アッセイのグラフ表示。 (A)PV生産、(B)PV滴定、および(C)中和アッセイ。すべての手順は、クラス2の生物学的フード内で無菌条件下で行われます。滴定ステップ(B)は、中和アッセイ(C)で使用する前にPVの感染レベルを標準化するために実行する必要があります。この図は BioRender で作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
1. SARS-CoV-2 PVの生産と感染力試験
<ol><li>5 x 105 HEK293T細胞を完全なダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、高グルコース、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を6ウェルプレート(6WP)に播種し、使用するトランスフェクション試薬に適合する適切な細胞密度に到達します。ポリエチレンイミン(PEI)を用いてトランスフェクションを行う場合(メーカーの指示に従って試薬を調製してください)、トランスフェクション当日に細胞が40〜60%の密度に達するようにします(ステップ1.3)。細胞を加湿したインキュベーターで37°C、5%CO2で保管します。</li>
	<li> </li><li><ol><li></li><li><li><li></ol></li><li></li><li></li><li><li> </li></ol><ol><li><li></li><li><li> </li><li></li><li></li><li> </li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig03large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li><li></ol><ol><li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol>

疑似型ウイルスによるSARS-CoV-2に対する血清中和の評価

<ol><li>Ozaki, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+technology+transfer+of+a+GCLP-compliant+HIV-1+neutralizing+antibody+assay+for+human+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials.</a> Plos One. 7 (1), e30963(2012).</li>
<li>Pouget, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+liposomes+to+study+the+effect+of+Mycobacterium+tuberculosis+lipids+on+HIV-1+cis-+and+trans-infections%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945(2021).</li>
<li>McKay, L. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HCV+envelope+glycoprotein+down-modulates+NF-%CE%BAB+signalling+and+associates+with+stimulation+of+the+host+endoplasmic+reticulum+stress+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831695(2022).</li>
<li>Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+pseudovirus+system+in+the+development+of+vaccine%2C+antiviral-drugs%2C+and+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies.</a> Microbiological Research. 258, 126993(2022).</li>
<li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28, e1963(2018).</li>
<li>D'Apice, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+neutralizing+activity+against+SARS-CoV-2+Wuhan-Hu-1+strain+and+variants+of+concern%3A+Performance+evaluation+of+a+pseudovirus-based+neutralization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay.</a> Frontiers in Immunology. 13, 981693(2022).</li>
<li>Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+reporter-expressing+mononegaviruses%3A+current+challenges+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives.</a> Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -L., Verhoeyen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+pseudotypes%3A+Precious+tools+to+improve+gene+modification+of+hematopoietic+cells+for+research+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy.</a> Viruses. 12, 1016(2020).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fourth+generation+lentiviral+Vector%3A+Simplifying+genomic+gymnastics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).</li>
<li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+pseudovirus-luciferase+assay+for+rapid+and+quantitative+detection+of+neutralizing+antibodies+against+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71.</a> Plos One. 8 (6), e64116(2013).</li>
<li>Ferrara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+lentiviral+vectors+pseudotyped+with+Influenza+B+hemagglutinins%3A+application+in+vaccine+immunogenicity%2C+mAb+potency%2C+and+sero-surveillance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies.</a> Frontiers in Immunology. 12, 661379(2021).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+pseudovirus+entry+assay+to+identify+potential+viral+entry+inhibitors+and+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.</a> Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).</li>
<li>Dalle Carbonare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serology+study+after+BTN162b2+vaccination+in+participants+previously+infected+with+SARS-CoV-2+in+two+different+waves+versus+na%C3%AFve%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve.</a> Communications Medicine. 1 (1), 38(2021).</li>
<li>Di Genova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+titration%2C+neutralisation%2C+storage+and+lyophilisation+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+%28SARS-CoV-2%29+lentiviral+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes.</a> Bio-protocol. 11 (21), e4236(2021).</li>
<li>Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+against+SARS-CoV-2+variants%3A+The+role+of+neutralization+assays%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+a+sensitive+pseudovirus-based+assay+for+HIV-1+neutralizing+antibodies+detection+using+A3R5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).</li>
<li>Gauger, P. C., Vincent, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+virus+neutralization+assay+for+detection+and+quantitation+of+serum+neutralizing+antibodies+to+influenza+A+virus+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).</li>
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<li>Siracusano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+decay+of+antibody+response+and+VOC+sensitivity+in+na%C3%AFve+and+previously+infected+subjects+at+15+weeks+following+vaccination+with+BNT162b2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22(2022).</li>
<li>Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+vaccination+elicits+unconventional+IgM+specific+responses+in+na%C3%AFve+and+previously+COVID-19-infected+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals.</a> eBioMedicine. 77, (2022).</li>
<li>Piubelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subjects+who+developed+SARS-CoV-2+specific+IgM+after+vaccination+show+a+longer+humoral+immunity+and+a+lower+frequency+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection.</a> eBioMedicine. 89, 104471(2023).</li>
<li>Zhang, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+different+human+cell+types+and+inhibitory+effects+of+recombinant+spike+protein+and+entry-related+cellular+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors.</a> Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437(2023).</li>
<li>da Costa, K. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+%28N1-N9%29+and+Influenza+B+%28B%2FVictoria+and+B%2FYamagata%29+neuraminidase+pseudotypes+as+tools+for+pandemic+preparedness+and+improved+influenza+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design.</a> Vaccines. 10 (9), 1520(2022).</li>
<li>Condor Capcha, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+for+viral+entry+and+neutralization+assays%3A+a+1-week+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651(2021).</li>
<li>Diomede, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibition+of+a+pseudotyped+virus+transduction+does+not+translate+to+inhibition+of+SARS-CoV-2+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity.</a> Viruses. 13 (9), 1745(2021).</li>
</ol>

