Name: 脊椎動物の網膜の内核層ニューロンを研究するための改良されたフラットマウント調製としてのスプリット網膜 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶ、マウス網膜のスプリットフラットマウント調製法により内核層ニューロンへのアクセスを向上させる手法。この技術は免疫蛍光染色と電気生理学実験の効率を20倍以上高速化し、視覚処理の神経回路研究に応用できる。

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この研究は、以下のNIH助成金によって支援されました:NIH助成金R01EY031596(C.M.へ);NIH助成金R01EY029985(C.M.へ);NIH助成金P30EY010572(C.M.へ);NIH助成金R01EY032564(BSへ)。網膜切片の作製における技術サポートをしてくれたTammie Haleyと、この研究で使用したmRNA FISHプローブを惜しみなく提供してくれたCharles Allen博士に感謝します。

マウス分裂網膜における双極性および水平神経細胞の研究

<ol><li>Morgans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+at+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina.</a> Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).</li>
<li>Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+bipolar+cells%3A+elementary+building+blocks+of+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).</li>
<li>Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Cell+Feedback+to+Cone+Photoreceptors+in+Mammalian+Retina%3A+Novel+Insights+From+the+GABA-pH+Hybrid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li>
<li>Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+remove+photoreceptors+from+whole+mount+retina+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).</li>
<li>Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+retinal+preservation+in+the+photoinducible+I307N+rhodopsin+mutant+mouse%2C+a+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).</li>
<li>Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Chédotal, A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+semaphorin+signaling+controls+laminar+stratification+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina.</a> Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).</li>
<li>Matsuoka, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance-Cue+Control+of+Horizontal+Cell+Morphology%2C+Lamination%2C+and+Synapse+Formation+in+the+Mammalian+Outer+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina.</a> Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).</li>
<li>Wässle, H., Puller, C., Müller, F., Haverkamp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+Contacts%2C+Mosaics%2C+and+Territories+of+Bipolar+Cells+in+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina.</a> Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).</li>
<li>Thoreson, W. B., Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Cell+Types%2C+Circuits%2C+and+Mechanisms+for+Color+Vision+in+the+Vertebrate+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).</li>
<li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li>
<li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28(2017).</li>
<li>Todorova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Layer+Separation+%28ReLayS%29+method+enables+the+molecular+analysis+of+photoreceptor+segments+and+cell+bodies%2C+as+well+as+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina.</a> Scientific Reports. 12 (1), 20195(2022).</li>
<li>Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+of+retinal+sublayers+from+the+entire+retina+with+special+reference+to+application+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).</li>
<li>Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transgenic+mouse+lines+expressing+Cre-recombinase+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina.</a> Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).</li>
<li>Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermolecular+Interaction+between+Anchoring+Subunits+Specify+Subcellular+Targeting+and+Function+of+RGS+Proteins+in+Retina+ON-Bipolar+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).</li>
<li>Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+Receptor+GPR179+Forms+Macromolecular+Complexes+With+Components+of+Metabotropic+Signaling+Cascade+in+Retina+ON-Bipolar+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).</li>
<li>Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Visualization+of+RNA+and+Protein+Expression+in+Tissue+Using+a+Combined+RNAscopeTM+In+Situ+Hybridization+and+Immunofluorescence+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 2148, Clifton, N.J. 301-312 (2020).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Morgans, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM1+is+required+for+the+depolarizing+light+response+in+retinal+ON-bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).</li>
<li>Alessio, E., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+whole-mount+retinas+with+the+CLARITY+tissue+clearing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (7), 5054(2020).</li>
<li>Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Thickness+Normative+Data+in+Wild-Type+Mice+Using+Customized+Miniature+SD-OCT%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67265(2013).</li>
<li>Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Protocol+for+Retinal+Wholemount+Preparation+for+Imaging+and+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018(2013).</li>
<li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Webvision%3A+The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters in the Retina.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center. (1995).</li>
<li>Chaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+functional+roles+of+horizontal+cells+in+the+retinal+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5540(2017).</li>
<li>Egger, V., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A17+Amacrine+Cells+and+Olfactory+Granule+Cells%3A+Parallel+Processors+of+Early+Sensory+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537(2020).</li>
<li>Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+amacrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic amacrine cell.</a> The Journal of Comparative Neurology. 301 (3), 461-489 (1990).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomic+analysis+reveals+an+interneuron+with+an+integral+role+in+the+retinal+circuit+for+night+vision%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision.</a> eLife. 9, 56077(2020).</li>
<li>Janssen-Bienhold, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin57+is+expressed+in+dendro-dendritic+and+axo-axonal+gap+junctions+of+mouse+horizontal+cells+and+its+distribution+is+modulated+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).</li>
<li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+excitation+and+inhibition+in+the+dendrites+of+mouse+direction-selective+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells.</a> eLife. 9, 52949(2020).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability%2C+affinity%2C+and+chromatic+variants+of+the+glutamate+sensor+iGluSnFR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR.</a> Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).</li>
<li>Strauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Center-surround+interactions+underlie+bipolar+cell+motion+sensitivity+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina.</a> Nature Communications. 13 (1), 5574(2022).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+for+in+vivo+imaging+of+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA.</a> Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).</li>
<li>Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+Proton-Mediated+Inhibitory+Feedback+at+the+Retinal+Horizontal+Cell-Cone+Synapse+with+Genetically-Encoded+pH+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).</li>
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著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

