Name: 単一核マルチオームアッセイのための高品質脳および骨髄核調製(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぶ、マウスの脳と骨髄組織から高純度核を単離する最適化プロトコル。フローサイトメトリーと自動細胞計数を用いて、単一核マルチオームアッセイの品質を向上させる方法を解説します。

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Ana Jeemin Choiは、パスツール-パリ大学(PPU)国際博士課程プログラムからの奨学金を受けました。

Multiome 10X Genomics 解析のための高品質サンプル調製

<ol><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+technologies+and+data+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental & Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li>
<li>Cerrizuela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scNMT+protocol+for+multiomics+profiling+of+single+cells+from+mouse+brain+and+pancreatic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101555(2022).</li>
<li>Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics+techniques%3A+From+conception+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics techniques: From conception to applications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317(2022).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+chromatin+accessibility+and+gene+expression+in+thousands+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells.</a> Science (New York, N.Y.). 361 (6409), 1380-1385 (2018).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+Isolation+from+Fresh+Frozen+Brain+Tumors+for+Single-Nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61542(2020).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomics+reveals+functional+compartmentalization+in+syncytial+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 6375(2020).</li>
<li>Santos, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+sequencing+of+single+nuclei+from+murine+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100694(2021).</li>
<li>Safabakhsh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nuclei+from+frozen+human+heart+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Current Protocols. 2 (7), e480(2022).</li>
<li>Lau, S. -F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptome+analysis+reveals+dysregulation+of+angiogenic+endothelial+cells+and+neuroprotective+glia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li>
<li>Morabito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+chromatin+accessibility+and+transcriptomic+characterization+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease.</a> Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+transcriptomics+reveals+genes+associated+with+the+vulnerability+of+middle+temporal+gyrus+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 188(2022).</li>
<li>Paul, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+heterogeneity+and+lineage+commitment+in+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors.</a> Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).</li>
<li>Kaufmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCG+educates+hematopoietic+stem+cells+to+generate+protective+innate+immunity+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis.</a> Cell. 172 (1-2), 176-190.e19 (2018).</li>
<li>Christ, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+diet+triggers+NLRP3-dependent+innate+immune+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Western diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming.</a> Cell. 172 (1-2), 162-175.e14 (2018).</li>
<li>Moorlag, S. J. C. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Glucan+Induces+protective+trained+immunity+against+mycobacterium+tuberculosis+infection%3A+A+key+role+for+IL-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">β-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1.</a> Cell Reports. 31 (7), 107634(2020).</li>
<li>de Laval, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP%CE%B2-dependent+epigenetic+memory+induces+trained+immunity+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">C/EBPβ-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674.e8 (2020).</li>
<li>Renthal, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+mosaic+Rett+syndrome+brain+tissue+by+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).</li>
<li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brain+vascular+atlas+reveals+diverse+mediators+of+Alzheimer%27s+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk.</a> Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).</li>
<li>Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+single-cell+and+single-nuclei+suspensions+from+embryonic+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains.</a> STAR Protocols. 4 (1), 101944(2022).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Ranzoni, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+single-cell+RNA-seq+and+ATAC-seq+analysis+of+human+developmental+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487.e7 (2021).</li>
<li>10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide, Document Number CG000338 Rev F. , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2022).</li>
<li>Meyerhoff,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022).</li>
<li>Haag, S., Murthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+monocyte+and+macrophage+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Murine monocyte and macrophage culture.</a> Bio-Protocol. 11 (6), e3928(2021).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lönnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Jiang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Quality control of single-cell RNA-seq.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 1935, 1-9 (2019).</li>
<li>Regan, C., Preall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for single-cell genomics.</a> Current Protocols. 2 (8), e498(2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). , At 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing</a> (2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide</a> (2022).</li>
<li>Shomroni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+RNA-sequencing+approach+and+its+applicability+connecting+genotype+to+phenotype+in+ageing+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 4091(2022).</li>
<li>Ocañas, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+ex+vivo+confounds+of+cell-isolation+techniques+on+transcriptomic+and+translatomic+profiles+of+purified+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia.</a> eNeuro. 9 (2), (2022).</li>
<li>Gérard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+activity-based+screening+and+sequencing+of+antibodies+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics.</a> Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).</li>
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著者は何も開示していません。

