Name: マイクロ流体と質量測光の結合によるマイクロモル濃度でのタンパク質複合体形成の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶマイクロ流体と質量測光を組み合わせた手法で、マイクロモル濃度のタンパク質複合体形成を解析する方法です。弱い相互作用や一過性の結合をラベルや固定化なしで検出でき、細胞内タンパク質動態の理解に貢献します。

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W.S.は、UKRIフューチャーリーダーズフェローシップ[MR / V02213X / 1]によってサポートされています。原稿のテキストとグラフィックは、Refeynの科学コミュニケーションチームのメンバー(Panagiota Paganopoulou、Neus Torres Tamarit、Catherine Lichten)の支援を受けて作成されました。また、Camille Hetez、Sofia Ferreira、Matthias Langhorstからの貴重なフィードバックにも感謝します。

1. 機器の準備とソフトウェアの起動
<ol><li>質量光度計の電源を入れ、少なくとも1時間オンのままにしてから測定を開始してください。 注意: これは、機器が一定の温度に達する必要があるためです。質量光度計を1時間オンにしたままにしないと、質量シフトが発生し、結果が不正確になる可能性があります。</li>
	<li>電源を入れ、アイソレーションボタン(質量光度計の下)を押して、防振テーブルの電源を入れます。振動は質量測光装置の性能を制限するため、装置の感度を最大限に高めるには防振テーブルが重要です。マイクロ流体ボックスをオンにします。</li>
	<li>データ収集ソフトウェアとマイクロ流体制御ソフトウェアを起動します。エアコンプレッサーをオンにします。</li>
</ol>2. タンパク質サンプル、バッファー、洗浄液の調製
<ol><li>200 mLのPBS(pH 7.4)緩衝液を清潔な200 mLボトルに加え、200 mLのPBS(pH 5.0)緩衝液を2本目の200 mLボトルに加えます。 注:200 mLボトルは、次のステップで「L」フローユニットセンサーに接続する必要があります。校正測定にはpH 7.4 PBS緩衝液を、サンプル測定にはpH 5.0 PBS緩衝液を使用してください。</li>
	<li>0.5 mLの遠心チューブで、IgG(2 μM)とFcRn(20 μM)を1:10の比率で混合し、総容量を60 μLにします。<ol><li>FcRnとIgGのストック溶液は、それぞれ91.9μMと13.5μMです。9 μLのストックIgG + 13 μLのストックFcRn + 38 μLのPBS(pH 5.0、室温[RT])を遠心分離チューブ内で総容量60 μLに混合して反応液を調製します。2つの反応物の最終濃度は、IgGで2 μM、FcRnで20 μMでした。</li>
	</ol></li>
	<li>別の0.5 mL遠心チューブで、20 μM濃度のβ-Amylaseキャリブラント20 μLを分注します。<ol><li>例として、ここで使用するβ-アミラーゼキャリブラントを準備するには、2.3.1.1-2.3.1.2で説明されている手順に従います。<ol><li>バイアル中の20 mgのβ-アミラーゼ粉末を、5.6 mg / mLに相当し、モル濃度100 μM(分子量56 kDa)の3.57 mLのPBS(5%グリセロール)に再懸濁します。.</li>
			<li>20 μMに希釈するには、100 μMストックの200 μLと800 μLのPBS(pH 7.4、RT)を1 mLの遠心分離チューブに入れます。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>サンプルをRTで少なくとも30分間インキュベートします。 注:質量光度計の電源を入れた後、サンプルと校正希釈液の準備を開始します。この実験では、サンプルを120分間インキュベートしました。</li>
	<li>3本の50 mL遠心分離チューブに、50 mLのPBS(pH 7.4)-洗浄液1(CS1)、50 mLの0.5 M NaOH-洗浄液2(CS2)、および50 mLの100%IPA-洗浄液3(CS3)を分注します。</li>
</ol>3. 実験のセットアップ
<ol><li>サンプルとキャリブラントをロードするには、キャリブラント遠心分離管をマイクロ流体ボックスの位置4に、サンプル遠心分離管を位置5に配置します(図1)。</li>
	<li>洗浄液をロードするには、CS1、CS2、およびCS3をマイクロ流体ボックスの位置1、2、および3に配置します(図1)。 注意: サンプル、キャリブラント、および洗浄液はマルチスイッチ(mスイッチ)に接続されています。Mスイッチは「S」フローユニットセンサーに接続されています。</li>