光受容体が光子吸収を神経伝達物質放出に変換した後、BCおよびHCは、視覚信号を処理する最初の網膜ニューロンである23。これらのニューロンの重要性はよく認識されていますが、その機能の多くは完全に理解されていないか、まったく調査されていません。多くのBCおよびHC生理学研究は、横方向の接続性を維持しながらINLニューロンへのアクセスを改善するフラットマウント網膜製剤の恩恵を受ける可能性があります。スプリット網膜法の開発は、フラットマウント配向のBCおよびHCから高品質の電気生理学的記録および顕微鏡データを取得するための簡単なプロトコルを提供するための努力を表しています。ここで説明する分割網膜調製は、特殊な機器を使用せずに、網膜単離後、マウス1匹あたり約20分(網膜あたり10分)で実行できます。この方法は、既存の視細胞除去手順からインスピレーションを得ていますが、シンプルさ、速度、および汎用性が大幅に向上しています4,10,11,12,13。網膜層を分離するための以前の方法とは異なり、網膜の分割は、凍結、凍結乾燥、または網膜への接着剤の繰り返し塗布を必要としません。練習すれば、ほぼすべての光受容体をニトロセルロース膜で1回の裂け目で除去することができます。このアプローチの速さと容易さにより、網膜がカルボゲン化されたエイムから抜け出す時間を最小限に抑えることができ、長期間にわたって高い細胞生存率を得ることができます。分割網膜は、カルボゲン処理されたエイム培地中で、分割後数時間維持することができます。この調製物におけるINLニューロンの健全性の証として、生細胞染色/死細胞染色(図4)およびパッチクランプ電気生理学(図6)により、分裂後の赤血球およびHCの生存率が確認されました。
裂けた網膜の視細胞層の除去は、抗体のINLへの拡散時間を劇的に短縮することにより、免疫標識中に大きな利点をもたらします。一次抗体および二次抗体の標識は2時間以内に完了でき、ターゲット5、6、7、8、20、22に応じて72時間以上かかる従来のフラットマウント染色を大幅に改善します。その結果、組織調製と同日に顕微鏡データを取得でき、免疫蛍光実験のペースを大幅に加速できます。mRNAプローブのアニーリングを容易にするために、FISH実験では、通常、免疫標識よりもはるかに長い固定時間(~24時間)が推奨されています18。しかし、ここで紹介する実験では、2時間固定しても例外的なFISH標識が得られることが実証されています(図5)。固定時間を30分から2時間に延長したにもかかわらず、優れた免疫標識を得るために抗原賦活化ステップを行う必要はありませんでしたが、これは抗体または抗原によって異なる場合があります。FISHプロトコルにおけるプロテアーゼ処理は、おそらく標的エピトープの破壊により、抗体標識を妨げる可能性があります。この問題は、複数のエピトープを標的とするポリクローナル抗体を使用することで回避され、エピトープの破壊が免疫標識を妨げる可能性を低減しました。さらに、適度なプロテアーゼ処理(ACDプロテアーゼIII)を使用して、十分な組織浸透性を維持しながら、過剰なエピトープの変化を防止しました。
時折、網膜は代わりに外核層(ONL)を裂き、INL細胞が見えない視細胞体細胞の層を残します。これを防ぐには、網膜がガラス上で完全に平らになり、網膜の周りから残留液体が取り除かれていることを確認する必要があります。絵筆でニトロセルロースをより強く押すと、ONLの裂け目を防ぐのにも役立ちます。膜が濡れすぎたり、網膜が折りたたまれたりすると、裂け目が成功する可能性は大幅に減少します。DAPIを使用して細胞核を染色することは、分裂の質を評価し、残りの光受容体のカバー率を決定するのに役立ちます。視細胞核はより小さく、より明るく、より表面的であるのに対し(補足図3A)、BC核はより大きく、より暗く、より深い(補足図3B)。場合によっては、裂傷の平面が網膜の断片を横切ってわずかに変化し、視細胞体が完全に除去されていない斑点が生じます(補足図3C)。顕微鏡検査や電気生理学のアプリケーションでは、光受容体が適切に除去された領域から高品質のデータを収集する能力が妨げられることはありません。露出した網膜内部の大きな視野は、パッチピペットでイメージングまたは記録すると簡単に見つけることができます。より完全な光受容体除去が望まれる場合は、100%の光受容体除去が保証されるわけではありませんが、ニトロセルロースメンブレンの追加片で2回目の裂傷を行うことができます。したがって、残留光受容体材料が結果に影響を与える可能性のある遺伝子発現またはプロテオミクス研究で分割網膜を使用する場合は注意が必要です。シングルセルアプリケーションの場合、光受容体からのデータを分析から除外できるため、この懸念は杞憂です。
スプリット網膜調製の利点は、おそらく広視野介在ニューロンの電気生理学的記録において最も顕著である。従来の縦型スライスでは広視野細胞の広範なプロセスが切断されますが、スプリット網膜調製ではOPLとIPLがそのまま残るため、縦型スライスでは見落とされてしまうHC24、A17s25、TH AC26、NOS-1AC27 などの広視野細胞からの入力を取り込むことができます。したがって、結果の解釈と網膜スライスから収集された以前のデータとの比較には、慎重な検討が必要です。それにもかかわらず、光刺激の薬理学的模倣を用いた実験では、これらの結果は網膜切片から記録されたデータに類似している19。細胞特異的プロモーター下でChR2を発現させることにより、INLのBCから記録しながら目的の細胞集団を刺激し、目的の細胞が垂直情報経路に及ぼす影響を調べることができます。アマクリン細胞などのより深いINLニューロンから直接記録することも、網膜分裂で実現可能です。この場合、パッチ電極は最初により表面的なINLニューロンを通過する必要がありますが、従来のホールマウント調製と比較すると、その経路を塞ぐ組織が大幅に少なくなります。
この方法は、他のニューロンに対する広視野細胞の影響を測定することに加えて、樹状突起がOPL28で広範なギャップ結合結合ネットワークを形成するHCからの直接単一細胞パッチクランプを可能にします。水平細胞は、網膜を通る垂直方向の情報の伝達を形作る光受容体に重要なフィードバックを送ります。しかし、HCの樹状突起野は垂直スライスで切り捨てられるため、単一細胞の記録データが不足しています。この研究は、解剖学的および生理学的に無傷のHCを提示し、そこからChR2誘発電流が記録されるトリプルトランスジェニックマウス系統(図6 C-E)で紹介しています。ChR2刺激の外側では、分割網膜を使用して、内因性HC電流およびギャップ結合結合を研究することができます28。分裂した網膜は、化学的適用やChR2刺激によって誘導されるシナプス結合やニューロンの活動を研究するための便利なモデルを提供するが、光受容体がないため、自然光応答や光順応メカニズムを直接調べることはできない。
網膜のin situイメージングは、近年、目覚ましい進歩を遂げています。しかし、画像検査の大部分は、網膜全マウント製剤中の神経節細胞層に限定されている29。著者らは、裂けた網膜に光受容体が存在しないことから、OPLとINLにおける生きたカルシウムイメージングの理想的なモデルになると考えている。このモデルは、カルシウムイメージング以外にも、iGluSnFR30,31、iGABASnFR32、pHluorin 33などの遺伝子コードバイオセンサーでの使用に大きな可能性を秘めています。これらの強力なツールをスプリット網膜調製と組み合わせることで、網膜での光処理に寄与するBCおよびHCのシナプス相互作用と生物物理学的特性を探索するための効率的なアプローチを提供する可能性があります。

