Name: ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 学ぶヒトiPS細胞の自動培養システムによる維持・分化プロトコル。小型で低コストな装置により再現性を向上させ、経験の浅い研究者も高度な細胞培養技術を活用できる画期的な手法です。

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本研究は、パナソニックプロダクションエンジニアリング株式会社(大阪市)新事業推進センターからの助成金を受けて行われました。

関西医科大学倫理委員会は、KMUR001と名付けられた健康なボランティア由来iPS細胞の作製と使用を承認しました(承認番号2020197)。公然と募集されたドナーは、正式なインフォームドコンセントを提供し、細胞の科学的使用に同意しました。
メモ: 現在のインターフェイス(Windows XPオペレーティングシステムで実行されている「ccssHMI」という名前の特別なソフトウェア)は、基本的な操作画面です。前述のインターフェイスの下には、一連のタブが配置されており、ユーザーはさまざまな操作を開始できます。
1. ローディング作業
<ol><li>ソフトウェアのトップ画面にある [読み込み 中]ボタンをクリックします。「 Loading Preparation Start 」ボタンをクリックします。</li>
	<li>装置に入れる皿またはプレートを装置内の所定の位置に置きます。 注意: 皿の識別に必要な情報は、各蓋に記入する必要があります。</li>
	<li>フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。</li>
	<li>ソフトウェアで料理またはプレートの種類と数量を選択します。</li>
	<li>「 Loading Preparation Completed 」ボタンをクリックします。[ 読み込み開始 ]ボタンをクリックします。</li>
	<li>ディッシュをシステムにアップロードしたら、iPS細胞の有無など、ディッシュ上の情報をソフトウェア上で選択します。ソフトウェアに各料理に関するメモを登録します。</li>
	<li>最後にある [登録 ]ボタンをクリックして、ロード操作を完了します。</li>
</ol>2. 荷降ろし作業
<ol><li>ソフトウェアのトップ画面にある[ アンロード ]ボタンをクリックします。ソフトウェアで削除するディッシュを選択します。</li>
	<li>ディッシュを選択したら、[ アンロード準備開始 ]ボタンをクリックします。「 アンロード開始」 ボタンをクリックします。</li>
	<li>ディッシュがインキュベーターからシステムのワークベンチに移されたら、 ディッシュ取り外し ボタンを押します。</li>
	<li>前面のスライドウィンドウを手動で開き、皿を取り出します。フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。</li>
</ol>3.消耗品の補充:ピペット、チューブ、培地
<ol><li>ピペット、チューブ、培地などの消耗品を補充するには、ソフトウェアのトップ画面で消耗 品 ボタンをクリックし、補充するアイテムを選択します。<ol><li>ピペット<ol><li>[ ピペット ]ボタンをクリックします。[ 補充 ] ボタンを選択します。</li>
			<li>ユーザーがソフトウェアで補充するラックを選択します。[ 補充開始 ]ボタンをクリックします。</li>
			<li>作業台上のピペット保管場所の蓋が開いていることを確認したら、手動で前面のスライドウィンドウを開き、必要に応じてピペットを補充します。</li>
			<li>フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。[ 補充完了 ]ボタンをクリックします。</li>
			<li>[ 補充設定 ]ボタンをクリックし、補充の情報を入力して、[ 登録 ]ボタンをクリックします。</li>
			<li>[ 補充完了 ]ボタンをクリックします。</li>
		</ol></li>
		<li>チューブ<ol><li>[ チューブ ]ボタンをクリックします。[ 補充 ] ボタンを選択します。</li>
			<li>ユーザーがソフトウェアで補充するラックを選択します。[ 補充開始 ]ボタンをクリックします。</li>
			<li>ラックが上部に移動したことを確認したら、[ 補充チューブ ]ボタンをクリックします。</li>
			<li>フロントスライディングウィンドウを手動で開き、必要に応じてチューブを補充します。</li>
			<li>フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。</li>
			<li>[ 補充完了 ]ボタンをクリックします。</li>
			<li>[ 補充設定 ]ボタンをクリックし、補充の情報を入力して、[ 登録 ]ボタンをクリックします。[ 閉じる ] ボタンをクリックします。</li>
		</ol></li>
		<li>中程度<ol><li>[ 中] ボタンをクリックします。ソフトウェアの[ 補充 ]ボタンを選択します。</li>
			<li>ユーザーが補充する 3 つのラックから 1 つを選択します。[ 補充開始 ]ボタンをクリックします。</li>
			<li>培地保管エリアの蓋が開けられたことを確認したら、前面のスライドウィンドウを手動で開き、培地を補充します。</li>
			<li>フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。</li>
			<li>[ 補充完了 ]ボタンをクリックします。</li>
			<li>[ 補充 ]ボタンをクリックし、培地の名前や量など、培地の情報を入力します。必要に応じて、追加のコメントを入力します。</li>
			<li>「 登録 」ボタンをクリックします。</li>
			<li>[ 閉じる ] ボタンをクリックします。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. タスクの選択
<ol><li>ソフトウェアのトップ画面にある [タスク ]ボタンをクリックします。</li>
	<li>[ タスク設定 ]ボタンを選択します。タスクリストから目的のタスクを選択し、「 次のステップ 」ボタンをクリックします。</li>
	<li>タスクを実行する日時を指定し、[ 登録 ]ボタンをクリックします。タスクを実行する皿またはプレートを選択し、[ 登録 ]ボタンをクリックします。</li>
	<li>選択したタスクを再確認したら、[ 登録 ]ボタンをクリックします。次の画面でタスクが登録されていることを確認します。</li>
	<li>必要に応じて、次のタスクも同じように設定します。</li>
	<li>最後にある[ スタート ]ボタンをクリックします。その後、タスクは指定された日時に自動的に開始されます。 注意: すべてのタスクが終了した直後に、UVライト(フードの両側にあります)が自動的にオンになり、5〜30分後に補助設定に従ってオフになり、フードを無菌状態に保ちます。停止するには、ユーザーは [開始 ] ボタンをクリックします。</li>
	<li>スケジュールされたタスクを事前にキャンセルする場合は、[ 停止 ] ボタンをクリックします。</li>
	<li>中止するタスクを選択したら、[ タスクの編集 ]ボタンをクリックします。</li>
	<li>[ タスクのキャンセル ]ボタンをクリックします。次の画面でタスクが削除されたことを確認します。</li>
</ol>5.セルの画像を確認します
<ol><li>すべての作業には、作業の前後に顕微鏡観察(写真を撮る)が含まれます。細胞培養の進行を写真で観察するには、各タスクの前後に顕微鏡撮影のタスクを組み込みます。</li>
	<li>ディッシュやウェルプレートの複数の特定の位置を事前に選択して定点観察し、同じ場所を経時的に監視するなど、事前に設定されたタスクプログラムを選択します。</li>
</ol>6. 継代と分化
<ol><li>セクション 1 から 5 の手順に従って、継代と分化を実行するように自動細胞培養システムを設定します。継代、心筋細胞分化、肝細胞分化、神経前駆細胞分化、およびケラチノサイト分化の機器設定を、それぞれ 表1、表2、表3、表4、 および表5に示します。</li>
</ol>