	<li>バッファーラインに接続するキャップを200 mL(pH 7.4)バッファーボトルにねじ込みます。 注意: バッファーラインは「L」フローユニットセンサーに接続されている遮断弁に接続されています。シャットオフバルブは、バッファフローが停止したときに発生する可能性のある吸い上げ効果を防ぎます。吸い上げると、バッファーリザーバーに戻る希釈された残留液からバッファーが汚染される可能性があります。</li>
	<li>マイクロ流路チップを調製プレートに置きます。 「S」フローユニットセンサーのもう一方のチューブ端を、マイクロ流体チップの最初のチャネルの「サンプルインレット」に押し込みます(図1)。横断抽出ラインが完成しました。</li>
	<li>「L」フローユニットセンサーのもう一方のチューブ端を、マイクロ流体チップの最初のチャネルの「バッファーインレット」に押し込みます(図1)。バッファラインが完成しました。</li>
	<li>流出を収集するには、マイクロ流体チップの最初のチャネルの「アウトレット」にチューブを押します。もう一方の端を、廃棄物を受け入れるフラスコまたはビーカーに排出するように配置します(図1)。</li>
</ol>4. サンプルラインとバッファーラインをバッファーで下塗りします
<ol><li>バッファーラインの手動遮断弁を開きます。</li>
	<li>マイクロ流体制御ソフトウェアで、バッファラインの流量を1000μL/minに設定し、バッファラインの圧力が110mbarを超えないようにします(図2)。フローはバッファラインで自動的に開始されます(図1)。 注意: バッファーラインの圧力が110mbarを超える場合は、フローセンサーを通過する空気が原因である可能性があります。圧力が数秒以内に正常に戻らない場合は、詰まりの可能性があります(通常は接続部でチューブが挟まれていることが原因)。その場合は、流れを止め、遮断弁から始まるバッファーラインの接続を確認してください。</li>
	<li>マイクロ流体制御ソフトウェアで、mスイッチの位置1(PBSバッファーに対応)を選択し、サンプルラインの流量を8μL/minに設定し、サンプルラインの圧力が350mbarを超えないようにします。流れはサンプルラインで自動的に開始されます(図1)。</li>
	<li>ピペットチップ(またはその他の軟質プラスチック部品)を使用して、チップに閉じ込められた気泡の近くから上から穏やかに圧力をかけ、気泡を取り除き、気泡が出口から確実に除去されるようにします。 注意: 使用中のチャネルの「ミキサー」セクションと「観察エリア」(図1)セクションのすべての気泡を必ず取り除いてください。強く押しすぎるとチップが損傷する可能性があるため、注意してください。</li>
</ol>5. マイクロ流体チップを質量光度計に載せ、焦点を合わせる
<ol><li>質量光度計の対物レンズに顕微鏡浸漬油を一滴垂らします。</li>
	<li>マイクロ流体チップを「サンプルインレット」を上に向けて質量光度計のホルダーに置き、ステージクランプに取り付けたままにします(図1)。すべてのチューブ接続が接続されたままであることを確認してください。</li>
	<li>データ収集ソフトウェアを使用してステージを移動し、チャンネル1の「観察領域」が対物レンズと揃っていることを確認します(図1)。</li>
	<li>質量光度計の蓋を閉め、データ集録ソフトウェアの 液滴希釈検出フォーカス オプションを押します。</li>
	<li>データ収集ソフトウェアの左下隅にある白いフォーカスリングを確認します(図3)。リングの隙間は、浸漬油に空気の泡が存在することを示しています。ステージ速度を最大まで上げ、ステージを横方向にゆっくりと動かすことで、これを取り除きます。</li>
	<li>ピント合わせが完了したら、2〜3分待ってから最初の録音を行います。次に、 Record を押して1分間の測定値を記録し、(測定値を観察して)不純物が現れないことを確認します。 注意: 不純物はガラス表面または緩衝液中に存在する可能性があります。データ収集ソフトウェアのシャープネス値は4.5%を超える必要があります。</li>
</ol>6. 質量測光キャリブレーション
<ol><li>マイクロ流体制御ソフトウェアで、mスイッチを位置4(校正器に対応)に切り替え、サンプルラインの流量が8μL/minに設定され、サンプルラインの圧力が350mbarを超えないようにします(図2)。<ol><li>キャリブラントはチップを通る流れを開始します。約1.5〜2.5分待ちます(または、データ収集ソフトウェアでキャリブラントが一貫して表示されるまで)。時間は、サンプルラインのチューブの長さによって異なる場合があります。</li>
	</ol></li>
	<li>キャリブラントが一貫して確認されたら(つまり、正確な質量測光測定に十分なイベント数)、マイクロ流体制御ソフトウェアで、流量をこの実験の目標希釈レベルである0.5μL/minに減らします。 注:流量を高くすると、キャリブラントがチップに到達するのに必要な時間が短縮されます。</li>