網膜は、後眼にある薄い神経組織で、光が遮断され、脳が解釈できる電気化学信号に処理されます。網膜の後ろでは、桿体と錐体の光受容体が光によって刺激され、神経伝達物質であるグルタミン酸1の強直性放出速度が低下します。この光によるグルタミン酸濃度の変化を経験して反応する最初のニューロンは、双極細胞(BC)と水平細胞(HC)であり、その体細胞は内核層(INL)の最外層に存在します。これらの2次ニューロンは、網膜で信号処理の第1段階を実行し、光順応、コントラスト感度、空間/色のopponencyなどの視覚の重要な特徴を形成します2。これらの機能はBCとHCに起因していると考えられてきましたが、これらのプロセスの根底にある回路や生化学的メカニズムは完全には解明されていません3。したがって、BCおよびHC生理学を探索するためのツールと方法の進歩が最も重要です。
垂直(横)網膜切片は、BCおよびHCを研究するための最も実用的なモデルであると長い間証明されてきました。ただし、BCおよびHC生理学の特定の側面は、このモデルでは実験者がアクセスできません。HCからの直接記録またはBCへの影響の間接的な測定は、これらの細胞の側方突起がスライス中に切断されるため、網膜の内因性接続を反映していません。網膜全体の製剤は、これらの側方突起を保存することでこの問題を回避しますが、周囲の網膜層はこれらの細胞にアクセスするための課題を提起します4。網膜全体のINLニューロンからの免疫染色5,6,7,8およびパッチクランプ記録9の例は豊富にありますが、これらのデータの収集を迅速化および簡素化する機会があります。したがって、横断面の固有の制限とマウントモデル全体の課題は、この代替のフラットマウント網膜準備の開発に影響を与えました。
以下の研究では、生きているフラットマウント網膜から光受容体層を簡単に除去して、BCおよびHCへのアクセスを強化し、パッチクランプを簡素化し、より迅速で効率的な免疫標識を行うためのプロトコルについて説明します。孤立した網膜の両側に取り付けられた2枚のニトロセルロース膜を剥がすと、視細胞の軸索を介して組織が引き裂かれ、外側の網状層(OPL)とすべての内側の網膜層を保持する裂けた網膜が残ります。網膜の層を機械的に分離するためのプロトコルを説明している人もいますが、これらの方法はパッチクランプや顕微鏡検査の用途に適していないか、組織の面倒な操作が必要です。これらの方法のいくつかは、層分離のために凍結または凍結乾燥された組織を必要とするため、電気生理学実験とは互換性がありません10、11、12。その他は生体組織用に設計されているが、光受容体を除去するために濾紙4,11で5〜15回連続して剥離するか、トリプシン13で処理する必要がある。ここで説明する技術は、光受容体の除去手順を簡素化し、下流のアプリケーションのレパートリーを拡大することにより、以前の技術を改善します。