自動培養システムによる多能性幹細胞分化の誘導

<ol><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pharmacologic+testing+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).</li>
<li>Egashira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+characterization+using+LQTS-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).</li>
<li>Sasamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+robust+platform+for+induced+pluripotent+stem+cell+research+using+Maholo+LabDroid%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+technology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid.</a> SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).</li>
<li>Tristan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+high-throughput+biomanufacturing+and+functional+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).</li>
<li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific Reports. 5, 16647(2015).</li>
<li>McClymont, D. W., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((With+all+due+respect+to+Maholo%2C+lab+automation+isn%27t+anthropomorphic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).</li>
<li>Gonzalez, F., Zalewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+joint-level+robot+programming+with+a+new+robotics+software+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Robotics%22%5BJournal%5D)">Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool.</a> Robotics. 6 (4), 41(2017).</li>
<li>Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+automated+culture+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cell+maintenance+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990(2022).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+oxidation+is+indispensable+for+survival+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li>
<li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22JMA+journal%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li>
<li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+and+simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).</li>
<li>Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+keratinocyte-like+cells+for+research+on+Protease-Activated+Receptor+2+in+nonhistaminergic+cascades+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li>
<li>Keller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+factors+which+modulate+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

プロトコルの重要なステップは、ユーザーが障害を見つけた場合、いつでもキャンセル、停止、またはリセットボタンをクリックして、最初のステップからやり直すことです。このソフトウェアは、ダブルブッキング、システムタスクがアクティブなときにドアを開ける、補充の欠如などの人為的ミスを回避できます。目的の体細胞への分化を成功させ、効率的に行うためのもう一つの重要なポイントは、各多能性幹細胞がその分化特性に制御不能なバイアスを持っているため、多能性幹細胞株の適切な選択である14,15。
人工多能性幹細胞の自動培養システムは、多能性幹細胞を維持し、様々な体細胞タイプに分化させることができます。このシステムのサイズは、幅200cm、奥行き110cm、高さ233cmで、総重量は1.2トンです。装置に内蔵されたインキュベーターは、36枚の10cm皿と9枚のマルチウェルプレートを同時に保持することができます。
従来機から改良されたのは、まずハンドリングアームとして、アームの先端ツールをディッシュ、チューブ、ピペットの3つのパーツに変更することで機能する6軸多関節アームからX-Y-Z軸レールシステムを新たに変換したことです。アームはシステムの天井から吊り下げられ、X-Y-Z軸に沿って移動します。第二に、フィーダーフリーの維持培養と、継代から連続的に実施される分化誘導プロトコルのために、細胞計数システムを導入しました。単一細胞懸濁液をトリパンブルー溶液と混合した後、顕微鏡観察およびイメージングのために使い捨て血球計算盤に移した。ソフトウェアは、得られた画像を自動的に解析して生細胞の数をカウントし、必要な数の細胞をシードするために必要な体積を計算します。この画像解析によって得られた細胞数の精度は、手作業で得られたものと一致していました。
X-Y-Z軸レールシステムは、以前のバージョン(多軸多関節アーム)よりも各タスクを迅速に処理するために適用されました。この自動培養システムでは、5回の継代を16日間連続して行い、iPS細胞を625倍±93倍に拡大しました。フィーダーセルを使用しない場合の細胞維持時の耐久性の証明は、前回のフィーダーセルを用いた実証よりも短いものの、細胞増殖は前回の実証6に比べて効率的であった。作業時間の短縮は、作業中の細胞の乾燥防止に寄与していると考えられます。 
さらに、維持培養から心筋細胞、肝細胞、神経細胞前駆細胞、ケラチノサイトへの分化までの分化作業をヒトの介入なしに行いました。これらの一連のコースの後、蛍光免疫染色により、自動培養システムのみで得られた細胞が目的の細胞に分化していることが確認されました。そこで、タスクプログラムを共有し、このシステムを利用することで、iPS細胞管理に不慣れな研究者でも、iPS細胞由来の体細胞を入手して、自分の研究に役立てることができます。また、研究者間や施設間の再現性の差を極力なくし、毎回均質な品質の細胞を確実に得ることができます。
新レールシステムの採用により、従来より~200kg軽量な1.2トンと小型化・軽量化を実現しました。さらに、部品やプログラムの設定コストを約10,000米ドル削減することができます。メンテナンスとプログラミングのコストは13%削減されると推定されています。より多くの研究者がiPS細胞関連の研究に気軽に参入する動機付けとなるためには、装置コストを低く抑えることも重要です6。今後は、現行および次世代の自動培養システムが、iPS細胞やiPS細胞由来分化細胞をより均一な品質で提供する一助となることを期待しています。 
このシステムの主な制限は、培養液の暫定保存容量が限られていることと、少量の液体(<100μL)を扱うのが苦手であることです。さらに、高度な人工知能がないため、オンタイムセルの状態に応じた自動最適化が無効になります。些細な制限は、システムメーカーが提供する特別なピペットチップの要件です4,5。培地製剤の少量の液体を扱える次世代の培養システムや、高性能人工知能(システム学習)によるフィードバック最適化システムの開発を進めています。当社の協力メーカー9は、ユーザーの特別なニーズに応じてカスタムメイドのシステムを構築するのに十分なノウハウを持っています。これに加えて、より汎用的で幅広い機能を搭載した次世代システムが間もなく市場に出回る予定です。また、すべてのユーザーに最新のシステムを提供するサブスクリプションベースのレンタルシステムも検討しています。

