Name: EV活性化凝固時間(EV-ACT)を用いた細胞外小胞(EV)の凝固促進活性の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: 学ぶEV活性化凝固時間法による細胞外小胞の凝固促進活性測定。脳外傷患者の凝固異常を迅速に評価し、臨床診断に応用する新手法を習得する。

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この研究は、中国国家自然科学基金会(81901525年)の助成金第81930031号の助成金によって支援されました。さらに、機械と技術指導を提供してくれたTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co.、Ltd.に感謝します。

ヒト検体の収集は、天津医科大学総合病院の医療倫理委員会によって承認されました。ヒト静脈血の採取は、中国国家衛生健康委員会が発行したガイドライン、すなわちWS / T 661-2020静脈血検体の収集に関するガイドラインに厳密に従いました。簡単に説明すると、前上腕静脈からインフォームドコンセントを得て健康な人から血液を採取し、サンプルを3.2%クエン酸ナトリウム抗凝固剤を使用して1:9の比率で混合しました。クエン酸ナトリウム抗凝固剤検体のみを採取した場合、最初の採取容器は廃棄した。処理フローは、サンプル採取から 0.5 時間以内に開始されました。成人の健康な被験者は、インフォームドコンセントを得た後、サンプル収集のために募集されました。患者の除外基準は、(1)最近の血管内血栓症、(2)肝および腎機能障害、(3)高血圧、高脂血症、糖尿病、およびその他の慢性疾患、(4)アスピリンまたは抗凝固剤治療、(5)月経および妊娠でした。.
1. EVリッチプラズマの分離
<ol><li>サンプルを室温で120 x g で20分間遠心分離し、血球を除去します。上清は多血小板血漿です。次に、上清の上部1/2をピペットで新しい遠心チューブに移します。</li>
	<li>多血小板血漿を室温で1500 x g で20分間遠心分離し、血小板を除去します。上清は血小板に乏しい血漿です。次に、上清の上部1/2を新しい遠心チューブに移します。</li>
	<li>血小板に乏しい血漿を13000 x g で室温で2分間遠心分離し、細胞破片を除去します。上清はEVリッチ血漿です。次に、上清の上部1/2を新しい遠心分離管に移し、その後の検査を行います。</li>
</ol>2. 分析装置による試料のEV-ACTの検出
<ol><li>血栓分析装置( 材料表を参照)の電源を入れ、装置を37°Cに予熱します。 使い捨てプローブとテストカップを取り付けてから、機械の品質管理手順を開始します。 注:画面上の粘性抵抗信号値が直線で表示されている場合は、検出が妨げられず、分析器の状態の品質管理が認定されていることを意味します。テスト手順は、セルフテストが認定された後に開始できます。</li>
	<li>サンプル情報をシステムに入力します。次に、200 μL の EV リッチ血漿をテストカップに移し、続いて 20 mM 170 μL の塩化カルシウムを移します。スタートボタンをクリックします。テストカップの磁気攪拌棒は、サンプルと塩化カルシウムを完全に混合します。カバーを閉じると、プローブはサンプル抵抗の変化を検出し始めます。 注:テストが終了すると、アナライザーは自動的に「テストが完了しました」というプロンプトを表示します。EV-ACTの時刻は、システムによって表示および記録されます。結果は時間「秒」という単位で表されます。プローブを廃棄し、カップをテストします。</li>
</ol>3. フローサイトメトリーによるEVリッチ血漿サンプルの品質管理
<ol><li>EVはまず、そのサイズ(0.1-1μm)で識別されました。あらかじめフローサイトメーターのパラメータを調整し、市販のポリスチレンビーズ(0.5、0.9、3.0μm)を用いてEVの「ゲート」をセットします( 材料表参照)。 注:ビーズ混合物は、マイクロベシクル(0.5および0.9μm)および血小板(0.9μmおよび3μm)のサイズ範囲をカバーする異なる直径の蛍光球で構成されています。</li>
	<li>前方散乱光と側方散乱光の電圧を調整し、0.9 μmの微小球が適切な領域に収まるようにします。EV領域は、微小球の直径に応じて描くことができます。</li>
	<li>50 μL の EV リッチ血漿をフローチューブに移し、続いて 450 μL のろ過済みリン酸緩衝生理食塩水を移します。フローチューブ内の液体を完全に混合します。最後に、フローサイトメトリー25を用いてサンプルを検出します。</li>
	<li>Ultra Rainbow Fluorescent Particles( 材料表を参照)を使用して、EVs.In ブリーフの数を定量し、フロー検出前に10 μLの粒子をサンプルに添加し、サンプル検出完了後に次の式を使用してEV濃度を計算します:10,120 * EV(#)/(マイクロビーズ*容量)*希釈係数26。</li>
</ol>