<table><tbody><tr><td>#1.5 ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>デュモン#5鉗子2ペア</td><td>テッド・ペラ</td><td>38125</td><td></td></tr><tr><td>25ゲージの針</td><td>ベクトン・ディッケンソン</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>470 nm LED</td><td>ソーラブ</td><td>M470L2</td><td></td></tr><tr><td>5-306 湾曲ハサミ</td><td>ミルテックス</td><td>5-306</td><td></td></tr><tr><td>9インチ使い捨てパスツール・ピペット&nbsp;</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-20D</td><td>カスタムトランスファーピペットの製作用</td></tr><tr><td>Ai80dマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>25109</td><td>リッド:IMSR_JAX:025109</td></tr><tr><td>エイムズ・ミディアム w/L-グルタミン酸</td><td>米国生物学</td><td>A1372-25</td><td></td></tr><tr><td>アンプ制御ソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td>Clampex 10.3ソフトウェア</td><td></td></tr><tr><td>抗カルビンジンD28K抗体</td><td>インビトロジェン</td><td>PA-5 85669</td><td>RRID:4:宿主種AB_2792808=ウサギ;1:100希釈</td></tr><tr><td>抗CtBP2抗体</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>612044</td><td>RRID:&nbsp;AB_399431、宿主種=マウス;1:5000希釈</td></tr><tr><td>抗GPR179抗体</td><td>NA</td><td>NA</td><td>キリル・マルテミャノフからの贈り物;フロリダ州ジュピターのスクリップス研究所、宿主種=羊;1:1000希釈</td></tr><tr><td>抗PKCα抗体</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P4334</td><td>RRID:AB_477345、宿主種=ウサギ;1:5000希釈</td></tr><tr><td>抗PKCα抗体</td><td>サンタクルーズ・バイオテクノロジー</td><td>SC8393 AF594</td><td>RRID:AB_628142、宿主種=マウス;1:1000希釈</td></tr><tr><td>抗PSD95抗体</td><td>BDトランスダクション研究所</td><td>610495</td><td>RRID:&nbsp;AB_397862、宿主種=マウス;1:1000希釈</td></tr><tr><td>抗RGS11抗体</td><td>NA</td><td>NA</td><td>テッド・ウェンセルからの贈り物;テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学、&nbsp;宿主種=ウサギ;1:1000から1:5000の希釈間</td></tr><tr><td>抗シナプトフィシンP38抗体</td><td>シグマ</td><td>S-S5768</td><td>RRID:AB_477523、宿主種=マウス;1:1000希釈</td></tr><tr><td>アクマネーション媒材</td><td>エプレディア</td><td>13800</td><td>スライドマウントメディア</td></tr><tr><td>C57BL/6Jマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td>リッド:IMSR_JAX:000664</td></tr><tr><td>カーボジェンタンク</td><td>マシソン</td><td>NA</td><td>95%<サブ/サブ/サブ/>2<>および5%<サブ/サブで2><></td></tr><tr><td>カスタムトランスファーピペット</td><td>カスタムビルド</td><td>NA</td><td>説明:プラシットトランスファーピペットの先端がテーパーになり始めたところで、ハサミで切り落とす。ガラス製パスツールピペットの最後の2〜3インチを安全に折り取るためにペンチを使ってください。ガラス製パスツールピペットの細い端をプラスチックトランスファーピペットの広い先端にはめ込みます。2つのパーツの接合部にパラフィルムを巻きつけてシールを強化します。</td></tr><tr><td>デジタル光パワーメーター</td><td>ソーラブ</td><td>&nbsp;PM100D</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ステミ2000</td><td></td></tr><tr><td>電気生理増幅器</td><td>分子デバイス</td><td>アクソパッチ200B</td><td></td></tr><tr><td>電気生理学顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td>オリンパス、BX50WI</td><td>ドット勾配コントラスト顕微鏡</td></tr><tr><td>フルオロマウント-G</td><td>サザンバイオテック</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 40x/1.3&nbsp;</td><td>ライカ</td><td>506358</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 