	<li>測定面に着地する分子が「少なすぎない」または「多すぎない」ことを確認してください(図4)。<ol><li>着地イベント密度が「理想的」でない場合は(図4)、マイクロ流体制御ソフトウェアで流量を変更します。イベント密度が低すぎる場合は、十分に分離されたランディングイベントが観察されるまでサンプル流量を上げます(ただし、8 μL/分を超えないようにしてください)。高すぎる場合は、サンプル流量を下げてください(ただし、0.1μL/minを下回らないようにしてください)。</li>
		<li>サンプルチューブ内のキャリブラント容量が少なくなっている場合は、空気が注入されないように、mスイッチの位置をPBS pH 7.4ライン(位置1)に変更します。</li>
	</ol></li>
	<li>[記録]を押して、60秒測定します。選択したフォルダにファイルを保存します。 メモ: データ集録ソフトウェアは、拡張子が.mpのファイルを生成します。</li>
</ol>7. サンプルラインのクリーニングと流れの停止
<ol><li>マイクロ流体制御ソフトウェアで、mスイッチの位置2に切り替え、サンプル圧力を800 mbarに変更します(図2)。CS2(NaOH)でシステムを4分間フラッシュします。</li>
	<li>mスイッチの位置3に切り替え、CS3(IPA)でシステムを4分間フラッシュします。</li>
	<li>mスイッチの位置1に切り替え、CS1(PBS)でシステムを4分間フラッシュします。</li>
	<li>マイクロ流体制御ソフトウェアで、サンプルラインとバッファーラインの圧力を0に設定してすべての流れを停止し、バッファーバルブを停止します。</li>
	<li>切りくずをステージから外し、準備プレートに戻します。すべてのチューブを外し、サンプルチューブの端を廃液ボトルに入れます。イソプロパノールとワイプで対物レンズを洗浄します。</li>
</ol>8. 質量測光サンプルの測定
<ol><li>200 mL(pH 7.4)緩衝液ボトルに接続されたキャップを緩め、200 mL(pH 5.0)緩衝液ボトルにねじ込みます。</li>
	<li>手順3.4〜5.6を繰り返しますが、チップの最初のチャネルではなく2番目のチャネルを使用します。</li>
	<li>マイクロ流体制御ソフトウェアで、mスイッチを位置5(サンプルに対応)に切り替え、サンプルラインの流量を8μL/minに設定し、サンプルラインの圧力が350mbarを超えないようにします(図2)。</li>
	<li>手順6.2〜6.4を繰り返して、サンプルを測定します。<ol><li>使用する流量を計算するには、流量の倍率差が目的のサンプル希釈係数と一致していることを確認してください。たとえば、ここで2000倍の希釈を達成するには、流量は2000倍異なります。バッファー流量は1000μL/min、サンプル流量は0.5μL/minです。実験の最後には、クリーニング手順に従って、常にラインを清潔に保ちます。</li>
	</ol></li>
</ol>9. データ分析
<ol><li>データの取得が終了したら、データ解析ソフトウェアを起動します(図5)。</li>
	<li>左上のプラス(+)アイコンをクリックし、.mpキャリブラントファイルを選択します。ソフトウェアは、ロードされたファイルの分析を開始します。サイズと測定回数によっては、数分かかる場合があります<ol><li>データ集録ソフトウェアでデータを取得している間は、データ解析ソフトウェアで.mpファイルを解析すると、データの品質が低下する可能性があるため、解析しないでください。</li>
	</ol></li>
	<li>Create mass calibration ボタン(右下)を押します。ダイアログが開き、フィットしたピークのコントラスト値が入力された表が表示されます。</li>
	<li>値を近似ピークの既知の質量値に変更し(β-アミラーゼの場合、これらの値は56 kDa、112 kDa、および224 kDaです)、 Saveを押します。新しく作成されたキャリブレーションファイル(拡張子.mc)が [Mass Calibration ]パネル(データ解析ソフトウェアの左下)に表示されます(図6)。</li>
	<li>左上のプラス(+)アイコンをクリックし、.mp サンプルファイルを選択します。</li>
	<li>図 5 に示すように、質量ヒストグラムを作成するには、[解析] タブに移動し、[ヒストグラム] モードと [質量プロット] オプションを選択します。必要に応じて、ビンの幅、質量制限、およびその他のパラメーターを調整します。</li>
	<li>必要に応じて、図をエクスポートしたり、ワークスペース全体を.dmpファイルとして保存したりする前に、 図 タブでプロットをさらにカスタマイズします。</li>
</ol>

マイクロ流体による質量測光分析の濃度範囲の拡大

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</ol>