本稿では、企業と共同で作製したヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の自動培養システムについて、実際の詳細な取り扱い手順と代表的な成果を示すことを目的としています。
2007年の論文発表以来、iPS細胞は世界中で注目を集めています1。あらゆる体細胞に分化できるという最大の特徴から、再生医療、難治性疾患の原因解明、新規治療薬の開発など、さまざまな分野への応用が期待されています2,3。また、ヒトiPS細胞由来の体細胞を用いることで、倫理的制約の大きい動物実験を減らすことができます。iPS細胞を用いた新しい方法の研究には、常に多くの均質なiPS細胞が必要ですが、その管理は手間がかかります。また、iPS細胞は感度が高いため、微妙な文化や環境の変化にも敏感に反応するため、取り扱いが困難です。
この問題を解決するために、自動化された培養システムが人間の代わりにタスクを実行することが期待されています。いくつかのグループは、細胞の維持と分化のためのいくつかの自動化されたヒト多能性幹細胞培養システムを開発し、その成果を発表しました4,5,6。これらのシステムは、多関節ロボットアームを装備しています。ロボットアームは、人間の腕の動きを高度に模倣するというメリットがあるだけでなく、アームのコストが高く、システムのパッケージングが大きくて重く、目的の動きを得るためにエンジニアの教育に時間がかかるというデメリットもあります7,8。経済的、スペース的、人的資源の消費の点で、より多くの研究施設に装置を導入しやすくするために、iPS細胞を様々な細胞種に維持・分化するための新しい自動培養システムを開発しました9。
新しいシステムの理論的根拠は、多関節ロボットアーム9の代わりにX-Y-Z軸レールシステムを採用することでした。ロボットアームの複雑な手のような機能を置き換えるために、3種類の特定の機能アームの先端を自動的に変更できるという新しいアイデアを適用しました。また、ここでは、プロセス全体を通してエンジニアの貢献が要求されないため、ユーザーがソフトウェア上で簡単な注文でタスクスケジュールを簡単に作成できることも示します。
ロボット培養システムの1つでは、96ウェルプレートを分化のための3D細胞凝集体として使用して胚様体を作ることを実証しました4。ここで報告するシステムでは、96 ウェルプレートを処理できません。1つは、ヒト多能性幹細胞ではなかったが、細胞株を用いて現在の適正製造基準(cGMP)グレードを達成した5。ここで詳述する自動培養システムは、実験室での実験を支援することを特に目的として開発されました(図1)。但しそれはレベルIVの安全キャビネットと同等のきれいなレベルを保つ十分なシステムを有する。