EV リッチ血漿の血液凝固亢進の評価

<ol><li>Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulopathy+induced+by+traumatic+brain+injury%3A+systemic+manifestation+of+a+localized+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury.</a> Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).</li>
<li>Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prothrombotic+state+associated+with+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Prothrombotic state associated with preeclampsia.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).</li>
<li>Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+thrombosis+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346(2022).</li>
<li>You, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypercoagulability+with+thrombelastography+in+patients+with+hip+fracture+receiving+thromboprophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis.</a> Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
<li>Zang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-derived+microparticles+as+novel+biomarkers+for+the+diagnosis+of+deep+venous+thrombosis+in+trauma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400(2023).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V%28-%29+and+tissue+factor%28%2B%29+microparticles+as+biomarkers+for+predicting+deep+vein+thrombosis+in+patients+after+joint+arthroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty.</a> Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).</li>
<li>Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microparticles+in+the+pathogenesis+and+early+anticoagulation+of+thrombosis+in+COVID-19+with+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505(2021).</li>
<li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).</li>
<li>Cointe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+microparticle+enumeration+across+different+flow+cytometry+platforms%3A+results+of+a+multicenter+collaborative+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).</li>
<li>Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+and+platelet-derived+microvesicle+absolute+counts+determined+by+flow+cytometry+correlates+with+a+measurement+of+their+functional+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348(2014).</li>
<li>Mooberry, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+microparticles+promote+coagulation+in+a+factor+XI-dependent+manner+in+human+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+microparticles+and+pathophysiology+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).</li>
<li>Bolliger, D., Tanaka, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+coagulation+testing+in+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).</li>
<li>Ganter, M. T., Hofer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+monitoring%3A+current+techniques+and+clinical+use+of+viscoelastic+point-of-care+coagulation+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+%26+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices.</a> Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).</li>
<li>Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+assessment+of+the+anticoagulant+activity+of+direct+oral+anticoagulants%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review.</a> Chest. 151 (1), 127-138 (2017).</li>
<li>Maier, C. L., Sniecinski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulation+monitoring+for+perioperative+physicians%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anticoagulation monitoring for perioperative physicians.</a> Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).</li>
<li>Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+method+of+in+vivo+evaluation+of+hemostasis%3A+Spatial+thrombodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%22%5BJournal%5D)">The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics.</a> Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).</li>
<li>Tsantes, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+coagulation+activity+in+hip+fracture+patients%3A+A+case-control+study+using+rotational+thromboelastometry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Laboratory+Hematology%22%5BJournal%5D)">Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).</li>
<li>Premkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19-related+dynamic+coagulation+disturbances+and+anticoagulation+strategies+using+conventional+D-dimer+and+point-of-care+Sonoclot+tests%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study.</a> BMJ Open. 12 (5), e051971(2022).</li>
<li>Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+thromboelastography+and+thromboelastometry%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Anestesiologica%22%5BJournal%5D)">Comparison between thromboelastography and thromboelastometry.</a> Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16F+mediated+phosphatidylserine+exposure+and+microparticle+release+on+erythrocyte+contribute+to+hypercoagulable+state+in+hyperuricemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666(2022).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperuricemia+enhances+procoagulant+activity+of+vascular+endothelial+cells+through+TMEM16F+regulated+phosphatidylserine+exposure+and+microparticle+release%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release.</a> The FASEB Journal. 35 (9), e21808(2021).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPs-ACT%2C+an+assay+to+evaluate+the+procoagulant+activity+of+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374(2023).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+extracellular+vesicles+induce+vasoconstriction+and+reduce+cerebral+blood+flow+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice.</a> Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+microvesicles+levels+and+effects+of+associated+factors+in+elderly+patients+with+obstructive+sleep+apnea%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282(2021).</li>
<li>Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in lung disease.</a> Chest. 153 (1), 210-216 (2018).</li>
<li>Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preeclampsia+and+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Hypertension+Reports%22%5BJournal%5D)">Preeclampsia and Extracellular Vesicles.</a> Current Hypertension Reports. 18 (9), 68(2016).</li>
<li>Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+exosomes+in+the+therapy+of+the+cartilage+and+bone+complications%3B+emphasis+on+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science%22%5BJournal%5D)">The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis.</a> Life Science. 236, 116861(2019).</li>
<li>Shi, J., Gilbert, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactadherin+inhibits+enzyme+complexes+of+blood+coagulation+by+competing+for+phospholipid-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites.</a> Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).</li>
<li>Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+endothelial+locus-1+%28Del-1%29+mediates+clearance+of+platelet+microparticles+by+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium.</a> Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).</li>
<li>Frey, B., Gaipl, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+functions+of+phosphatidylserine+in+membranes+of+dying+cells+and+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles.</a> Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).</li>
<li>Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+removal+by+single-step+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Platelet removal by single-step centrifugation.</a> Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+placenta-derived+extracellular+vesicles+with+pre-eclampsia+and+associated+hypercoagulability%3A+a+clinical+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study.</a> BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+applications+of+microparticles+in+the+diagnosis%2C+treatment%2C+and+prognosis+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404(2022).</li>
<li>Piwkham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+red+blood+cell+microvesiculation+exerts+procoagulant+activity+of+blood+cell+storage+in+Southeast+Asian+ovalocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis.</a> Heliyon. 9 (1), e12714(2023).</li>
<li>Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+clot+based+assay+for+detection+of+procoagulant+cell-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).</li>
</ol>