Myndert ClaasenとZornitsa Kofinovaは、この記事で使用する質量光度計とマイクロ流体システムを製造しているRefeyn Ltdの従業員です。Weston Struweは、Refeyn Ltd.の株主兼コンサルタントです。

ここで概説するプロトコルは、低親和性タンパク質間相互作用を検出および定量する方法を提供します。これは、急速希釈マイクロ流体システムに結合された質量光度計を使用します。質量測光は、30 kDaから6 MDaの範囲の生体分子16の溶液中の分子量を確実に測定できる、ラベルフリーのバイオ分析ツールです。質量測光は、試料を1つずつ分析する1分子の手法であるため、一般的には100pM〜100nMの濃度範囲の試料に限られます。この範囲を超えると、ガラス表面に着地する分子が空間的に重なり合い、データ品質が低下します。この範囲を下回ると、得られたデータが少なすぎて、ロバストな分析を行うことができません7。重要な結果は、タンパク質相互作用の研究を、その範囲内で結合種と非結合種の混合物を形成するものに限定できることです。
ここでは、急速希釈マイクロ流体システムを使用して、質量測光に適したサンプル濃度の範囲を効果的に拡大するための段階的なプロトコルについて詳しく説明します。マイクロ流体チップ上でサンプルを希釈し、50 ms以内に検出器観察ウィンドウを横切って流すことにより、システムは相互作用平衡がシフトする前に、希釈されていないサンプルに存在する複合体を捕捉します。サンプルは、個々の測定中に検出器に連続的に送達されます。これらの条件下では、複合体の95%は、低親和性相互作用の場合でも、サンプルを測定したときに無傷のままです-マイクロモルオーダーのKDと1s-1の速さで解離速度。
これは次のように計算できます:順方向速度kfおよび逆方向速度kbの反応<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq01.jpg" style="margin: auto;">の場合、
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq02.jpg" style="margin: auto;">
平衡状態では、3つの種(A、B、および複合体 AB)すべての濃度が一定に保たれるため、 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq03.jpg" style="margin: auto;"> と <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq04.jpg" style="margin: auto;">になります。摂動(この場合は希釈)によって複合体が解離する可能性があるが、順方向(会合)反応は進行しないという控えめな仮定の下では、 用語kf [A] [B]は無視できるものとして扱うことができ、次のように単純化することができます。
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq06.jpg" style="margin: auto;">
積分すると、平衡摂動後の時間における錯体の濃度について、次の式が得られます。
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq07.jpg" style="margin: auto;">
平衡摂動後の時間 t で結合されたままの複合体の割合は、次のようになります。
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq08.jpg" style="margin: auto;">
= 50 msで、kbと1 s-1との反応の場合≈フラクションの束縛は0.95、つまり95%11,12です。
質量測光は、IgGモノクローナル抗体トラスツズマブのFcRnの可溶性ドメインへの結合を調べるために、ここでも以前にも 使用されました5。2つの結合パートナーは、酸性pH17でナノモル親和性で結合することが報告されています。質量測光を使用して、結合パートナーがpH 5.0にある間に形成された複合体の存在量を定性的に評価し、サンプルを追加のマイクロ流体システムを介して急速に希釈しました。この手順は、以前に報告された結果に基づいて、特定のタンパク質間相互作用に最適化されました5。ユーザーが予備知識を持っているか、使用するバッファー、初期タンパク質濃度、予想される化学量論、相互作用が平衡に達するために必要なインキュベーション量など、問題のシステムの実験条件を最適化していれば、同じ手順を使用して他の相互作用を研究することができます。