<table><tbody><tr><td>0.15% ウシ血清アルブミン画分 V</td><td>富士フイルム和光化学工業株式会社, 宮崎</td>県<td>, 日本 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>1% GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>10 cm プラスチックプレート </td><td>Corning Inc., NY, United States</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>253G1</td><td>RKEN Bioresource Research Center</td><td>HPS0002</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Actinin  マウス</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Activin A </td><td>Nacali Tesque</td><td>18585-81</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14906.30</td><td></td></tr><tr><td>Albumin  ウサギ</td><td>Dako</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>All-trans Retinoic acid</td><td>富士フイルム 和光化学工業</td><td>186-01114</td><td></td></tr><tr><td>全自動培養システム</td><td>パナソニック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27サプリメント</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>富士フイルム和光化学工業株式会社 </td><td>062-06661</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PHC9531</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>メルク</td><td>810037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 </td><td>MCE, NJ, United States #HY-10182</td><td>252917-06-9</td><td></td></tr><tr><td>Defined Keratinocyte-SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10744019</td><td>Human keratinocyte medium</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Merck</td><td>266785</td><td></td></tr><tr><td>Dihexa </td><td>TRC、オンタリオ州、カナダ</td><td>13071-60-8</td><td>rac-1,2-ジヘキサデシルグリセロール</td></tr><tr><td>使い捨て血球計算盤</td><td>CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1219168-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's モディファイドイーグルミディアム/F12 </td><td>富士フイルム和光ケミカル株式会社</td><td></td><td></td>12634010</tr><tr><td>EGF</td><td>富士フイルム和光化学工業(株) </td><td>053-07751</td><td></td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1517001</td><td>ヒト多能性幹細胞培地</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 </td><td>Biowest、FL、米国</td><td>S140T</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic </td><td>ナカライテスク株式会社</td><td>19155-07</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>J63292。</td><td></td>MF</tr><tr><td>グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030081</td><td>グルタミンサプリメント</td></tr><tr><td>ヤギ IgG(H+L) AlexaFluo546</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>A11056</td><td></td></tr><tr><td>HNF-4A  ヤギ</td><td>サンタクルス</td><td>6556</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A16292.06</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン 21-ヘミスコハク酸</td><td>メルク</td><td>H2882</td><td></td></tr><tr><td>iMatrix511 シルク </td><td>ニッピ株式会社</td><td>892 021</td><td>細胞培養マトリックス</td></tr><tr><td>インスリントランスフェリンセレン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>ケラチン 1  マウス</td><td>サンタクルス</td><td>376224</td><td></td></tr><tr><td>ケラチン 10 KMUR001; ウサギ</td><td>BioLegend</td><td>19054</td><td></td></tr><tr><td>関西</td><td>医科大学 </td><td></td><td>患者由来iPS細胞 </td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸 2-リン酸 </td><td>A8960、メルク</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>リーボビッツ's L-15 ミディアム </td><td>富士フイルム和光ケミカル株式会社</td><td>128-06075</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング株式会社</td><td></td><td></td>354277</tr><tr><td>マウス IgG(H+L) AlexaFluo488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific Scientific 17502048</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin mouse</td><td>Santacruz</td><td>23927</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament  rabbit</td><td>Chemicon</td><td>AB1987</td><td></td></tr><tr><td>ニュートリステム</td><td>・サルトリウスAG、Göttingen, Germany</td><td>05-100-1A</td><td>細胞培養培地 </td></tr><tr><td>10月3/4  マウス</td><td>BD</td><td>611202</td><td></td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10040</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトアルブミン </td><td>A0237, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Rhoキナーゼ阻害剤, Y-27632 </td><td>株式会社セレック</td><td>〒129830-38-2</td><td></td></tr><tr><td>理化学研究所 2階</td><td>RKEN バイオリソース研究センター</td><td>HPS0014</td><td>未分化 iPS細胞 </td></tr><tr><td>RPMI 1640 </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック#11875</td><td>12633020</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>301836-41-9</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸ナトリウム</td><td>メルク</td><td>A4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4  マウス</td><td>ミリポア</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>StemFit AK02N </td><td>味の素、東京、日本</td><td>AK02</td><td>細胞培養液 </td></tr><tr><td>TnT ウサギ</td><td>Abcam</td><td>ab92546</td><td></td></tr><tr><td>TRA 1-81 マウス</td><td>ミリポア</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>トリヨードチロニン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H34068.06</td><td></td></tr><tr><td>TripLETM 発現酵素 </td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 </td><td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td><td>20577-34</td><td></td></tr><tr><td>リン酸トリプトースブロス</td><td>メルク</td><td>T8782-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-C59 </td><td>Bio-techne、NB、イギリス</td><td>5148</td><td></td></tr><tr><td>&amp;ベータ; <img alt="方程式1" src="/files/ftp_upload/65672/65672eq01v2.jpg" style="マージン: auto;"> チューブリン マウス</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