すべての著者は、潜在的な利益相反はないと宣言しました。

本研究では、EVリッチ血漿の調製について記述し、フローサイトメトリーを用いてその方法の合理性を検証した。続いて、再石灰化した血漿試料を、粘弾性原理24に基づく血栓分析装置を用いてACT時間で分析した。図3Aに示すように、超遠心分離で得られたEVの濃度はEV-ACT時間を短縮する一方で、EVレベルを低下させた超遠心分離後の上清はEV-ACT時間を長くすることがわかりました。これらの知見は、EV-ACTの結果とEVレベルの間に密接な関係があることを示唆しています。図3Bでは、子癇前症、大腿骨頸部骨折、および肺がんの患者の血漿サンプルのEV-ACTを健康なボランティアと比較したところ、疾患群ではEV-ACT時間が有意に短いことが明らかになりました。以前の報告では、これらの疾患の血漿中の凝固促進EVのレベルの上昇が示されています27,28,29。</su...

凝固亢進によって引き起こされる血栓症は、脳外傷1、子癇前症2、腫瘍3、骨折患者4など、さまざまな疾患で重要な役割を果たしています。凝固亢進のメカニズムは複雑であり、近年、凝固障害における細胞外小胞(EV)の役割が注目されています。EVは、直径10nmから1000nmの範囲で、細胞膜から剥離する二重層構造を持つ小胞状の物体です。それらはさまざまな疾患プロセス、特に凝固障害に関連しています5。いくつかの研究により、EVが血栓症リスクの有望な予測因子であることが確認されています6,7。EVの凝固促進活性は、凝固因子、主に組織因子(TF)とホスファチジルセリン(PS)の発現に依存します。強力な凝固促進活性を持つEVは、テナーゼとプロトロンビン複合体の触媒効率を大幅に高め、それによってトロンビン媒介性フィブリノーゲンと局所血栓症を促進します8。EVのレベルの上昇と凝固亢進との因果関係は、多くの疾患で観察されています9。したがって、EVの検出を標準化し、その凝固促進活性を報告することは、重要な調査分野です10。
現在まで、EVの凝固促進活性を検出するための市販キットはごくわずかです。MP-ActivityアッセイおよびMP-TFアッセイは、営利企業によって製造され、血漿中のEVの凝固促進活性を測定するために使用される機能アッセイです11。これらのアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイと同様の原理を採用して、EVのPSおよびTFを検出します。しかし、これらのキットは高価であり、少数の高レベルの研究機関に限定されています。このプロセスは複雑で時間がかかるため、臨床現場での実装は困難です。さらに、市販の凝固促進剤リン脂質(PPL)アッセイは、PSフリー血漿と試験血漿を混合し、凝固時間を測定してPS陽性EVのレベルを定量的に検出します12。しかし、これらのアッセイは、主にEVのPSとTFに焦点を当てており、循環するEVが関与している可能性のある他の凝固経路を見落としています12。