IgG-FcRn混合物を手動で希釈すると、これらのタンパク質が相互作用することが知られているにもかかわらず、IgG-FcRn複合体の存在を検出することは困難でした5。この論文は、急速希釈アプローチにより、これらの複合体の量が著しく増加することを示しています。同じサンプルについて、急速希釈を使用した場合、1:1のFcRn-IgG複合体と2:1のFcRn-IgG複合体の両方が明確に観察されました。これらの複合体形成の違いは、広範囲の濃度にわたる生体分子相互作用系を研究することの重要性を示しています。
さらに、これらの結果は、マイクロ流体工学と単一分子分析を使用して弱い相互作用を捕捉することが容易であり、この手法の大きなギャップを埋めることも示しています。急速希釈マイクロ流体工学と質量測光の組み合わせは、分析技術としての質量測光の利点により、魅力的な利点を提供します。つまり、質量測光は標識を必要とせず、最小限のサンプル調製で済み、測定は溶液中で行われます。このプロトコルでは、質量測光のもう一つの重要な利点は、形成されたすべての種を区別および定量できることです(&gt;30 kDaの明確な質量を有する場合)。これは、例えば、結合速度と非結合速度を測定できるが、化学量論に関する情報を容易に提供できないSPRとは対照的である8。
このプロトコル、およびより一般的な質量測光実験では、いくつかの考慮事項が役立ちます。まず、最終的なタンパク質濃度は、質量測光法で測定できる限界(100 pM-100 nM)内にある必要があります。開始インキュベーション濃度も、マイクロ流体系の範囲(最大90μM)内にあり、相互作用の実際のKD を超えると理論化されるべきである10。推奨される開始点は、μM濃度で相互作用する種間の1:1の濃度混合比です。次に、比率を1:2、1:5、またはこの交互作用の場合のように1:10に変更できます。タンパク質相互作用に関する事前情報がない場合、ユーザーは、各パートナーの高濃度(推奨20 μM)から始めて、成分の親和性が提示された方法で維持される濃度範囲内にあるかどうかを判断する(つまり、複合体が形成される)実験を最適化する必要があります。最適化には、相互作用を促進するための他のバッファー条件の選択や、適切な混合比を決定するための相互作用成分の1つの滴定も含まれる場合があります。これらが決定されると、濃度と流量を最適化して、研究と分析法に最適な条件(濃度を下げてピーク分離能を向上させるなど)が可能になります。
第二に、この実験を正常に再現するには、不純物を最小限に抑える必要があります。質量測光測定に悪影響を及ぼすことが知られている不純物の一般的な発生源には、精製後に残存する他のタンパク質または細胞破片、ろ過されていないバッファー、ミセル形成界面活性剤(高濃度で存在する場合)、および高濃度の塩、グリセロール、またはその他の成分を含むバッファーが含まれます。上記の議定書で説明したように、マイクロ流体システム内の気泡は除去する必要があります。気泡は、チューブシステム内で形成される場合、またはサンプルの表面張力が高く、泡が形成されやすい場合に発生する可能性があります。気泡は浸漬油中にも形成され、フォーカスリングから検出できます(図3)。プロトコルに記載されている手順を使用して気泡を除去できない場合は、デシケーターと真空ポンプを使用してサンプルを脱気し、サンプルを数分間減圧下に置きます。高濃度のタンパク質溶液をボルテックスまたは振とうすることは、気泡の形成を促進する可能性があるため、推奨されません。
ここでは、1つの特定のタンパク質間相互作用の測定が実証されていますが、同じプロトコルを他のタンパク質間相互作用系にも、大きな変更を加えることなく適用することができます。このプロトコルのさらなる将来の方向性は、質量測光の文脈で他の場所で説明されているように、測定を使用して同定された錯体のKD値を計算することです5,7。以前の研究では、手動希釈とより強い相互作用を含む実験からのデータが使用されていましたが、マイクロ流体デバイスのさらなる改善が実装されれば、分析原理はこのコンテキストに容易に適用できます(流量センサーの精度とポンプの安定性の向上など)。
タンパク質間相互作用以外にも、質量測光と急速希釈マイクロ流体法を組み合わせた幅広い用途が期待されます。質量測光は、サンプルの純度、凝集、および均質性を評価するために使用できます18,19。タンパク質オリゴマー化20、高分子集合体21または重合22を研究する。そして他の分野で。質量測光分析は、タンパク質以外にも及びます。これは、核酸とタンパク質23、ウイルス粒子24、およびナノ粒子25との間の相互作用を調べるために使用されています。したがって、このプロトコルは、複合質量測光マイクロ流体システムの重要なアプリケーションを記述しています-個々の分子および複合体のレベルで弱いタンパク質間相互作用を直接測定できます。本アプリケーションの価値は高く、一般的に研究が困難であった相互作用を、重要な治療領域全体で関連性のある方法で直接特徴付ける可能性を開きます。この組み合わせたアプローチは、数十マイクロモルまでの濃度のサンプルのより広範な調査の基礎としても役立つ可能性があります。