高品質の細胞または核懸濁液の調製は、単一細胞または単一核のRNA-Seqおよび単一細胞のマルチオミクス解析の成功にとって非常に重要です29,30,31。ここでは、脳と骨髄の2種類の組織からのマルチオームアッセイのためのサンプル調製と核単離のプロトコルについて説明しました。
この論文で説明されている脳プロトコルは、新鮮凍結された脳組織から高品質の核を回収することを可能にします。これには、凍結組織破壊、核の単離、核の精製、および調製された材料の品質管理のステップが含まれます。脳組織は多くの異なる種類の細胞で構成されており、組織の解離と核の分離の手順により、初期組織に存在する細胞集団の割合が維持されるはずです。ここでは、溶解バッファーの組成とインキュベーション時間を最適化して、組織を構成するすべての細胞集団を完全かつ穏やかに溶解できるようにしました。
骨髄HSPCのプロトコルは、実験の開始時に、不均一な細胞懸濁液から目的の細胞集団を単離するために1つの追加ステップを必要とするため、多少異なります。新鮮な組織を採取した後、赤血球を溶解し、サンプルを目的の細胞サブセットに濃縮します。標的細胞を溶解し、核を単離し、調製した材料の品質を制御します。
10X Genomicsは、多数の異なる組織における核分離について検証されたいくつかのプロトコルを提供する32,33。同社はまた、検証された組織から核を単離するための簡単なパイプラインを備えた核分離キットを商品化している34。ただし、これらのプロトコルでは、特定のサンプルの特殊性を調整するために、追加の最適化が必要です。たとえば、低いセル入力で作業する必要があるサンプルです。これらのサンプルの場合、最も困難なステップは遠心分離であり、サンプルを洗浄するのに十分な厳格さと、細胞/核の損失を回避するのに十分なほど穏やかな遠心分離が必要です。ここで説明するプロトコルでは、10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 を適応させ、これら 2 つの要件の微妙なバランスを見つけました。選別したHSPCから核を作製した例で示したように、サンプルの品質に影響を与えることなく、核の回収率を向上させました。
さらなる課題は、核単離のための精製細胞の溶解のステップです。より厳しい溶解条件と長いインキュベーション時間は、核を損傷し、それによってシーケンシングデータの品質に影響を与える可能性があります。 図5 は、溶解バッファーとの異なるインキュベーション時間における骨髄サンプルからの代表的な核イメージングを示しており、細胞溶解によって核の状態がどのように異なるかを示しています。HSPCの例では、健康そうに見える無傷の核の割合が最も高く、損傷した核の割合が最も低くなる状態として、3分間の溶解を特定しました。溶解インキュベーション時間は、新しいタイプのサンプルごとに最適化する必要があります。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig05.jpg"> 図5:顕微鏡による核の品質管理。 (A)無傷の核と(B)損傷した核を持つマウス骨髄から単離された核の代表的な明視野画像を示します。スケールバー5μm。画像は倒立顕微鏡で撮影し、40倍ELWD NA 0.60対物レンズと1.5倍デジタルズームを使用しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
この作業で詳述されている両方のプロトコルは、ハイスループットFACS装置による標的細胞または核の精製に依存しています。このステップは、細胞のまれなサブセットを不均一な懸濁液から単離する単一細胞/核調製プロトコルにとって非常に重要です。これらのケースでは、HSPCのソーティングに示した例のように、目的の細胞集団の「ゲーティング」を可能にするために、高次元のフローサイトメトリーパネルが必要になる場合があります。選別は非常に高速かつ正確で、選別された細胞サブセットの純度は95%を超えます。このアプローチは、細胞懸濁液を最大70psiの圧力にさらすため、細胞膜の破裂を引き起こす可能性があるため、脆弱な細胞(樹状細胞、好中球など)の選別を制限する可能性があります。このような場合、細胞精製には、磁気選別、新世代機器(CellenOne、Cellenionなど)の適用など、代替溶液を選択する必要があります。MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36、または液滴ベースのシステム(ODIN、Sensificなど)37。それにもかかわらず、これらの技術のソーティング速度は遅く、細胞の選別は数分ではなく数時間続くため、多数の細胞の解析に基づくMultiomeやその他のシングルセルアプリケーション用の生細胞の調製にこれらのアプローチを適用する際の強力な制限要因となっています。
組織から単離された核の精製には、そのスループットと単離された材料の純度から、FACSが最適な方法です。核は圧力に敏感ではなく、ろ過された組織分離株はセルソーターで簡単に精製できます。実験室にFACS機器が装備されていない場合は、他の代替手段が存在し、やや効率は劣りますが、十分に優れています。例としては、超遠心分離や、音波を使用して粒子のサイズの違いに基づいて粒子を分離するMARS(アプライドセル)などの小型機器の使用が含まれます。細胞/核懸濁液の疎水性を利用したCURIOX層流洗浄機。または、細胞の物理的特性(浮遊)に依存して細胞を破片から分離するLEVITAS bio。
ここでは、ダウンストリームのMultiomeプロトコルに多数の核と最適な純度を得るためのプロトコルについて説明します。FACSによる選別と遠心分離の繰り返しは、最初の材料の大幅な損失をもたらします。このため、ここで説明する脳からの核調製プロトコルでは、FACSソーティング後に少なくとも500,000個の核を収集するのに十分な量の出発物質が必要です。この基準が一致しない場合は、代替プロトコルを適用する必要があります。稀な細胞集団や小さな組織切片を扱う場合、利用可能な初期物質の量が制限要因となる可能性があります。この問題に対処するために、(a)溶解量を減らす、(b)洗浄量を減らす、(c)遠心分離時間を延長した1回の洗浄で回収率を向上させることで、低細胞入力核単離のための10X Genomicsプロトコルに示されているように、核の回収率を向上させることができます。低含有量材料のマルチオミクス解析には、scNMT、SNARE-seq、Paired-seq38 など、必要なインプットサンプルがはるかに少ないプレートベースのアプリケーションを検討する価値があります。
要約すると、ダウンストリームマルチオーム解析用の脳および骨髄HSPCからの核調製のための2つの堅牢なプロトコルについて説明しました。これらのプロトコルは、提起された科学的な問題に関係なく、これら2種類の組織から高品質の単核懸濁液を必要とするあらゆる科学プロジェクトに適用できます。私たちのグループでは、脳核単離プロトコルを、様々な標的遺伝子の不活性化による脳の発生研究や、神経疾患における免疫応答の研究に応用しています。私たちは、骨髄核単離プロトコルを使用して、免疫系の確立におけるさまざまな造血亜集団の関与を解読しています。

