Name: 偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 学ぶ偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析。アミロイド繊維の配向検出と深部イメージングにより、アルツハイマー病などのタンパク質凝集体関連疾患の理解に貢献する革新的な顕微鏡技術を習得できます。

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この研究は、ポーランドの国立科学センターの資金提供を受けたSonata Bis 9プロジェクト(2019/34/E/ST5/00276)の支援を受けました。

偏光感受性2光子顕微鏡による球晶石の特性評価

<ol><li>Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetazzi%2C+RA+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22">Progress in Molecular Biology and Translational Science</a>. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).</li>
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<li>Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+birefringence+on+polarization+resolved+nonlinear+microscopy+and+collagen+SHG+structural+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging.</a> Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).</li>
<li>Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+distortion+effects+in+polarimetric+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li>
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<li>Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+in+cartilage+under+strain+probed+by+polarization+sensitive+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy.</a> Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611(2019).</li>
<li>Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+model+of+the+molecular+orientational+distribution+probed+by+polarization-resolved+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+A%22%5BJournal%5D)">Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation.</a> Physical Review A. 85 (4), 043829(2012).</li>
<li>Loksztejn, A., Dzwolak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+Bifurcation+in+aggregating+insulin%3A+an+induced+circular+dichroism+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study.</a> Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).</li>
</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

偏光感受性2光子顕微鏡は、アミロイド上部構造内のフィブリルの局所的な秩序を研究するための貴重なツールであり、標準的な多光子セットアップを少し変更するだけで済みます。非線形光学現象を操作するため、1光子励起蛍光顕微鏡法と比較して、角度による光選択の低減と軸方向分解能の向上を達成できます。さらに、1光子励起蛍光顕微鏡技術と比較して、光散乱が少なく、光毒性が低く、サンプルの浸透が深くなります19,20。すでに証明したように、球晶石などのタンパク質の高密度凝集体の測定に適しており、ラベルフリーの方法で実行できます21。
ただし、ここで説明する方法を効果的に使用するには、いくつかの重要な問題に注意を払う必要があります。サンプルの調製とその品質、つまりインキュベーションから始めて、アミロイドの上部構造が正しく増殖していることを常に確認してください。球晶石の場合、偏光光学顕微鏡と交差偏光子を用いて、特徴的なマルタの十字パターンを与え...

