Name: in vivoでのB細胞活性化の阻害とin vitroでのガラクトース欠損IgA1産生の減少によるジオシン媒介性IgA腎症の緩和 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 学ぶジオシンによるIgA腎症治療メカニズム。in vivoでB細胞活性化を阻害し、in vitroでガラクトース欠損IgA1産生を減少させる作用を解明。漢方薬の活性成分が慢性腎臓病治療に示す可能性を探る。

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<meta charset="utf8"></head><body>マウスモデルにおける免疫グロブリンA腎症(IgAN)のジオシンによる治療

<ol><li>Knoppova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+activities+of+IgA1-containing+immune+complexes+in+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origin and activities of IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy.</a> Frontiers in Immunology. 7, 117(2016).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>抗CD20/MS4A1抗体</td><td>Boster Biotechnology Company</td><td>A03780-3</td><td></td></tr><tr><td>Antifade mounting medium</td><td>Beyotime, Shanghai, China</td><td>P0128S</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c mice</td><td>Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>110322220101424000</tr><tr><td>ブロッキング血清</td><td>Solarbio、北京、中国</td><td>SL038</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シガンマグロブリン</td><td>上海YuanYeバイオテクノロジー会社</td><td>S12031</td><td></td></tr><tr><td>C1GALT1ポリクローナル抗体</td><td>Proteintechグループ株式会社、米国</td><td>27569-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸抗原賦活化溶液(50回;)</td><td>Phygene Biotechnology Company</td><td>PH0422</td><td></td></tr><tr><td>COSMC ポリクローナル抗体</td><td>Proteintech Group, Inc,USA</td><td>19254-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>細胞毒性検出キット</td><td>Roche Company</td><td>4744926001</td><td></td></tr><tr><td>Dako REAL EnVision 検出システム、ペルオキシダーゼ/DAB+</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dioscin</td><td>国立食品医薬品管理研究所</td><td>111707-201703</td><td></td></tr><tr><td>DIO錠</td><td>成都No.1 Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>H51023866</tr><tr><td>ECLワーキングソリューション</td><td>Merck Biotechnology, Inc</td><td>WBKLS0100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>強化された細胞計数キット-8</td><td>Beyotime、上海、中国</td><td>C0043</td><td></td></tr><tr><td>ファッシングワンステップ除去 遺伝子cDNAファーストストランド合成プレミックス</td><td>天元、北京、中国</td><td>KR118-02</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン過ヨウ素酸シフ(PAS)染色キット&nbsp;</td><td>BaSOバイオテクノロジー会社</td><td>BA4080A</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgA-AF488</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-30</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗ウサギIgG抗体(H + L)、HRPは</td><td>BeiJing Bioss Biotechnology Company</td><td>BS-0295G-HRP</td><td></td></tr><tr><td>ヒトGd-IgA1 ELISAキット</td><td>IBL</td><td>27600</td><td></td></tr><tr><td>ヒトIgA ELISAキット</td><td>MultiSciences(LiankeBio)</td><td>70-EK174-96</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA タンパク質アッセイキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>PMSF 溶液</td><td>中国、上海</td>、<td>北京 ST507</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K&nbsp;</td><td>Phygene Biotechnology Company</td><td>PH1521</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-CXCR5 polyclonal antibody&nbsp;</td><td>BeiJing Bioss Biotechnology Company</td><td>bs-23570R</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 溶解バッファー</td><td>Beyotime、上海、中国</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>RNAsimple total RNA extraction kit</td><td>TIANGEN、北京、中国</td><td>DP419</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Solarbio、北京、中国</td><td>31800</td><td></td></tr><tr><td>Super-Bradford タンパク質アッセイキット</td><td>CWBIO、北京、中国</td><td>CW0013</td><td></td></tr><tr><td>トリトン&nbsp;X-100</td><td>Beyotime、上海、中国</td><td>ST795</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin Rabbit mAb</td><td>Abclonal、武漢、中国</td><td>AC026</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivoでのb細胞活性化の阻害とin vitroでのガラクトース欠損iga1産生の減少によるジオシン媒介性iga腎症の緩和

Dioscin Mediated IgA Nephropathy Alleviation by Inhibiting B Cell Activation In Vivo and Decreasing Galactose-Deficient IgA1 Production In Vitro