タンパク質間相互作用は、免疫調節からDNAの複製や翻訳まで、ほとんどの細胞機能を強調しています。その結果、生命科学全体を通じて、一般的に形成される多様な不均一複合体にわたる広範囲の相互作用を調査することが根本的に求められています。しかし、それらの検出、特性評価、定量は、特に親和性の低い相互作用では困難な場合が多いです1。
免疫沈降アッセイは、高親和性相互作用の検出によく使用されますが、低親和性および一過性相互作用の場合、検出はほとんど不可能です2。蛍光技術も使用できますが、蛍光標識の潜在的に破壊的な添加が必要です2。クライオ電子顕微鏡は、高い空間分解能で形成されたタンパク質複合体の構造スナップショットとアンサンブル読み出しを提供できますが、通常、低親和性相互作用をイメージングするには低濃度で作業する必要があります。クライオ電子顕微鏡は、コスト、アクセス性、サンプル調製、分析時間に関する課題ももたらします3。
さらに、表面プラズモン共鳴(SPR)は、タンパク質間相互作用を定量化するための一般的な方法になっていますが、タンパク質の固定化が必要であり、結合平衡に影響を及ぼし、オンレートが変動するため、測定精度が低下する可能性があります4,5。また、データ収集と分析の前にいくつかのアッセイステップも含まれます6。
質量測光は、タンパク質間相互作用の分析に用いられてきた単一分子技術である5,6,7。これは、ガラスカバーガラスの表面に着地したときに散乱する光に基づいて、単一分子または錯体の質量を測定することによって機能します8。質量測光測定は、結合パートナーの相対的な存在量とそれらが形成する複合体からの結合親和性を定量化するために使用されてきました5。それにもかかわらず、他の単一分子技術と同様に、測定されるサンプルの濃度は通常100 nM未満である必要があります。濃度が高いと、ガラス表面に着地する分子が空間的に重なり合い、データ品質が低下します7。その結果、これらの低濃度で解離する弱い相互作用(KD ~マイクロモル)は、非結合種と結合種5の必要な混合物を観察することができないため、確実に測定することができない。
ここでは、新しい結合マイクロ流体質量測光デバイスに基づいて、この制限を克服するアプローチについて説明します。具体的には、マイクロ流体システムを質量光度計と組み合わせて使用し、質量測光で定量化できる相互作用の範囲を効果的に拡大します。マイクロ流体工学は、弱い相互作用を検出するための迅速な希釈など、タンパク質間相互作用を研究するためのさまざまな可能性を提供することが示されています1,9。本明細書に記載のシステムは、マイクロ流体チップ上で試料を10,000倍まで急速に希釈し、直ちにチップの観察領域を横切って流すことによって動作し、分子が希釈プロセスを開始してから50ms以内に質量測光測定を開始することを可能にする10。希釈は、サンプルとバッファーがチップ上の逆テスラバルブミキサーで混合されるときに発生し、2つの溶液の相対流量によって発生する希釈量が決まります(プロトコルステップ8を参照)。流量はマイクロ流体制御ソフトウェアで制御できます。流量を変更すると、質量光度計で測定されるガラスの表面への着地イベントの数に影響を与える可能性があるため、種の相対的な個体数が変化する可能性があります。
プロセスの速度は、相互作用の完全性が損なわれる前に測定を完了するのに十分な速さです(詳細については、ディスカッションも参照してください)。これは<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq01.jpg" style="margin: auto;">、一次反応の理論を簡単に見ることで理解できます。前方(連合)速度定数はkf、後方(解離)速度定数はkb、平衡解離定数(KD)は次のように定義されます。
KD= kb/ kf
タンパク質結合の場合、kfは一般に反応物の拡散によって制限されるため11、したがって106-10 7 M-1·s-1の範囲に制限される。範囲が限られているため、低親和性(KD~マイクロモル)反応はkb≈ 1 s-1になります。つまり、kb= kf ·KD =(106 M-1・s-1)(10-6 M)= 1 s-1、複合体の半減期は約0.7秒11,12です。
我々のシステム例は、IgGモノクローナル抗体トラスツズマブの、既知の相互作用パートナーであるIgG新生児Fc受容体(FcRn)の可溶性ドメインへの結合である13。従来の質量測光のみを使用して(つまり、サンプルを手動で希釈して)得られた以前に発表されたデータは、タンパク質が複数の種を形成することを示しました。FcRnモノマー、FcRn二量体、および非結合IgGがはっきりと見え、IgG-FcRn複合体(1:1および1:2の比率)も(pH 5.0で)検出されましたが、存在量は非常に少なかった5。この観察結果は、IgG-FcRn複合体の形成を、より高い濃度で測定した場合、より明確に検出できるかどうかという疑問を提起します。実際、質量測光法とここで説明した結合急速希釈法を組み合わせると、測定された粒子の増加による複雑な形成のより堅牢な証拠が得られました。