63x/1.40&nbsp;</td><td>ライカ</td><td>15506350</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>ロビンズ・サイエンティフィック</td><td>モデル1000</td><td>RNAスコーププロトコルのみ</td></tr><tr><td>イムエッジの疎水性バリアペン</td><td>ベクター研究所</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ピラマル集中治療</td><td>66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>キムウィップ(繊細なタスクワイプ)</td><td>キムテック・サイエンス</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>ライカ HC PL APO CS2 40x/1.3 油浸水対物レンズ</td><td>ライカ</td><td>506358</td><td></td></tr><tr><td>ライカ HC PL APO CS2 63x/1.40 オイル浸漬物レンズ</td><td>ライカ</td><td>15506350</td><td></td></tr><tr><td>ライカTCS SP8 X共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ</td><td>廃止</td><td></td></tr><tr><td>中サイズの15mmペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>25060-60</td><td>網膜剥離の際には目をここに置きます</td></tr><tr><td>メリット97-275スチールハサミ</td><td>功績</td><td>97-275</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サター楽器</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mm-Gabrd-C2 mRNAプローブ</td><td>ACD</td><td>459481-C2</td><td></td></tr><tr><td>マウス安楽死チャンバー</td><td>NA</td><td>NA</td><td>カスタムビルド;小さなガラス瓶を覆うガラス製のペトリ皿。</td></tr><tr><td>ニトロセルロース膜フィルター</td><td>GEヘルスケア生命科学部門;ワットマン</td><td>7184-005</td><td>0.45 & micro;mの孔径</td></tr><tr><td>ピコスプリッツァー</td><td>ジェネラル・バルブ・コーポレーション</td><td>ピコスプリッツァーII&nbsp;</td><td>本文では微細細胞注入ユニットと呼ばれています</td></tr><tr><td>プラスチックトランスファーピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-711-7M</td><td>カスタムトランスファーピペットの製作用</td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td>タイゴン</td><td>R-603</td><td>カーボゲンタンクへの接続</td></tr><tr><td>プラチナハープ</td><td>カスタムビルド</td><td>NA</td><td>電気生理記録室内の分割網膜の固定のために。&nbsp;</td></tr><tr><td>サイズ0 ペイントブラシ</td><td>ジェネリック</td><td>NA</td><td>分割時に網膜を平坦化するためです。&nbsp;</td></tr><tr><td>スローフェードゴールドアンチフェード試薬</td><td>分子プローブ</td><td>S36937&nbsp;</td><td>本文では「アンチフェードマウントメディア」と呼ばれています</td></tr><tr><td>小型10mmペトリ皿</td><td>ファルコン</td><td>353001</td><td>摘出後に目をここに配置します</td></tr><tr><td>小さなガラス板(7.5 cm x 5 cm)</td><td>ジェネリック</td><td>NA</td><td>分離手術のために、孤立した網膜の断片がこの上に配置されます</td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-550-15</td><td>静電的に帯電したガラス顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>厚壁のホウケイ酸ガラスピペットとフィラメント付き。</td><td>サター楽器</td><td>BF150-86-10HP</td><td></td></tr><tr><td>ヴァンナス シザーズ;まっすぐだ</td><td>タイタン・メディカル</td><td>TMS121</td><td>ブランドに特化したものではありません。同等のハサミならどれでも使えます</td></tr><tr><td>vGATFLPo マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>29591</td><td>リッド:IMSR_JAX:029591</td></tr><tr><td>vGlut2Cre マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>28863, 016963</td><td>リッド:IMSR_JAX:028863、リッド:IMSR_JAX:016963</td></tr><tr><td>ゾンビNIR修正可能な実用性キット</td><td>バイオレジェンド</td><td>423105</td><td>本文ではMI-NIRと呼ばれています</td></tr></tbody></table>