長年にわたり、シングルセル技術は生物学的プロセスの分析のゴールドスタンダードでした。当初は、顕微鏡検査、フローサイトメトリー、および同様のアッセイによる単一細胞表現型に限定されていました。シングルセル解析におけるブレークスルーは、シングルセル分子プロファイリングのアプローチ、特に個々の細胞のトランスクリプトーム全体の特性評価を可能にするシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-Seq)の開発によってもたらされました。非常に強力なscRNA-Seqは、特定の条件と時点における細胞の転写状態に関する情報を生成します。しかし、転写を駆動する遺伝子制御や、時間の経過とともに起こる分子修飾については可視化できません。この制限を克服するために、同じ細胞から複数の因子やプロセスを解析できるシングルセルマルチオミクスアッセイの開発に多くの努力が払われてきました1,2,3,4。単一細胞内の2つのモダリティの測定に初めて成功したのは、CITE-Seqアプローチ5において、マルチプレックス表面タンパク質発現パターンを個々の細胞の完全なトランスクリプトームと結びつけることでした。最近の進化では、遺伝子発現とクロマチンアクセシビリティが組み合わされ(シーケンシングを用いたトランスポザーゼアクセス可能クロマチンアッセイ、ATAC-Seq)、それによって同じ細胞内のトランスクリプトームモダリティとエピゲノムモダリティを同時に捕捉するようになりました(例:sci-CAR)6。トランスクリプトミクスを細胞の表現型または同じ細胞のエピジェネティックな変化と関連付けることを可能にした最初の商用ソリューションは、10X Genomicsから生まれました。
単一細胞分子プロファイリングのための実験には、以下のステップが含まれます:(1)組織の解離または単一細胞懸濁液の調製;(2)細胞精製および/または核単離。(3)パーティショニングとバーコード化。(4)図書館の建設と品質管理。(5)次世代シーケンシング;(6)データ分析。ステップ(3)〜(6)は、採用する技術によって大きく異なる場合がありますが、最初のステップは一般的にそれらすべてに共通です。調製された細胞/核懸濁液の品質は、実験の全体的な結果を決定します。組織の種類によっては、高品質の単一細胞/核懸濁液を得ることが困難な場合があります。心臓、筋肉、脳、肺、腸などの一部の組織の特殊性により、分子分析用の高品質の核の産生を保証するために、各タイプのサンプルに適合した組織破壊および核分離の方法が必要です7,8,9,10 .組織破壊法および解離プロトコルは、機械的、酵素的(例えば、コラゲナーゼとDNaseの混合物)、または2つの組み合わせであり、手動または器具(例えば、Qiagen DSC-400、gentleMACS)によって行うことができる。
シングルセル技術は、生物医学研究に最適なツールとなっています。神経生物学では、脳内の細胞の多様性とその機能の複雑さにより、希少な細胞集団を可視化し、それらの不均一性を評価するために、高解像度およびハイスループット分析が必要です11,12,13,14。細胞の同一性と個々の細胞の遺伝子制御機構を結びつけることで、脳の発達と生理学に関する洞察が得られます。別の例としては、感染性疾患、自己免疫疾患、または癌性疾患における免疫応答の研究があり、これは単一細胞解析に強く依存しています。免疫細胞サブセットの不均一性、その活性の複雑さ、他の細胞タイプとの相互作用により、免疫応答の根底にあるメカニズムを解読するには、単一細胞の分解能が必要です。免疫細胞は骨髄に由来し、造血前駆細胞は徐々に分化する細胞で構成されており、骨髄から末梢の家に出る前に、段階的なプロセスを通じて細胞表面マーカーを獲得および喪失します。シングルセル解析により、細胞の発生段階を詳細に評価することができます。これは、従来マルチパラメーターフローサイトメトリーによって行われていたシングルセル表現型によって達成できます。しかしながら、単一細胞トランスクリプトームシグネチャーは、これらの細胞が互いに分類されるクラスターに分布しており、したがって粗い細胞表面マーカーアプローチを使用するときに誤認される可能性があるため、前駆細胞サブタイプのより正確な同定を明らかにすることが示されている15。造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)がさまざまな薬剤への曝露から獲得できるエピジェネティックな修飾を明らかにする研究が増えており、免疫系の長期的な応答性に大きな影響を与えています16,17,18,19。新しいマルチオミクス技術により、これらのプロセスをシングルセル分解能で研究することができます。
細胞および核の分離のための多くのプロトコルは頭脳11,20,21,22および骨髄のサンプル23,24のために記述されている。実験のばらつきによるバイアスを最小限に抑えるには、単一細胞トランスクリプトームおよびエピゲノムシーケンシングの結合用に最適化された単一核調製プロトコルを検証し、それによって単一細胞マルチオミクスアッセイの再現性を確保する必要があります。
ここでは、(1)新鮮凍結脳組織および(2)下流のシングルセルマルチオーム解析用の新鮮骨髄HSPCからの核調製のための2つの堅牢なプロトコルについて説明します(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg"> 図1:新鮮凍結脳および骨髄組織からの核単離のプロトコルの概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>18 G x 1 &frac12;(1.2mm×38mm)アガニ針</td><td>テルモ</td><td>AN*1838S1</td><td></td></tr><tr><td>15 mLチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>5 mL丸底FACSチューブ、セルストレーナーキャップ付き 35 & マイクロ;m</td><td>falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD pharmagen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD117 (c-Kit)</td><td>BioLegend</td><td>105812</td><td>Clone: 2B8</td></tr><tr><td>APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (Fc&gamma;R)</td><td>BioLegend</td><td>101328</td><td>Clone: 93</td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td>non-applicable</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>non-applicable</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&nbsp; Stock Solution 10%</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Cell staining