無限の自己増殖能力を持つヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、希少疾患の病態解明、新薬開発、損傷臓器の修復を目的とした再生医療など、多くの分野での応用が期待されています。しかし、iPS細胞の社会実装はまだまだ限定的です。これは、iPS細胞が微細な環境変化に対して高い感度を持つため、高度な知識や高度な技術をもってしても、培養における分化の再現が困難であることも一因です。自動培養システムの適用により、この問題を解決できます。研究者の技量によらず、再現性の高い実験が、各機関で共通の手順で実施されることが期待されます。iPS細胞の培養を維持し、分化を誘導できる自動培養システムはこれまでにもいくつか開発されていますが、これらのシステムは、ヒト化された多関節ロボットアームを使用するため、重く、大きく、コストがかかります。上記の課題を改善すべく、シンプルなX-Y-Z軸スライドレール方式を採用し、小型・軽量・安価化を実現した新システムを開発しました。さらに、ユーザーは新しいシステムのパラメータを簡単に変更して、新しい処理タスクを開発することができます。タスクが決まれば、あとはiPS細胞を準備し、目的のタスクに必要な試薬や消耗品を事前に用意し、タスク番号を選択し、時間を指定するだけです。このシステムにより、iPS細胞をフィーダー細胞を使わずに数回継代で未分化状態に維持し、心筋細胞、肝細胞、神経前駆細胞、ケラチノサイトなど様々な細胞種に分化できることを確認しました。これにより、熟練した研究者を必要とせず、施設間で再現性の高い実験が可能となり、新規参入の障壁が減り、より幅広い研究分野でのiPS細胞の社会実装が促進されます。

ヒト人工多能性幹細胞の維持 3系統(理研-2F、253G1、KMUR001)を用いた。日々の手作業による実験でメンテナンスプロトコルを最適化し、さらにシステムによる7回の予備実験で詳細なプログラムを最適化しました。たとえば、人間とシステムが扱う異なるピペットからのスピットフローの液体速度によって引き起こされるせん断応力は大きく異なります。そこで、酵素消化の時間の長さと、システムによる細胞分散のためのピペッティング回数を最適化しました。
ヒト人工多能性幹細胞を、0.5 μg/cm2 細胞培養マトリックスでコーティングした 10 cm のディッシュと iPS細胞培養培地 (Neutristem や StemFit AK02N など) で維持しました。継代については、5 mLのカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS[-])でhiPS細胞を3回洗浄し、次に3 mLのTrypLE Express酵素に10 μMのRhoキナーゼ阻害剤(Y-27632)を添加して37°Cで15分間処理するようにプログラムしました。 その後、9 mLのPBS(-)と0.15%ウシ血清アルブミン画分V(BSA)をプレートに添加し、10 mLの細胞含有液体を吸引し、プレート表面に20°傾けたプレートの上部を横切ってジグザグにピペットチップから液体を分注する2セットの動作を行いました。 そして、プレートを反対側に20°傾けて上記の一連の操作を繰り返した。次に、細胞含有培地を 15 mL のチューブに回収して蓋をし、その後、115 x g で 5 分間遠心分離して細胞を堆積させました。その後、上清を吸引し、10 μM Y-27632を含む10 mLの培養培地を用いて、10回のピペッティングにより細胞ペレットを単一細胞に分散させた。1 mL のトリパンブルー溶液を新しい 15 mL チューブに移し、次に 1 mL の細胞懸濁液を加え、ピペッティングで 5 回混合しました。その後、100μLのトリパン青色染色細胞溶液を吸引し、ホルダー内の使い捨て血球計算盤の入口窓に分注した。血球計算盤ホルダーを顕微鏡観察エリアに移動させ、写真を撮影したところ、すぐにソフトウェアで解析し、得られた細胞濃度を次のステップに適用しました。iPS細胞の維持のために、0.5 μg/cm2の細胞培養マトリックスでコーティングされた直径10 cmの新しいプラスチックプレートに、細胞密度15,000細胞/cm2で細胞を播種しました。分化実験では、1/100に希釈した細胞培養マトリックスでコーティングした6ウェルプレートに、体細胞タイプごとに調製した培地に、必要な細胞密度で細胞を播種しました。最後に、プレートをインキュベーターに移す前に、システムはクロスロックを5回実行しました。iPS細胞が入った10cmプレートを新たに3枚、細胞培養マトリックスをプレコートしたプレート3枚を装填し、その他必要物も上記の手順で準備しました。維持培養の1サイクルは、1日目の継代作業とそれに続く1日1回の培地交換を3日間行います。実験全体を通して、このサイクルは5サイクルに設定されました。さらに、消耗品も順番に補充されました。