IgANモデルにおけるDIOの腎臓組織への影響
対照群と比較して、粘膜免疫誘導IgANモデルマウス(モデル群)ではタンパク尿が有意に増加し(補足 図2)、メサンギアル領域にIgA沈着が見られ、蛍光はメサンギウム領域全体にクラスター状に均一に分布しており (図1A)、腎組織のPAS染色ではメサンギアル細胞の増殖と間質過形成が認められた (図1B)これは、DIO強制品群(DIOグループ)で減少しました。
パイエルパッチのBリンパ球に対するDIOの影響
パイエルパッチは、Bリンパ球のIgA分泌細胞への変換の主要な部位です。Peyerのパッチを研究対象として取り、B細胞マーカーCD20とCXCR5の発現を検出することにより、DIOのBリンパ球への影響を観察しました。免疫組織化学的結果から、CD20およびCXCR5の発現は、対照群と比較してモデル群で有意に高かったことが示されました。DIOは、上記の分子マーカーの発現を阻害する可能性があります (図2A、B)。
DAKIKI細胞上のDIOの安全濃度範囲
LDHは、原形質膜の完全性のマーカーであり、細胞死の指標であり、LDHの放出率が高いほど、細胞の損傷がより深刻であることを示します。LDH放出アッセイを使用して、DIOの安全な濃度範囲を決定しました。DIOの最大安全濃度は、LDH放出率が10%未満であることで決定されました。結果(図3)では、0.25〜1.0μg/mLの濃度でDIOによって誘発される有意な細胞毒性は示されませんでした。したがって、次の研究では、0.25、0.5、および 1.0 μg/mL DIO を投与レベルとして使用しました。
DIOがDAKIKI細胞の増殖に及ぼす影響
実験結果(図4)から、DIOはモデル群(LPS刺激群)と比較して、LPSによるDAKIKI細胞の増殖を濃度依存的に阻害することが示されました。0.5 μg/mL および 1.0 μg/mL 濃度の DIO は、LPS による DAKIKI 細胞の増殖を有意に阻害しました (P &lt; 0.01)。
DIOがDAKIKI細胞の分泌機能に及ぼす影響
Gd-IgA1レベルはIgANの病理学的プロセスと密接に関連しており、総IgAは細胞分泌機能の指標として一緒にテストされます。ELISAアッセイを用いて、DAKIKI細胞培養の上清中のIgAおよびGd-IgA1含量を検出しました。その結果(図5A、B)、LPSで刺激されたDAKIKI細胞は、対照群と比較してIgAを多く分泌する(P &lt; 0.01)ことが示されました(図5A、B)。これに対し、DIOはDAKIKI細胞のIgA分泌を有意に阻害しました(P &lt; 0.01)。対照群と比較して、LPS刺激DAKIKI細胞は統計学的傾向(P &lt; 0.10)でGd-IgA1を多く分泌し、DIOはLPS刺激DAKIKI細胞からのGd-IgA1分泌を濃度依存的に阻害(P &lt; 0.05、P &lt; 0.01)し、このうちDIO1.0μg/mLはGd-IgA1の分泌を有意に阻害し、阻害率は25%であった。
DIOのメカニズムはDAKIKI細胞によるGd-IgA1分泌を阻害する
DIOがDAKIKI細胞による過剰なGd-IgA1分泌を阻害するメカニズムの可能性をさらに調べるために、DAKIKI細胞のグリコシル化トランスフェラーゼC1GALT1とシャペロンタンパク質Cosmc mRNAのレベルをqRT-PCRで検出し、その結果(図6A、B)、モデル群のDAKIKI細胞では、C1GALT1とCosmcの相対的なmRNA発現が対照群と比較してダウンレギュレーションされていることが示されました（P &lt; 0.01)。DIOは、モデル群と比較して、C1GALT1とCoscの相対的なmRNA発現を異なる程度にアップレギュレーションし、DIO 1.0 μg /mLは、C1GALT1とCoscの相対的なmRNA発現を大幅にアップレギュレーションしました(P &lt; 0.05)。
同時に、DAKIKI細胞におけるC1GALT1およびCosmcのタンパク質発現に対するDIOの影響を検出するために、WB法を使用しました。対照群と比較して、モデル群のDAKIKI細胞におけるC1GALT1およびCosmcのタンパク質発現は明らかに減少しました(P &lt; 0.05)。モデル群と比較して、DIO介入後のC1GALT1とCoscのタンパク質発現はアップレギュレーションされていました。C1GALT1およびCosmcのタンパク質発現は、DIOによって1.0 μg/mL(P &lt; 0.05)の濃度で大幅にアップレギュレーションされました(図7A-C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig1.jpg"> 図1:腎臓の組織病理学( (A)免疫蛍光顕微鏡。各群のマウスの腎臓切片を抗IgA(緑)とDAPI(青)で染色しました。上の画像スケールバー= 200μm。下の画像スケールバー= 50μm。n = グループあたり 6。(B)対照群、モデル群、およびDIO群のマウスの腎臓組織のPAS染色の代表的な写真。スケールバー = 30 μm。下向きの矢印はメサンギウム細胞を示し、上向きの矢印は間質を示します。スケールバー = 30 μm。n = グループあたり 6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig2.jpg"> 図2:Bリンパ球マーカーに対するDIOの影響 (A)パイエル板におけるCD20の発現。スケールバー = 200 μm。n = グループあたり 6。(B)パイエルパッチにおけるCXCR5の発現。スケールバーは画像の右下隅にあります。スケールバー = 200 μm。n = グループあたり 6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig3.jpg"> 図 3.DAKIKI細胞上のDIOの安全濃度のスクリーニング。 統計値は、3つの独立した実験からの平均±SDとして表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig4.jpg"> 図 4.DIOの濃度が異なると、DAKIKI細胞の増殖に影響が及びます。 データは平均±SDとして表され、対照群と比較して、**P &lt; 0.01;モデルグループと比較すると、 #P &lt; 0.05' ##P &lt; 0.01;すべての実験の結果が3回繰り返されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig5.jpg"> 図 5.DIOは、DAKIKI細胞によるIgAおよびGd-IgA1の分泌を阻害します。 (A)ELISA法により、各群でIgAの発現を検出した。(B)ELISA法により、各群でGd-IgA1の発現を検出した。データはSD±平均として表されました。対照群と比較すると、**P &lt; 0.01;モデルグループと比較すると、 #P &lt; 0.05、 ##P &lt; 0.01;すべての実験結果を3回繰り返しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig6.jpg"> 図 6.DIOのメカニズムは、DAKIKI細胞による過剰なGd-IgA1分泌を阻害します。 (A)QRT-PCRはC1GALT1のmRNA発現を検出しました。(B)QRT-PCRはCosmcのmRNA発現を検出しました。データはSD±平均として表されました。対照群と比較して、**P&lt;0.01;モデルグループと比較すると、 #P &lt; 0.05、 ##P &lt; 0.01;すべての実験結果を3回繰り返しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig7.jpg"> 図 7.DIOは、DAKIKI細胞におけるC1GALT1とCosmcのタンパク質発現に影響を与えます。(A)WBは、DIOによるC1GALT1およびCosmcのタンパク質発現のアップレギュレーションを検証しました。(B)画像Jを用いたC1GALT1発現の半定量解析 (C)画像Jを用いたCosmc発現の半定量解析データは平均±SD.として表され、対照群と比較して、*P &lt; 0.05;モデル群#P &lt; 0.05、##P &lt; 0.01と比較すると、すべての実験結果を3回繰り返しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1.in vivo モデルのスキーマ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足 図2.タンパク尿の変化。 データは平均±SDとして表されました。n = グループあたり 6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/Supplementary_Figure_2.jpg" target="_blank">この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