buffer</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>CFISuprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6</td><td>ニコン&nbsp;</td><td>非対応</td><td></td></tr><tr><td>CMOSカメラ Prime 95B 25 mm</td><td>Photometrix</td><td>非対応</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 自動セルカウンター</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slide</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm</td><td>ブランド</td><td>BR470819</td><td></td></tr><tr><td>デジトニン 5%</td><td>Invitrogen</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てメス&nbsp;</td><td>スワン・モートン&nbsp;</td><td>0508</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光倒立顕微鏡 Nikon Ti2 -E</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>適用</td><td></td>外</tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30123603</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>VWR</td><td>83801.290</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD34</td><td>Invitrogen</td><td>11-0341-85</td><td>クローン:RAM34</td></tr><tr><td>解剖用鉗子</td><td>FST</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>11533387</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー2mL</td>ベル<td>コガラス</td><td>1984-10002</td><td>乳棒を転倒 "A&rdquo;大きなクリアランス:.0030-.0050&Prime;と乳棒」B&rdquo;小さなクリアランス:.0005-.0025&Prime;</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液 1 M</td><td>Sigma aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>埋込媒体フルオロマウント-G&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 substitute</td><td>Sigma aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>ThermoFischer</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Nuclei buffer 20x&nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>Nuclei isolation kit EZ prep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NUC-101</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads compensation beads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail (anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119を含む)</td><td>BioLegend</td><td>133310</td><td>クローン(記載されている抗体と同じ順序):17A2、RB6-8C5、M1/70、RA3-6B2、Ter-119</td></tr><tr><td>PCRチューブストリップ0.2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend</td><td>122507</td><td>クローン:E13-161.7</td></tr><tr><td>ペトリ皿 100 mm x 20 mm OPTILUX</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Ply-L-lysine 0.01% 無菌ろ過 細胞培養に適した</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>印刷された顕微鏡スライド 8ウェル 6 mm 番号付き</td><td>Epredia</td><td>ER-301B-CE24</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質 LoBind チューブ 1.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>30108116</td><td></td></tr><tr><td>組換え Rnase 阻害剤 5000 U</td><td>宝</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>解剖用ハサミ</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム溶液 5 M</td><td>Sigma aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター、PES、0.2 &micro;m</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>透明マニキュア&nbsp;</td><td>適用</td><td></td><td></td>できない</tr><tr><td>トリズマ塩酸塩溶液 pH 7.4</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー 0.4%</td><td>ギブコ</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad&nbsp;</td><td></td><td></td>1662404</tr><tr><td>UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free</td><td>Invitrogen</td><td>10977-035</td><td></td></tr></tbody></table>