ここで説明する質量測光およびマイクロ流体プロトコルは、マイクロモル範囲までの KDを有する複合体の形成を特徴付けることを可能にする。KD を経験的に決定するには、流量センサーの精度、ポンプの安定性、チップ間のばらつき、および観察ウィンドウ内の測定位置をさらに改善する必要があります。
質量光度計(30 kDa〜6 MDa)での分析に適した範囲に収まる明確な分子量(少なくとも25 kDaで分離)がある場合、同じアプローチを適用して可溶性タンパク質間の結合を調べることができます。得られた知見は、細胞機能の機構的理解から新しいバイオ医薬品の設計まで、さまざまな状況での研究に役立つ可能性がある。

<table><tbody><tr><td>2-プロパノール (イソプロパノール)</td><td>VWR International LLC</td><td>20880.320</td><td></td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェア</td><td>Refeyn</td><td>AcquireMP (v2022 R1)</td><td></td></tr><tr><td>データ分析ソフトウェア</td><td>Refeyn</td><td>DiscoverMP (v2022 R1)</td><td></td></tr><tr><td>FCRN, His-Tag</td><td>Sigma</td><td>SRP0624</td><td></td></tr><tr><td>Herceptin (IgG)&nbsp;</td><td>ケンブリッジバイオサイエンス</td><td>HY-P9907-1mg</td><td></td></tr><tr><td>質量光度計</td><td>Refeyn</td><td>TwoMP</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体ボックス</td><td>Refeyn</td><td>MassFluidix HC システム</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体チップ</td><td>Refeyn</td><td>MassFluidix HC チップ</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体制御ソフトウェア</td><td>Fluigent</td><td>OxyGEN</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、1x ウルトラピュア</td><td>VWRインターナショナル</td><td>LLCK812</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-アミラーゼ、サツマイモ</td><td>シグマ</td><td>A8781</td><td></td>から</tr></tbody></table>

マイクロ流体と質量測光の結合によるマイクロモル濃度でのタンパク質複合体形成の解析

Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

質量測光は、ラベルなしで溶液中の生体分子相互作用と複雑な形成の研究を可能にする汎用性の高い質量測定技術です。質量測光は、一般に100 pM〜100 nMの濃度範囲のサンプルの分析に適しています。しかし、多くの生物系では、低親和性または一過性の相互作用を研究するために、より濃縮されたサンプルを測定する必要があります。ここでは、質量測光で分析できる試料濃度の範囲をナノモルから数十マイクロモルまで効果的に拡大する手法を実証します。 
このプロトコルでは、質量測光を新しいマイクロ流体システムと組み合わせて、マイクロモル濃度範囲の溶液中のタンパク質複合体の形成を調査します。マイクロ流体システムを使用すると、ユーザーはサンプルを目的の高濃度に維持し、その後、質量測光測定の数ミリ秒前にナノモル範囲に希釈することができます。希釈の速度により、サンプルの平衡がシフトする(つまり、複合体の解離)前にデータが得られます。 
この手法は、免疫グロブリンG(IgG)抗体と新生児Fc受容体との間の相互作用を測定するために適用され、静的質量測光測定では定量化できなかった高次複合体の形成を示しています。 
結論として、質量測光とマイクロ流体工学の組み合わせにより、マイクロモル濃度範囲でサンプルを特徴づけることが可能になり、親和性の弱い生体分子相互作用の測定に熟達しています。これらの機能は、バイオ医薬品の開発や設計など、さまざまな状況に適用でき、多様なタンパク質間相互作用の詳細な特性評価を可能にします。

質量測光を使用して、IgGモノクローナル抗体トラスツズマブとIgG新生児Fc受容体(FcRn)の可溶性ドメインとの間の相互作用を測定しました。2つのタンパク質の1:10混合物(IgGの場合は2 μM、FcRnの場合は20 μM)を、PBSでそれぞれ10 nMおよび20 nMに手動で希釈しました。