血漿凝固システムは複雑で、凝固剤、抗凝固剤、線溶系、血漿中に懸濁したEVなど、「目に見えない」成分と「見える」成分の両方で構成されています。生理学的には、これらの成分は動的なバランスを維持しています。病理学的状態では、循環中のEVの有意な増加は、特に脳外傷、子癇前症、骨折、およびさまざまな種類の癌の患者において、凝固亢進に寄与します13。現在、臨床検査室における凝固状態の評価は、主に凝固系、抗凝固系、および線溶系の評価を含む14,15,16,17。プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、トロンビン時間、および国際正規化比は、凝固システム18における凝固因子レベルを評価するために一般的に使用される。しかし、最近の研究では、これらの検査が特定の疾患の凝固亢進を完全には反映していないことが明らかになっています19。血栓エラストメトリー(TEG)、回転TEG、ソノクロット分析などの他のアッセイ法では、全血の粘弾性変化を測定します20,21。全血検体には多数の血球と血小板が含まれているため、これらの検査は検体全体の凝固状態を示す可能性が高くなります。一部の研究者は、凝固促進活性における血球と血小板の役割について報告しています22,23。最近の研究では、以前の凝固機能検査では、微粒子の凝固促進活性の変化を検出するのが困難であることも発見されました24。そこで、EVリッチ血漿中の活性化凝固時間(ACT)の粘弾性測定により、EVの凝固促進機能を評価できるという仮説が提唱されている。

<table><tbody><tr><td>AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles</td><td>3.8 μm;Spherotech, Lake Forest, IL, USA</td><td></td><td>MPの定量的検出用</td></tr> 塩化<tr><td>カルシウム</td><td>Werfen (中国)</td><td>0020006800</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>センチュリー クロット分析装置</td><td>天津センチュリー 宜康医療技術開発有限公司</td><td></td><td>原理は、粘弾性法でプラズマ粘度を測定することです</td></tr><tr><td>使い捨てプローブとテストカップ</td><td>天津センチュリー宜康医療技術開発有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa フローサイトメーター</td><td>BD, USA</td><td></td> MP <td></td></tr><tr><td>Megamixポリスチレンビーズ</td>の検出に使用 <td>Biocytex, Marseille, France</td><td>7801</td><td>Megamixは、選択した直径のマイクロビーズの混合物で構成されています。メートル、0.9 &マイクロ;m と 3 &micro;m.</td></tr></tbody></table>

ev活性化凝固時間(ev-act)を用いた細胞外小胞(ev)の凝固促進活性の決定

Determination of the Procoagulant Activity of Extracellular Vesicle (EV) Using EV-Activated Clotting Time (EV-ACT)