単一核マルチオームアッセイのための高品質脳および骨髄核調製(英語)

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

シングルセル解析は、治療や感染に対する個々の細胞応答のばらつきをシングルセルの分解能で評価する必要がある生物学的プロセスの複雑さを解明するための最適なアプローチとなっています。 
過去10年間に、単一細胞分子プロファイリングのための多くの技術が開発され、いくつかの専用技術が商業化されています。10X Genomicsの液滴ベースのシングルセルプロファイリングは、トランスクリプトームおよびマルチオミクスのシングルセルプロファイリングにすぐに使用できる試薬を提供する、広く普及している技術です。この技術には、シングルセルおよび単一核RNAシーケンシング(それぞれscRNA-SeqおよびsnRNA-Seq)、scATAC-Seq、シングルセル免疫プロファイリング(BCR/TCRシーケンシング)、およびマルチオームのワークフローが含まれます。後者は、同じ細胞に由来する転写情報(scRNA-Seq)とエピジェネティックな情報(scATAC-Seq)を組み合わせたものです。 
組織から単離され、これらのアプローチのいずれかで分析された単一細胞または単一核懸濁液の品質(生存率、完全性、純度)は、高品質のデータを生成するために重要です。したがって、サンプル調製プロトコルは、各生体組織の特殊性に適合させ、高品質の細胞および核懸濁液を確実に生成する必要があります。
本稿では、ダウンストリームのマルチオーム10X Genomicsパイプライン用に脳および骨髄サンプルを調製するための2つのプロトコルについて説明します。プロトコルは段階的に行われ、組織解離、細胞選別、核単離、および細胞の分割とバーコード化、ライブラリ調製、およびシーケンシングの出発物質として使用される調製された核懸濁液の品質管理をカバーしています。これらの標準化されたプロトコルは、高品質の核ライブラリと堅牢で信頼性の高いデータを生成します。