指示されたスケジュールに従って、5 サイクルのメンテナンス培養がシステムによって計画どおりに正常に実行されました。各作業中に自動撮影された細胞写真から、細胞が経時的にスムーズに増殖していることが確認されました。セルの膨張(n = 3)を計算し、 図2に示しました。iPS細胞の未分化状態が自動培養システムで維持培養後も変わらないかを確認するため、継代ごとに残った試料を用いて免疫細胞解析(Oct3/4およびSSEA4)を行いました(図3A)。さらに、5サイクル後、3つのディッシュをシステムからアンロードし、免疫組織化学的分析(Oct3/4、SSEA4、およびTra1-81)も行いました(図3B)。いずれも蛍光免疫染色を用いた解析では、iPS細胞の未分化状態が保たれていることが分かりました。iPS細胞の核型決定は、自動培養システムでの維持培養の前後にも行いました。維持培養開始前の17番染色体対立遺伝子に異常が認められたが、5回の維持培養後、異常を含めて特に変化は認められなかった(図3C)。iPS細胞のメンテナンスに用いる設定を 表1にまとめました。
区別 心筋細胞 前の出版物からの微分プロトコルはここに続いた10.未分化ヒトiPS細胞(KMUR001)を30,000細胞/cm2 の密度で、iPS細胞培養液にマトリックスコーティングした6ウェルプレート上に播種し、10μMのY-27632を添加しました。3日後(分化1日目)に、6 μMのGSK-3β阻害剤CHIR-99021、20 ng/mLのアクチビンA、および10 ng/mLのBMP4を含むヒト多能性幹細胞培地に培地を変更しました。分化 3 日目に、システムは CDM3 培地(RPMI 1640、500 μg/mL 組換えヒトアルブミン、213 μg/mL L-アスコルビン酸 2-リン酸と 2 μM Wnt-C59)に変更しました。分化5日目に、システムは新鮮なCDM3培地に変更されました。以後、1日おきに新鮮なCDM3培地への交換を繰り返した。iPS細胞の心筋細胞分化に用いる設定を 表2にまとめました。
肝細胞 前の出版物からの微分プロトコルはここに続いた11.未分化のiPS細胞(RIKEN2F)を、10μMのY-27632を添加したiPS細胞培養培地の細胞培養マトリックスコーティング6ウェルプレート上に、25,000細胞/cm2 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65672/65672fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/65672fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65672/65672fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/65672fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65672/65672fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/65672fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65672/65672fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/65672fig04large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/Table%201%20(Passage)%20.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/Table%202%20(cardiomyocytes).xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/Table%203%20(hepatocytes).xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/Table%204%20(Neural%20cells).xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/Table%205%20(keratinocytes)%20.xlsx" target="_blank"></a>