脊椎動物の網膜の内核層ニューロンを研究するための改良されたフラットマウント調製としてのスプリット網膜

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

脊椎動物の網膜の双極細胞と水平細胞は、光子が光受容体によって検出された後、視覚情報を処理する最初のニューロンです。これらは、光順応、コントラスト感度、空間および色のオポネンシーなどの基本的な操作を実行します。その行動を支配する精密な回路と生化学的メカニズムを完全に理解することは、視覚神経科学の研究と眼医学を前進させるでしょう。しかし、双極細胞や水平細胞(網膜全体マウントや垂直スライス)を検査するための現在の調製物は、これらの細胞の解剖学的構造や生理学的特徴を捉える能力が限られています。この研究では、生きたフラットマウントマウス網膜から光受容体細胞体を除去する方法を提示し、効率的なパッチクランプと迅速な免疫標識のために、バイポーラ細胞および水平細胞へのアクセスを強化します。裂けた網膜は、単離されたマウス網膜を2枚のニトロセルロースで挟み込み、そっと剥がすことによって作製されます。分離により、外側の網状層のすぐ上で網膜が分割され、2つのニトロセルロースが得られ、1つは視細胞体を含み、もう1つは残りの内側の網膜を含みます。垂直網膜スライスとは異なり、スプリット網膜調製物は網膜内ニューロンの樹状突起を切断しないため、ギャップ結合結合ネットワークと広視野アマクリン細胞の寄与を統合する双極細胞および水平細胞からの記録が可能になります。この研究は、電気生理学、免疫組織化学、および in situ ハイブリダイゼーション実験における水平細胞および双極細胞の研究のためのこの調製物の汎用性を実証しています。

この研究は、光受容体細胞体を除去することで、抗体の拡散が速くなり、免疫組織化学、 in situ ハイブリダイゼーション、および電気生理学実験のための網膜内ニューロンへのパッチピペットアクセスが改善される、代替のフラットマウント網膜製剤を提示します。

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by ...