上記の2つのプロトコルは、2つの異なるタイプの組織から始まる核の単離を詳述しています。2つのプロトコルの相違点と類似点を 図1に概略的に表します。
マウス脳からの核の精製 ここで説明するプロトコルでは、脳サンプルから核を調製するための穏やかな方法を提案します。まず、溶解緩衝液中で脳組織を機械的に解離し、その後、懸濁液から残りの組織を除去する洗浄およびストレーナーろ過ステップが続きます。その後の破片、非溶解細胞、および小粒子の除去は、精製された核のみが下流のマルチオームプロトコルにロードされることを保証します。 図2 は、ソーティング前後の核のプロファイルを示しています。濾過後、核選別前に、サンプルには大量の破片が含まれており、「シングレット」の99%以上が核染色(7-AAD)に陽性であり、最適な細胞溶解を示します(図2A)。核は、7-AADポジティブゲートに基づいてソートされます。選別された物質の一部分を取得して、調製した核の純度を確認します。 図2B は、選別後の脳核のプロファイルを示しています。核の選別により、核の純度を最初の36%(図2A)からほぼ100%(図2B)に向上させることができました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig02.jpg"> 図2:核選別と選別後の純度試験のためのゲーティング戦略。 核を7-AADで染色し、セルソーターで取得しました。(A)核は、まずそのサイズと粒度(それぞれFSC-AとSSC-A)に基づいてゲーティングされます。次に、FSC-A/FSC-H特性と7-AAD染色に基づいて単一粒子を選択します。(B)細胞選別後、コレクションチューブからの核の一部を、 Aと同じゲーティング戦略を使用して純度を検査します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
マウス骨髄造血幹細胞前駆細胞(HSPC)の精製 骨髄から単離すると、図3Aに示すゲーティング戦略に従って、最大2 x 105 HSPCがFACSによってソートされます。選別効率とサンプルの純度を評価します(図3B)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig03v2.jpg"> 図3:骨髄HSPCの選別のためのゲーティング戦略。 (A)核単離のために生存可能なLKS+ 造血幹細胞とCD34+ 骨髄前駆細胞を選別するための代表的なFACSゲーティング戦略。(B)選別された細胞集団の純度の検証に使用した代表的なFACSプロット。親母集団に対する異なるセルサブセットの比率を示します。*ソートされた2つの母集団。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
「Low Cell Input Nuclei Isolation」プロトコルにより、最大105 細胞のサンプルから核を単離できます。遠心分離ステップの数が少ないため、細胞/核の損失が最小限に抑えられます。溶解バッファーと洗浄バッファーの量を細胞投入量に比例して調整し、核回収率を最大化するために遠心分離時間を延長しました。私たちは、カウントによって回収された核の量と、フローサイトメトリーと顕微鏡イメージングによるそれらの品質を評価するためのパイロット実験を実施しました。 図4 に、細胞溶解後のHSPCサンプルを示します。このプロトコルでは、 図5Aに見られるように、下流のマルチオームプロトコルに影響を与える可能性のある破片がなく、高品質の核が生成されました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig04.jpg"> 図4:単離された骨髄HSPC核の純度試験選別。 核を7-AADで染色し、セルソーターで取得しました。まず、核のサイズと粒度(それぞれFSC-AとSSC-A)に基づいてゲーティングを行い、サンプルの純度を評価しました。核の割合は、親集団に対して示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>チューブ番号</td>
			<td>チューブ名</td>
			<td>ステンドエンティティ</td>
			<td>染色された実体の量</td>
			<td>抗体/色素(μL)</td>
			<td>回収バッファー(μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>未染色</td>
			<td>細胞</td>
			<td>5,00,000</td>
			<td>該当なし</td>
			<td rowspan="7">200</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain(LIVE/DEAD固定可能アクア死細胞染色)</td>
			<td>細胞</td>
			<td>5,00,000</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>APC/Cyanine 7 抗マウス CD16/32 (FcγR)</td>
			<td>OneComp eBeads (ワンコンプ イービーズ)</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>パシフィックブルーアンチマウスリネージュカクテル</td>