ここでは、自動細胞培養システムのプロトコールを紹介します。この自動培養システムは、iPS細胞の維持管理から各種細胞への分化まで、人工多能性幹細胞(iPS細胞)の取り扱いに不慣れな研究者など、ユーザーの手間を軽減し、メリットがあります。

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

本研究では、iPS細胞の培養を自動化することに着目しています。より小型で安価な装置を活用することで、手作業による実験や人手によるばらつきを減らし、再現性を高め、iPS細胞に馴染みのない研究者にも機会を提供することを目標としています。自動培養機は数種類登場していますが、そのほとんどはまだ大型でコストがかかり、部分的な作業しかできません。作業壷の構造がシンプルになったことで、機器のサイズとコストが削減されました。また、細胞のメンテナンスから分化誘導までを、事前の材料調製とソフトウェア上でのタスク設定のみで自動で行うことができます。機械による反復は、人間が行う反復に比べて非常に正確です。このような機械を使用することで、リピート操作性が向上するだけでなく、人手も削減されます。さらに、各プロトコールのパラメータを共有すれば、iPS細胞に不慣れな研究者でも、経験豊富な研究者と同様の結果が得られ、iPS細胞を用いた研究に容易に参入することが可能になります。実験結果の学習から、次の作業スケジュールや設定日、作業内容の選択を自動化するAI画像判定システムの導入の可能性を模索しています。また、研究者が自分の好みに合わせて作業プロトコルを調整し、オンラインで共有できるようにすることで、世界中の研究者間の再現性が高まるだけでなく、グローバルな研究協力が促進されることを期待しています。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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学ぶヒトiPS細胞の自動培養システムによる維持・分化プロトコル。小型で低コストな装置により再現性を向上させ、経験の浅い研究者も高度な細胞培養技術を活用できる画期的な手法です。

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

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