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

野生型ウイルスの使用は実際の感染をシミュレートしますが、レンチウイルスPVは、病原性ウイルスを扱うために必要な厳格な安全要件なしに、ウイルスの侵入と感染に関連するメカニズムを研究するためのより安全な選択肢です4,20,21。PVは、複製欠損ウイルスコアと、本研究の目的である病原性ウイルスの表面エンベロープ糖タンパク質に囲まれたコアで構成されています。
HIV-1ベースのPVは、最も広く使用されているプラットフォームの1つであり、SARS-CoV-2偽ウイルス粒子の製造のためにこのプロトコルで採用されています。レポーター遺伝子は、PVの使用によって異なる場合があります。この場合、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を選択することで、産生されたPVの感染性を簡単、迅速、かつ高感度に読み取ることができます。

<p class="jove_con...

偽型ウイルス(PV)は、微生物学において宿主ウイルスおよび病原体と病原体の相互作用を研究するために使用される分子ツールです1,2,3,4。PVは、ウイルスゲノムを保護するウイルスコアである内側の部分と、ウイルスの表面にあるエンベロープ糖タンパク質である外側の部分から構成され、屈性を規定しています5。偽ウイルスは、新しいウイルス粒子を生成するためのすべての遺伝情報を含んでいないため、標的細胞内で複製する能力がありません。この独特な特徴の組み合わせにより、PVは野生型ウイルスの安全な代替品となります。一方、野生型ウイルスは病原性が高く、BSL2の検査室では分析に使用できない6。
PVの感染力は、通常、蛍光タンパク質(GFP、RFP、YFP)または化学発光産物を産生する酵素(ルシフェラーゼ)をコードするレポーター遺伝子によってモニターできます。これは、PV産生に用いられるプラスミドの1つに含まれ、偽ウイルス7のゲノムに組み込まれる。
現在、HIV-1ゲノムに基づくレンチウイルス由来の粒子など、いくつかの種類のPVコアが存在します。HIV-1ベースのPVが他のプラットフォームよりも優れている点は、標的細胞ゲノム8への本質的な統合プロセスです。HIV-1は感染力の強いウイルスであり、エイズの原因物質ですが、これらのレンチウイルスベクターは、長年にわたる広範な最適化ステップにより、安全に使用できます。最適な安全条件は、形質導入能力に影響を与えることなくウイルス遺伝子を枯渇させた第2世代レンチウイルスベクターの導入によって達成されました9。第3世代と第4世代は、ウイルスゲノムを別々のプラスミドにさらに分割することで、レンチウイルスベクターの取り扱いの安全性の向上に貢献しました10,11。最新世代のPVは、一般的に遺伝子治療用のレンチウイルスベクターの製造に用いられています。
PVは、ウイルスと宿主細胞の間の相互作用を研究するために、生産段階と感染段階の両方において使用できます。PVは、特に偽ウイルス中和アッセイ(PVNA)に用いられます。PVNAは、PVのエンベロープ上のウイルス糖タンパク質を標的とすることにより、血清または血漿の中和能を評価するために広く検証されています12,13。中和活性は、阻害濃度50(IC50)として表され、ウイルス粒子の侵入の50%を遮断する血清/血漿の希釈として定義される14。このプロトコルでは、ブースターワクチンの接種前後に採取した血清中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)に対する抗体活性をテストするためのPVNAのセットアップについて説明しました。