			<td>OneComp eBeads (ワンコンプ イービーズ)</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>PE抗マウスLy-6A/E(SCA-1)</td>
			<td>OneComp eBeads (ワンコンプ イービーズ)</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>APC抗マウスCD117(Cキット)</td>
			<td>OneComp eBeads (ワンコンプ イービーズ)</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>FITC抗マウスCD34</td>
			<td>OneComp eBeads (ワンコンプ イービーズ)</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr></tbody></table>表1:フローサイトメーターでの補正設定の単一染色コントロール。 必要な単一染色コントロール、染色する細胞またはビーズの数、および抗体の量を示します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>マスターミックス</td>
			<td>試薬</td>
			<td>最終希釈</td>
			<td>抗体/色素(μL)</td>
			<td>バッファーの種類</td>
			<td>バッファー (μL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">ミックス1</td>
			<td>APC/Cyanine 7 抗マウス CD16/32 (FcγR)</td>
			<td>1/500</td>
			<td>1.2</td>
			<td rowspan="2">DPBSの</td>
			<td rowspan="2">300</td>
		</tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain(LIVE/DEAD固定可能アクア死細胞染色)</td>
			<td>1/250</td>
			<td>2.4</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">ミックス2</td>
			<td>パシフィックブルーアンチマウスリネージュカクテル</td>
			<td>1/20</td>
			<td>30</td>
			<td rowspan="4">FACSバッファ</td>
			<td rowspan="4">300</td>
		</tr><tr><td>PE抗マウスLy-6A/E(SCA-1)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>APC抗マウスCD117(Cキット)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>FITC抗マウスCD34</td>
			<td>1/50</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>総染色量</td>
			<td>600</td>
		</tr></tbody></table>表2:骨髄HSPCの染色ミックスの組成。 4,000万個の細胞を含む1つのサンプルの染色に必要な試薬の量を示しています。より多くのサンプルを染色する場合は、指示量に必要サンプル数を掛け、余分なサンプル量の半分を追加して、マスターミックスの十分な量を確保します。
補足図1:骨髄細胞分離プロトコル。 (A)腹膜を開きます。白い点線は、切断する線を示します。(B)後ろ足の皮膚を剥がした後、股関節の背骨に沿ってハサミを並べ、大腿骨を切らずに脚を切り取ります。(C)筋肉を除去する前の脚が体から分離した外観。(D)筋肉を除去した後の脚の外観。(E)大腿骨を膝関節で分離し、次に股関節で、大腿骨を切り開かないように注意しながら分離する手順。白い曲線の矢印は、必要なモーションを示します。白い点線の矢印は、ハサミでつまんでそっと分離する領域を示しています。 (F)大腿骨の遠位部(膝関節の脛骨に以前付着していた部分)をハサミでしっかりとつかみ、ひっくり返して骨髄を露出させることにより、開く手順。(G)黒い矢印で示された4つの突起が、露出したフィシスの端に見えるはずです。(H)150 μL の FACS バッファーを含む 1.5 mL チューブ内に置かれた、調製された 0.5 mL チューブにオープンエンドが下を向いている大腿骨の外観。(I)12,000 x gでの迅速な遠心分離後のペレット状の骨髄細胞と白色大腿骨の外観。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/Moraes-Cabe%20et%20al_Supplementary%20Figure1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