in vivoでのB細胞活性化の阻害とin vitroでのガラクトース欠損IgA1産生の減少によるジオシン媒介性IgA腎症の緩和

The increase of circulating galactose-deficient IgA1 (Gd-IgA1) is caused by excessive activation of IgA-positive secretory cells in the process of mucosal ...

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このプロトコルは、G6PI混合ペプチドを使用して、CD4+...

グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(G6PI)誘発RAマウスにおけるiNKT細胞の導入免疫療法

ここでは、腸内ホーミング調節T細胞誘導の生体内増強のためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、樹状細胞は、活性ビタミンD(1,25−ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)de...

腸内調節制御T細胞誘導の生体内増強

マイクロRNAはIgA腎症の病態形成に関与しています。我々は、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるマイクロRNA発現レベルを確実に検出する方法を開発しました。この新しい方法は、IgA腎症におけるmiRNAの関与をチェックすることを容易にします。...

免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出

眼表面の炎症は眼の表面組織に害を及ぼし、眼の重要な機能を損ないます。本プロトコルは、マイボーム腺機能不全(MGD)のマウスモデルにおいて眼の炎症を誘発し、損なわれた組織を収集する方法を記載する。...

眼表面炎症の誘導と関与組織の収集

ここでは、細胞内の活性酸素種の存在をテストし、評価するための簡単​​な方法を提案する。...

がんの生産と活性酸素種の検出（ROS）

私たちは、ex vivoで標識された細胞とマウスモデルで、MRIを用いたin vivo細胞追跡のための一般的なプロトコルを記述します。細胞標識、画像取得処理および定量のための標準的なプロトコルが含まれる。...

細胞追跡のためのin vivoでの19 F MRI における

小腸は、しばしば、血流に影響を与える負栄養吸収に影響を与える可能性が毒素に暴露される。 multimyographおよび腸間膜動脈および静脈の分離株を使用して、目的の化合物または毒素は、血管作用についてスクリーニングすることができる。...

バイオアッセイとしてウシ腸間膜動脈と静脈の切片を分離して使用すると、小腸で血管作用をテストするために

この原稿は、妊娠中の子宮内圧を測定する目的でマウスにテレメーターを埋め込むためのプロトコルを提供します。...

マウス収縮圧力を測定するために子宮内テレメトリ<em&gt;インビボ</em

ミクログリアの活性化および小膠は、慢性神経変性に重要な応答です。ここでは、in vivoで 、共焦点検眼鏡による網膜CX3CR1-GFP +ミクログリア細胞の長期的な可視化のための方法を提示し、閾値と形態計測のために識別し、それらの活性化を定量化するために分析します。我々は、年齢関連の緑内障の早期の段階でミクログリアの変化を監視します。...

共焦点検眼鏡イメージングとマウス緑内障における細胞の形態計測：神経変性中に網膜ミクログリアの活性化のインビボダイナミクス

学ぶジオシンによるIgA腎症治療メカニズム。in vivoでB細胞活性化を阻害し、in vitroでガラクトース欠損IgA1産生を減少させる作用を解明。漢方薬の活性成分が慢性腎臓病治療に示す可能性を探る。

in vivoでのB細胞活性化の阻害とin vitroでのガラクトース欠損IgA1産生の減少によるジオシン媒介性IgA腎症の緩和

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