<table><tbody><tr><td>0.45 μ;m フィルター</td><td>SARSTEDT</td><td>83 1826</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>SARSTEDT</td><td>83 3920</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>SARSTEDT</td><td>8,33,924</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット</td><td>メルク</td><td>10403892</td><td></td></tr><tr><td>黒色不透明 96 ウェル マイクロプレート</td><td>パーキン エルマー</td><td>60005270</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイド イーグル ミディアム&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D6546 - 500ML</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS 1x)</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>AUROGENE</td><td>AU-S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism version 7</td><td>graphpad dotmatics</td><td>NA</td><td>原稿では、商品名を「データ分析プログラム」に置き換え</td></tr>ています<tr><td>HEK293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T/ACE2細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK293Tは、レンチウイルスベクターでACE2を過剰発現するように形質導入されています。</td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>AUROGENE</td><td>AU-X0550-100</td><td></td></tr><tr><td>ルミノメーター - Victor3</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH35000500</td><td>原稿では、商品名を&nbsp; 'luminometer'&nbsp; に置き換えています。</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>原稿では、商品名を「還元血清培地」に置き換えています。</td></tr><tr><td>p8.91 パッケージングプラスミド</td><td>Di Genova et al., 2021</td><td></td><td>ナイジェル・テンパートン教授からの親切な贈り物 (参考文献 16.)</td></tr><tr><td>pCSFLW reporter plasmid</td><td>Di Genova et al., 2021</td><td></td><td>ナイジェル・テンパートン教授からの親切な贈り物 (参考文献 16.)</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン、分岐 (PEI) (25 kDa)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)</td><td>Addgene</td><td>145839</td> このプラスミドは、プラスミド Addgene pGBW-m4137382 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>を発現する HEK293Tcells/ACE2 SARS-CoV-2 Spike の生成に使用されましたステディライトプラスレポーター遺伝子アッセイシステム</td><td>パーキン・エルマー</td><td>6066759</td><td>原稿では、商品名を「ルシフェラーゼ読み取り試薬」に置き換えましたトリ</td></tr><tr><td>プシンEDTA 1x</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0949-100</td><td></td></tr></tbody></table>