過去数十年にわたり、タンパク質とその凝集体のバイオイメージングのための多数の蛍光顕微鏡技術が大幅に開発されてきましたが1、サンプル内の局所的な秩序を解明するために使用されたのはごくわずかです2,3。蛍光寿命イメージング顕微鏡4は、アミロイド上部構造-球晶石の本質的な構造不均一性を研究するために使用されました。さらに、球晶石のような複雑で高密度に充填された生体構造内の局所秩序の定量的決定は、分極に敏感な方法を使用して解決することができました3。しかし、UV-VIS波長を使用してin vivoで蛍光色素を励起すると、組織の光散乱が大きくなるため、表在組織浸透を伴う標準的な蛍光技術には限界があります5。さらに、このようなイメージングでは、特定の蛍光プローブを設計し、標的とする生体分子に結合する必要があることが多く、イメージングを行うために必要なコストと作業量が増加します。
最近、これらの問題に対処するために、私たちのチームは、偏光感受性二光子励起蛍光顕微鏡(ps-2PFM)を適応させ、生体構造のラベルフリーイメージングに用いることにした6,7。Ps-2PFMは、励起ビームの直線偏光方向に対する2光子蛍光強度の依存性の測定と、放出された蛍光の偏光の分析を可能にする8。この技術を実装するには、標準的な多光子顕微鏡セットアップ励起経路(図1)に、光の偏光面を制御するための半波長板を追加する必要があります。次に、2つのアバランシェフォトダイオードによって収集された信号から、励起レーザービームの偏光に対する2光子励起蛍光強度の依存性を示す極性グラフが作成され、蛍光偏光の2つの相互に垂直な成分が収集されます。
最後のステップは、ダイクロイックミラーや高開口対物レンズなどの光学素子が偏光に与える影響を考慮したデータ解析プロセスです。2光子プロセスの性質上、焦点面外の蛍光色素の2光子励起は確率的に制限されるため、この方法では角度光選択の低減と軸方向分解能の向上の両方が得られます。また、深部組織イメージング用の近赤外プローブ(NIR)のin vivoイメージングにも同様の手法をうまく実装できることが証明されました9。Ps-2PFMは、細胞膜10やDNA11,12の蛍光色素や、金ナノ粒子13などの生体系の非標準蛍光マーカーのイメージングに応用されている。しかし、これらすべての例において、生体分子の組織に関する情報は間接的に得られたものであり、蛍光色素と生体分子の間にあらかじめ定義された相互配向を必要とした。
最近の論文では、ps-2PFMを応用して、アミロイド上部構造の自家蛍光と、球状突起中のアミロイド線維に結合したアミロイド特異的色素であるチオフラビンTの蛍光の局所偏光を解析できることを示しました6。さらに、別の研究では、ps-2PFMを利用して、アミロイドスフェルライト内のアミロイド線維配向をサブミクロンサイズで検出できることを証明し、透過型電子顕微鏡(TEM)イメージングとの相関関係で確認しました7。この成果の達成は、i)1つまたは2つの光子で励起されたときに、球晶アミロイドの固有の自家蛍光が、450〜500nmの範囲にある発光最大値と標準的な蛍光色素に匹敵する2光子吸収断面積を示す14、ii)生体膜およびDNA構造を標識する色素のps-2PEFをどのように適用できるかを説明するために以前に紹介した数理モデルのおかげで可能になりました球状物質とそれらに結合した染料によって示される蛍光8,11,15。したがって、分析を進める前に、このトピック6に関する最初の論文の本文と補足情報の両方に説明されている必要な理論に目を通すことを強くお勧めします。ここでは、ウシインスリン球状突起のラベルフリーアミロイド構造解析にps-2PFM法を適用する方法のプロトコルを紹介します。

<table><tbody><tr><td>Sample preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, 24 x 24 mm</td><td>Chemland</td><td>04-298.202.04</td><td></td></tr><tr><td>組織学用DPXマウンタント</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6522</td><td>スライドマウンタント</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene</td><td>Chemland</td><td>02-63102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp;C</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>スフェルライトインキュベーションに使用</td></tr><tr><td>HLP 5UV 浄水システム</td><td>Hydrolab</td><td></td><td>サンプル調製に使用されるジイオン化水の供給</td></tr><tr><td>源 塩酸 (&ge;37%、APHAおよびLE;10)、</td>ウシ膵臓からの<td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-M</td><td></td></tr><tr><td>インスリン粉末(&ge;25 units/mg (HPLC))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>メタノール (HPLC グレード)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270474</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、凹面付き、76 x 26 x 1 mm</td><td>Chemland</td><td>04-296.202.09</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60</td><td>Olympus</td><td></td><td>偏光光学顕微鏡、Figure 2</td></tr><tr><td>PTFE スレッドシールテープ、12 mm x 12 mm x 0.1 mm、60 gm2</td><td>Chemland</td><td>VIT131097</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ps-2PFMセットアップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FELH0800 - &Oslash;25.0 mmロングパス</td><td>フィルターThorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FESH0700 - &Oslash;25.0 mm ショートパスフィルター</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDQ100 フォトンカウンティングアバランシェフォトダイオード&nbsp;</td><td>ID Quantique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マルチフォトン ショートパスエミッションフィルター 720 nm&nbsp;</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウント アクロマティック半波板、690-1200 nm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Plan Apo 油浸 100x/1.4 NA</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピエゾ 3D ステージ</td><td>ピエゾシステム イエナ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>偏光ビームスプリッター</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S130C - スリム フォトダイオード パワー センサー、Si、400 - 1100 nm、500 mW</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabView 2018</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Version 18.0.1f2</td></tr><tr><td>Matplotlib ライブラリ</td><td></td><td></td><td>Version 3.3.2</td></tr><tr><td>NumPy ライブラリ</td><td></td><td></td><td>Version 1.19.2</td></tr><tr><td>SciPy Library</td><td></td><td></td><td>Version 1.5.2</td></tr><tr><td>Spyder Python 3 IDE</td><td></td><td></td><td>バージョン 4.1.5</td></tr></tbody></table>

偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析

Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization

2光子励起は、1光子励起と比較して、光毒性が低く、組織への浸透が深く、高密度で密集したシステムでの効率的な操作が可能で、蛍光色素の光選択角度が小さくなるため、バイオイメージング実験に有益です。したがって、2光子蛍光顕微鏡(2PFM)における偏光分析の導入により、線形光学プロセスに基づく標準的なイメージング法と比較して、サンプル中の分子組織をより正確に決定することができます。本研究では、分極感受性2PFM(ps-2PFM)と、複雑な生体構造であるアミロイド球状突起内の分子秩序の決定への応用に焦点を当てています。アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患は、タンパク質のミスフォールディングプロセスの障害によって形成されるアミロイドタンパク質凝集体を検出することで診断されることがよくあります。その構造を探ることは、その生成経路をよりよく理解し、その結果、より感度の高い診断方法の開発につながります。本論文では、ウシインスリン球状物質および球状アミロイド原性タンパク質凝集体内の局所線維秩序の決定に適応したps-2PFMについて紹介する。さらに、提案手法により、球晶石内部のフィブリルの三次元組織化を解像できることを証明した。

提示されたプロトコルは、ps-2PFMで検査するためのアミロイド上部構造の準備、顕微鏡システムの構築、および適切なサンプルの測定を通じて、段階的なガイダンスを提供します。ただし、最終的な測定セットの前に、APDを等方性リファレンスに適切に位置合わせすることが不可欠であり、これにより、両方の検出器で同様の形状と強度の対称信号が収集される必要があります(図4C)。検出器で測定されたX軸とY軸の強度の差が最小であっても、その後の測定、特に分析中に適切な補正係数として考慮する必要があります。取り付け後、単一の球晶石を含むサンプルは、図2BのようにPOM上に特徴的なマルタ十字を与え、2PFMラスタースキャンを実行した後、画像は図5Aに示されているものと同様になり、これはスフェルライト6,7および異なる組織化された生体分子<sup class="xref"...

この論文では、偏光感受性2光子顕微鏡を使用して、ラベルフリーアミロイド上部構造-球晶体内の局所組織を特徴付ける方法について説明します。また、サンプルの調製と測定、必要なセットアップの組み立て、およびアミロイド線維の局所組織に関する情報を取得するためのデータの分析方法についても説明します。

Compared to its one-photon counterpart, two-photon excitation is beneficial for bioimaging experiments because of its lower phototoxicity, deeper tissue ...

私たちの目標は、アミロイドと呼ばれるタンパク質凝集体を検出するための新しい光学マーカーと技術を開発することです。アルツハイマー病や2型糖尿病など、さまざまな疾患に関与しています。ですから、これらの病気を治すためには、アミロイドを可視化する技術が必要です。我々は、2光子顕微鏡を用いて、アミロイド上部構造内のアミロイド線維配向を検出できることを実証しました。アミロイド特異的色素だけでなく、アミロイドの自家蛍光を利用することでも実現できます。私たちの技術は非線形光学現象で動作するため、1光子蛍光顕微鏡技術と比較して、角度光選択の低減、軸方向分解能の向上、光散乱の低減、光毒性の低減、およびより深いサンプル浸透を達成できます。偏光感受性2光子蛍光顕微鏡は、タンパク質凝集体だけでなく、DNA小胞や脂質膜など、さまざまな複雑な生体構造の内部構造を画像化するための有望なツールです。

polarization-sensitive-two-photon-microscopy-for-label-free-amyloid

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

このビデオでは、蛍光イメージングに発光結合オリゴチオフェン色素(ヘプタメルホルミルチオフェン酢酸、またはhFTAA)を使用して組織切片のアミロイドを染色する技術について説明しています。アミロイドは、βシートに富む異常なタンパク質の凝集体です。組織サンプル中のそれらの検出は、アミロイド関連疾患またはタンパク病の診断と治療に役立ちます。...