単一細胞/単一核のトランスクリプトミクスおよびマルチオミクスの成功は、細胞/核の品質に大きく依存します。したがって、組織からの細胞/核の分離とその精製は高度に標準化されなければなりません。このプロトコルは下流の単一核のmultiomeの試金のための頭脳および骨髄からの核の準備を記述する。

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of ...

最近では、ハイスループットな画像ベースのスペクトルソーターが進歩しており、これらの技術はパネル設計の柔軟性を提供し、類似色素の同時使用や自家蛍光の管理を可能にします。最先端の単一細胞技術を使用する際の大きな実験上の課題は、特に壊れやすい細胞集団や希少な細胞集団を扱うことです。各組織または細胞タイプは、高品質のシーケンシングデータに変換される十分な生存率の高い細胞を得るために、微調整されたプロトコル最適化を受ける必要があります。当社の修正された単一核調製プロトコルは、核の回収率を向上させ、核へのストレスを最小限に抑えます。脳および骨髄組織に特化して最適化されており、サンプルの解離から核精製までのすべてのステップをカバーしています。

high-quality-brain-bone-marrow-nuclei-preparation-for-single-nuclei

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

腫瘍内不均一性は、神経膠腫を含む腫瘍の固有の特徴である。我々は、単核RNAおよびATACシーケンシング研究のために、新鮮な凍結したグリオーマ組織から単一核を単一核に分離するために、バッファーと勾配遠心分離の組み合わせを利用するシンプルで効率的なプロトコルを開発した。...

単核RNA-seqおよびATAC-seqのための新鮮な凍結脳腫瘍からの核分離

ここでは、一核RNA-seq、ATAC-seq、およびジョイントマルチオミクス(RNA-seqおよびATAC-seq)について、瞬間凍結されたアーカイブされた肝臓組織から核を単離するためのプロトコルを紹介します。...

シングルセルマルチオミクスのための瞬間凍結肝臓組織からの核の単離

この研究では、下流の単一核RNAシーケンシングのために、凍結した哺乳類組織から高品質の核を単離するための、シンプルで迅速、かつ部分的に自動化されたプロトコルについて説明しています。...

単一核の配列のための凍結した哺乳類ティッシュからの単一核の隔離のための簡単で、速く、部分的に自動化されたプロトコル

このプロトコルは、10x Genomicsプラットフォームを使用したマルチオームシーケンシングのための固形腫瘍標本からの核の分離に信頼性が高く最適化されたアプローチを提供し、組織解離条件、単一細胞懸濁液の凍結保存、および単離された核の評価に関する推奨事項を含みます。...

マルチオームシーケンシングのための新鮮および凍結固形腫瘍標本からの最適化された核分離(英語)

ほとんどのアッセイは、単一セルの分解能が不足しているため脳組織の細胞の不均質性は、クロマチンにおけるエピジェネティックなマーキングの研究のための重大な制約をもたらす。ニューロンは通常、グリア細胞および他の非神経細胞が混在しています。私たちは、人間の脳から神経細胞核を抽出して収集するプロトコルを提供しています。...

人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離

この手順では、マウス骨髄からプライマリ造血細胞培養を確立し、ジーンパルサーMXCellのエレクトロポレーションシステムを用いてトランスフェクションが続いている方法について説明します。...

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

この記事では、骨髄中の彼らのニッチへの造血細胞のホーミングを研究するために使用されるプロトコルについて説明します。...

骨髄の造血細胞のホーミング

我々は、死後、人間の脳の上側頭回の層IIIの均質な細胞集団、錐体細胞からRNAを分離して抽出するためにレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用してプロセスを説明します。私たちは、その後直線的に（T7ベース）mRNAを増幅し、Affymetrix社人間X3Pマイクロアレイにサンプルをハイブリダイズする。...

人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のRNAを取得

ショウジョウバエの組織は、しばしば、細胞型の不均一な混合物を含有する。特定の組織の特定の細胞型における遺伝子発現を調べるために、核が遺伝的にタグ付けし、続いて親和性に基づくアプローチを用いて単離することができる。単離された核は、遺伝子発現解析およびクロマチン免疫沈降などの下流用途に使用することができる。...

からのタグ付き核の親和性に基づく分離<em&gt;ショウジョウバエ</em遺伝子発現解析のための&gt;組織

破骨細胞は、体内の主要な骨吸収細胞である。大量に破骨細胞を単離する能力は、破骨細胞の生物学の理解における大きな進歩をもたらした。このプロトコルでは、培養し、インビトロで破骨細胞活性を定量化する、単離するための方法を記載する。...

マウス骨髄からの破骨細胞の導出

学ぶ、マウスの脳と骨髄組織から高純度核を単離する最適化プロトコル。フローサイトメトリーと自動細胞計数を用いて、単一核マルチオームアッセイの品質を向上させる方法を解説します。

単一核マルチオームアッセイのための高品質脳および骨髄核調製(英語)

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