中和アッセイを介してsars-cov-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

シュードタイプウイルス(PV)は、宿主とウイルスの相互作用を研究し、血清サンプルの中和能力をテストするために使用できる分子ツールであり、目的遺伝子を送達するための遺伝子治療での使用がよく知られています。PVは、ウイルスゲノムがPVに取り込まれない異なるプラスミドに分割されているため、複製に欠陥があります。この安全で汎用性の高いシステムにより、バイオセーフティレベル2のラボでPVを使用できます。ここでは、ここで述べた3つのプラスミドに基づいてレンチウイルスPVを産生する一般的な方法論を提示します:(1)感染を監視するために必要なレポーター遺伝子を運ぶバックボーンプラスミド。(2)PVを生成するために必要なすべての構造タンパク質の遺伝子を運ぶパッケージングプラスミド。(3)ウイルスの向性を決定し、宿主細胞へのウイルスの侵入を媒介するエンベロープ表面の糖タンパク質発現プラスミド。この研究では、SARS-CoV-2スパイクは、非複製性SARS-CoV-2偽型レンチウイルスの産生に使用されるエンベロープ糖タンパク質です。
簡単に説明すると、パッケージング細胞(HEK293T)を標準的な方法を用いて3つの異なるプラスミドと同時トランスフェクションしました。48時間後、PVを含む上清を回収し、ろ過し、-80°Cで保存した。 SARS-CoV-2 PVの感染力は、感染後48時間後の標的細胞株におけるレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)の発現を調べることによってテストされました。相対発光単位(RLU)の値が高いほど、感染/形質導入率は高くなります。さらに、感染性PVを段階希釈した血清サンプルに添加して、偽ウイルスが標的細胞に侵入する中和プロセスを調べ、RLU強度の低下として測定しました。

このプロトコルでは、SARS-CoV-2 PVの産生と、抗COVID-19ワクチン接種を受けている被験者の血清/血漿の中和活性を分析するためのこれらのPVの下流アプリケーションについて説明します17。さらに、このプロトコルを適用して、懸念される各SARS-CoV-2変異株(VOC)の偽型を生成して、中和応答の進化をテストできます。このプロトコルは、COVID-19ワクチン接種後の液性免疫応答の研究を容易にするにもかかわらず、さまざまなウイルスに対するさまざまな血清/血漿の中和を簡単にテストできるように適応させることができます13,18,19。
図4A は、RLUシグナルの増加に対応する血清の希釈率(Log(dilution))の増分を表しています。したがって、サンプルの希釈率が高いほど、ウイ...

偽型ウイルス(PV)は、複製欠損のあるウイルス粒子であり、本物のウイルスを扱うよりも安全な条件下で宿主とウイルスの相互作用を研究するために使用されます。ここでは、SARS-CoV-2 PVを使用して、COVID-19ワクチン接種後の患者の血清の中和能力をテストする方法を示す詳細なプロトコルを紹介します。

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

偽型ウイルスは、宿主とウイルスの相互作用を研究し、血清サンプルの中和活性をテストするために使用できる分子ツールです。本日発表する研究では、遊離プラスミドに基づいて偽型ウイルスを生産するための一般的な方法論が提示されます。中和アッセイには、一般的にY型ウイルスが用いられますが、病原性が高く、BSL-2実験室では取り扱うことができないため、このシステムは純粋に大規模に適用できます。偽ウイルスの技術は、病原体と宿主の相互作用を研究し、抗体の中和活性をテストするために、生きたウイルスと比較してより安全な代替手段となり得ます。今後は、ワクチン接種後の免疫維持における特異的抗体の役割を、疑似ウイルスの技術を用いて調べる予定です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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インフルエンザウイルスAおよびBの急速な分子の検出と分化

この研究は説明します ウイルス間の抗原性の関係を分析するための画像化ベースのマイクロ中和アッセイ。プロトコルは、フラットベッドスキャナを使用し、滴定、滴定の定量、中和、及び中和定量を含む4つのステップがあります。アッセイは、現在の循環インフルエンザA（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスでうまく動作します。...

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

この opsonophagocytic 殺害の試金を使用してに対応し、さまざまな治療法や条件に基づいている細菌を殺す免疫細胞の貪食能力を比較します。クラシック、この試金はオプソニンとして細菌に対する抗体のエフェクターの機能を評価するためのゴールド...

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

学ぶSARS-CoV-2偽型ウイルス製造法と中和アッセイによるワクチン接種後の抗体評価。BSL-2対応の安全な分子ツールでウイルス・宿主相互作用を解析し、免疫維持メカニズムの理解に貢献します。

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

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