さまざまな疾患における細胞外小胞(EV)の役割は、特に強力な凝固促進活性により、ますます注目を集めています。しかし、臨床現場でのEVの凝固促進活性を評価するためのベッドサイドテストが緊急に必要とされています。この研究は、EVの凝固促進活性の尺度として、EVリッチ血漿のトロンビン活性化時間の使用を提案しています。標準化された手順を使用してナトリウムクエン酸全血を採取し、続いて差動遠心分離を行ってEVに富む血漿を得ました。EVリッチ血漿と塩化カルシウムをテストカップに加え、分析装置を使用して粘弾性の変化をリアルタイムで監視しました。EV-ACTと呼ばれるEVリッチプラズマの自然凝固時間を決定しました。その結果、健康なボランティアから得られた血漿からEVを除去するとEV-ACTが有意に増加し、EVを濃縮すると有意に減少することが明らかになりました。さらに、子癇前症、大腿骨頸部骨折、肺がんのヒト検体ではEV-ACTが有意に短縮され、血漿EV濃度の上昇と血液凝固亢進の促進が示された。EV-ACTは、その簡単で迅速な手順により、血漿EVレベルが高い患者の凝固機能を評価するためのベッドサイドテストとして有望です。

EVリッチ血漿のトロンビン活性化時間は、プラズマ凝固時間測定用粘弾性法分析装置を用いて測定した。この機械は、電子信号変換器、プローブ、検出タンク、発熱体の4つの主要コンポーネントで構成されています(図1A、B)。このプローブは、高周波および低振幅の振動を利用して、プラズマ粘度の変化を検出します。日常の品質管理には、主にテストプラットフォームの安定性を評価し、プローブの物理的な障害を特定するための空気品質管理が含まれます。性能品質管理では、プローブによって検出された抵抗値が設定範囲内に収まることを確認するために、標準粘度オイルでテストします。
EVリッチ血漿を取得した後、サンプルの品質管理のためにフローサイトメトリーを使用してEVを測定しました。不適格なサンプルは、EVの「ゲート」付近にわずかに大きい粒子径の明瞭なクラスターを示します(図2A)。対照的に、EVリッチなサンプルは、ほとんどの信号が単一のグループとしてEVの「ゲート」内...

このプロトコルは、EVの凝固能力の指標として細胞外小胞(EV)が豊富な血漿の使用を調査します。EVに富む血漿は、差動遠心分離とその後の再石灰化のプロセスによって得られます。

EV活性化凝固時間(EV-ACT)を用いた細胞外小胞(EV)の凝固促進活性の決定

The role of extracellular vesicles (EV) in various diseases is gaining increased attention, particularly due to their potent procoagulant activity. ...

私たちの主な焦点は、脳外傷を負った患者の凝固障害です。本研究では、細胞外膀胱活動の凝固時間による凝固機能の変化をモニターすることを試みています。私たちのチームは、脳損傷の研究に着目しています。そして、脳損傷では、それらは私たちが過凝固状態と呼ぶ重篤な状態です。測定するのは非常に困難です。また、患者の血液中には、アポトーシス体、マイクロベシクル、エクソソームなど、細胞外小胞と呼ばれる微小胞があることがわかっています。そして、それらはプロの凝固能力で異なります。したがって、能力を測定する方法を見つける必要があります。そして、この方法では、細胞外小胞の違いを素早く見つけることができる。これはとても重要なことです。この対策によって、私たちは多くのことを行うことができます。TPIマウスでは、臨床患者、特に末梢循環では、塞栓術にいくらかの費用がかかることを確認しています。これは臨床において非常に深刻なことです。私たちのプロトコルは、そのシンプルさ、費用対効果、および速度により、他の技術と比較して大きな利点を提供しました。ベッドサイドで血液凝固検査を行うことができるため、大掛かりな検査が不要になります。私たちの研究は、末梢血の過凝固状態を測定できる新しい方法を確立しました。TPIだけでなく、敗血症、子癇前症、腫瘍、血液疾患など他の疾患にも使用できます。将来的には、血栓のリスクを高める臨床ハイパーA状態のスキャンでの調査を計画しています。