私たちのグループでは、網膜の視覚処理の根底にある神経回路やシナプス機構に興味を持っています。Morgans研究室では、双極細胞における光順応の分子メカニズムを研究しており、Sivyer研究室では、網膜内ニューロンが神経節細胞の機能にどのように寄与するかに興味を持っています。網膜全体の核間層ニューロンにアクセスすることは、解剖学的研究と生理学的研究の両方にとって課題です。核間層ニューロンは垂直断面でアクセス可能ですが、視野内のニューロンは非常に少ないです。さらに、スライスは横方向の突起や接続を切断し、生理学的研究に影響を与える可能性があります。スプリット網膜法で視細胞を除去することで、網膜内への抗体拡散が劇的に改善され、従来の網膜全体網膜と比較して、網膜内標的の免疫標識が20倍以上速くなります。また、網膜の分裂により、パッチクランプ電気生理学中の核間層ニューロンへのアクセスが大幅に改善されます。網膜分割法は、新しいアプローチへの扉を開き、実験のペースを加速させます。例えば、この手法を用いて、双極細胞にチャネルロドプシンを発現させることにより、メラノプシン神経節細胞への双極細胞入力を研究する予定です。

split-retina-as-an-improved-flatmount-preparation-for-studying-inner

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

伝統的に垂直方向のスライスと網膜のホールマウントの準備は、網膜回路の機能を研究するために使用されている。ここで、我々は、無傷の網膜神経細胞の樹枝状形態を維持する方法をスライス小説を説明します。...

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ヒト以外の霊長類は、開発と老化の理解のための重要な並進種です。霊長類の網膜の解剖学的組織は、ヒトの正常と病理学的状態に重要な洞察を提供することがあります。...

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私たちは、水生虎サンショウウオ（から薄い網膜スライスの調製を記載...

両生類網膜スライス標本における感光体と2次ニューロンからの同時ホールセル録音

ここで説明するプロトコルは、全量網膜製剤の構造評価のためのものです。これには、組織解剖、親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンインサートへのマウント、蛍光マーカーによるボーラスローディング、細胞およびシナプス成分の免疫組織化学的分析のためのカルボジイミドおよびパラホルムアルデヒドによる固定の比較の説明が含まれます。...

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

げっ歯類の網膜は、長い脳へのアクセス可能なウィンドウとして認識されている。この技術的な論文では、虚血性損傷後の中枢神経系内の血管再生の故障につながるメカニズムを研究するために、酸素誘発性網膜症のマウスモデルを採用しているプロトコルを提供する。説明したシステムはまた、網膜およびCNS内の機能の血管の成長を促進するための戦略を探求するために利用することができる。...

マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

このプロトコルは、フラットマウント調製物から網膜ニューロンの全細胞パッチクランプ記録を実行する方法を示しています。...

Deafferentatedマウス網膜のフラットマウントの準備中のスターバーストアマクリン細胞のパッチクランプ記録

私たちは、網膜の表面に平行に切片化の面で大人の哺乳類の網膜の水平スライス標本を開発しました。 nonradially指向の網膜神経細胞の樹状のフィールドは、パッチクランプおよびイメージング技術と信号処理の研究を可能にする、切り捨てられませんでした。...

電気生理学的研究のための成体マウスの網膜の水平スライスの調製

網膜組織を撮像すると、従来の生化学的方法から収集することはできません単一セル情報が提供できます。このプロトコルでは、共焦点レーザー顕微鏡のゼブラフィッシュの網膜スライスの準備について説明します。蛍光遺伝子センサーをエンコードまたはインジケーター染料網膜細胞の多数の生物学的過程の可視化を許可します。...

Ex Vivoイメージング実験アダルト ゼブラフィッシュから準備新鮮な網膜スライス

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組織学的分析のためのヒトの眼からの網膜色素上皮/脈絡膜フラットマウントの効率的かつ一貫した生成

学ぶ、マウス網膜のスプリットフラットマウント調製法により内核層ニューロンへのアクセスを向上させる手法。この技術は免疫蛍光染色と電気生理学実験の効率を20倍以上高速化し、視覚処理の神経回路研究に応用できる。

脊椎動物の網膜の内核層ニューロンを研究するための改良されたフラットマウント調製としてのスプリット網膜

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