アミロイド沈着物のhFTAA染色:組織切片の蛍光イメージングのためのオリゴチオフェンベースの色素を用いたアミロイド線維の可視化技術

出典:Nyström, S., et al., ハイパースペクトル共焦点顕微鏡法および蛍光寿命イメージングによる発光共役オリゴチオフェンで染色されたアミロイド組織イメージング。J. Vis. Exp.

蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いた組織切片のアミロイド構造の解析

アミロイドの沈着は、さまざまな病気の最大の特徴し、多くの異なった器官を苦しめます。本稿では、発光性共役オリゴチオフェン蛍光蛍光顕微鏡技術との組み合わせで染色の応用について説明します。この染色法は、検出と臨床的および科学的設定でタンパク質凝集体の探査のための強力なツールを表します。...

アミロイド組織イメージング ステンド グラス ハイパー スペクトルで発光共役オリゴチオフェンと共焦点顕微鏡と蛍光寿命イメージング

本稿では、細管障害のモデルで微小管を負荷した希突起膠細胞を、シンプルで革新的な第2高調波発生顕微鏡アプローチで検出するためのプロトコルを紹介します。...

中枢ミエリンにおけるチューブリン依存性欠陥の研究のためのラベルフリー非線形光学系

膜に埋め込まれたタンパク質ドメイン間の相互作用の生物物理学的および生化学的研究は多くの技術的課題は、適切な教材を入手されているの最初に直面しています。この記事では、ソリューションの核磁気共鳴（NMR）およびその他の分析アプリケーションによる構造解析に適しているジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体を製造し、精製するためのプロトコルについて説明します。...

構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

8  - オキソグアニンDNAグリコシラーゼのグリコシラーゼ活性のための時間のコースには、製品の形成と線形定常段階のバーストを示す二相性である。クエンチフロー法を利用して、バースト定常状態速度は、それぞれ、製品のDNAグリコシラーゼからの8  -...

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

1次元および2次元1HNMRを用いたペプチド-金属錯体の構造と配位決定

DNAオリガミは、DNA分子の自己組織化をプログラムすることにより、精密なナノスケールの物体を製造するための強力な方法です。ここでは、DNAオリガミからの生体応答型ロボットのフォールディング、その精製、および透過型電子顕微鏡イメージング(TEM)のためのネガティブ染色のプロトコルについて説明します。...

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

本論文では、さまざまな材料中の化学物質の物質輸送パラメータを定量化するための手順が提示されている。このプロセスは、高真空中でリアルタイムの、質量分析によって記録された放出プロファイルを蒸気に逆解析ベースの拡散モデルを用いることを含む。...

塗料中の化学輸送のキャラに逆解析アプローチ

意図的に設計された金属有機骨格材料の合成、活性化、および特徴付けは、ビルディングブロックは、互換性がないか、不要な形体が熱力学的に望ましい形態より好まれている場合は特に、困難である。当社は、超臨界CO 2乾燥経由毛細血管と活性化における溶媒アシストリンカ交換、粉末X線回折のアプリケーションは、これらの課題のいくつかに対処する方法について説明します。...

官能化有機金属構造体の合成とキャラクタリゼーション

学ぶ偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析。アミロイド繊維の配向検出と深部イメージングにより、アルツハイマー病などのタンパク質凝集体関連疾患の理解に貢献する革新的な顕微鏡技術を習得できます。

偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析

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