determination-procoagulant-activity-extracellular-vesicle-ev-using-ev

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

この研究では、以前に報告されていないヒト血漿中のフィブリンクロット形成の間のFV凝固活性を測定した新規マイクロプレートアッセイを説明しています。この方法は、継続的にヒト血漿中のフィブリン塊形成時の405nmでの吸光度の変化を測定するために運動をマイクロプレートリーダーを使用しています。...

マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定

多くの異なる方法は、フローサイトメトリー（FCM）を使用して、細胞外小胞（電気自動車）の測定のために存在する。使用する最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮すべきである。電気自動車を測定するための2つのプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示されている。...

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

このプロトコルでは蛍光を用いたナノ粒子追跡によるひと全血から細胞小胞の迅速な分離と特定のマーカーの特性の完全なワークフローを説明します。結果が発表される高レベルの再現性を示し細胞培養上清に調整することができます。...

ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

本報告書は、ミクログリアまたは血液マクロファージからの細胞外小胞(EV)単離に関する時系列的要件を強調している。ミクログリア由来EVは神経突起の伸長因子として評価され、血液マクロファージ由来EVはインビトロアッセイにおけるC6グリオーマ細胞浸潤の制御で研究された。目標は、これらのEV機能を特定の微小環境における免疫メディエーターとして理解することです。...

細胞外小胞由来免疫細胞由来の特徴と細胞環境への機能的影響の研究

細胞外小胞(EV)は細胞生物学と細胞間コミュニケーションに貢献します。細胞の取り込みEVを可視化・定量化するための実用的なアッセイが必要です。現在のプロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスによるEV単離に続く共焦点顕微鏡 による 3次元蛍光イメージングを利用してEV取り込みアッセイを提案している。...

共焦点顕微鏡イメージング解析による細胞外小胞取り込みアッセイ

本プロトコルは、末梢血および固体組織から細胞外小胞を抽出し、その後表面抗原およびタンパク質カーゴのプロファイリングを行う方法を記載している。...

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

本論文では、マウス大動脈を単離し、石灰化した細胞外小胞を抽出して石灰化の可能性を観察することにより、血管石灰化を取得および評価するための方法論を提示します。...

in vitro および in vivo モデルを用いた細胞外小胞媒介血管石灰化の解析

ここでは、社内の細胞外小胞組織因子活性アッセイについて説明します。活性ベースのアッセイおよび抗原ベースのアッセイは、ヒト血漿サンプルからの細胞外小胞中の組織因子を測定するために使用されています。活性ベースのアッセイは、抗原ベースのアッセイよりも高い感度と特異性を持っています。...

細胞外小胞組織因子活性アッセイ

この記事では、ヒト血漿由来の細胞外小胞(EV)の単離、特性評価、定量の方法論について説明し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用した EV...

心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

ここでは、ヒト被験者の涙や唾液などの生体液から採取された細胞外小胞(EV)の特性評価法を示します。この方法で使用されるスキャナーは、サンプルの1μLからEVの表現型、サイズ、および総粒子数を検出することができます。...

体液からの細胞外小胞の特性評価

学ぶEV活性化凝固時間法による細胞外小胞の凝固促進活性測定。脳外傷患者の凝固異常を迅速に評価し、臨床診断に応用する新手法を習得する。

EV活性化凝固時間(EV-ACT)を用いた細胞外小胞(EV)の凝固促進活性の決定

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