単一分子の質量測定技術である質量測光法では、100 pM〜100 nMの範囲のサンプルしか分析できないため、希釈ステップが必要です。この範囲外の濃度のサンプルを測定しようとすると、結果の精度が損なわれる可能性があります(図4)。この実験は、前述したように、この議定書には含まれていない5,6。
質量測光実験で生成された質量ヒストグラムでは、各着陸イベントの散乱信号(または「コントラスト」)の強度がx軸にプロットされ、質量コントラストキャリブレーションステップを介して分子量に変換されます。一方、y軸は、与えられた質量(またはコントラスト)で数えられた分子の数を示します。したがって、ピークは、x軸に示されている分子量の範囲内に分子の集団が存在することを示します。ピークを構成するイベント(カウント)の数は、その母集団のサイズを反映しています。
手動希釈による質量測光測定の結果、タンパク質の予想分子量に基づく2つの最大のピークが、非結合FcRnモノマー(~50 kDa)およびIgG抗体モノマー(~150 kDa)に対応する質量ヒストグラムが得られました(図7)。以前に発表された質量測光データ5と同様に、非結合種が顕著であったが、複合体に対応する質量範囲のピークはそれほど目立たなかった。
実験は、質量測光測定の直前に混合物を必要な濃度に希釈するために、急速希釈マイクロ流体システムを使用して繰り返されました。このアプローチにより、手動希釈ステップ中に解離した可能性のある追加の低親和性複合体の検出が可能になりました。手動希釈実験で使用したのと同じ2000倍の希釈係数を達成するために、1:10のサンプル混合物(IgGの場合は2 μM濃度、FcRn濃度は20 μM)を、PBSバッファー(pH 5.0)とともに1 mL/分の流速でマイクロ流体チップに0.5 μL/minの速度で流しました。測定時にタンパク質が分解されていないことを確認するために、サンプルを120分間インキュベートした後、マイクロ流体システムを使用してIgG(2μM)およびFcRn(20μM)をフロー下で測定しました。個々の対照測定ではタンパク質分解は見られませんでした(補足図1)
急速希釈したサンプルでは、FcRnモノマー(53 kDa)、FcRn二量体(97 kDa)、およびIgGモノマー(148 kDa)に対応するピークが再び観察されました。また、196 kDaと251 kDaで2つの追加のピークがはっきりと観察され、1:1および1:2の化学量論を持つIgG-FcRn複合体に対応しました(図7)。これら2つの錯体の予想質量は、それぞれ200 kDaと250 kDaでした。質量測定の変動は、この研究で使用された質量光度計の測定誤差が±5%14 (1:1複合体で2%、1:2複合体で0.4%)の範囲内です。
これらの錯体が急速に希釈された試料のみに存在することは、それらが低濃度で解離する傾向があり、手動希釈プロセスに比べて速いが、マイクロ流体システムで達成される急速希釈プロセスに比べて遅いという考えと一致している15。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig01.jpg"> 図1:マイクロ流体と質量測光の組み合わせ (A,B) このプロトコルで使用したマイクロ流体ボックスを、(A)正面と(B)上から見たところ。洗浄液は位置1〜3に、サンプルとキャリブラントは位置4〜6に配置します。すべてのソリューションは、「スモール」フローユニットセンサーに接続されているmスイッチに接続されています。(C)システム全体の概要。コンピューター(左上)は、マイクロ流体チップが配置されているマイクロ流体ボックス(バッファーとサンプルチューブに隣接して表示)と質量光度計(右下)に接続されています。小流量モニター(FRMS)はサンプルラインを通る流量を監視し、大流量モニター(FRML)はバッファーフローを監視します。サンプルとバッファーラインのチューブは、質量光度計内に配置されたマイクロ流体チップ上のチャネルに接続します。(D)各チップには3つのチャネルがあります。FRMSはサンプルインレットに接続され、FRMLはバッファインレットに接続されます。ミキサーエリアはサンプルの迅速な希釈が行われる場所であり、観察エリアは質量測光測定が行われる場所です。出口は追加の流量センサーによって監視され、チップに漏れがないことを確認します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig02.jpg"> 図2:マイクロ流体制御ソフトウェア。 このソフトウェアを使用して、流量、マイクロ流体システムの圧力ライン、およびマルチスイッチ(mスイッチ)の位置を設定および監視します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig03.jpg"> 図3:油中の気泡の存在の特定。 データ収集ソフトウェアの例では、透明で壊れていないフォーカスリング(左)と「壊れた」リングが示されており、浸漬油中に気泡が存在することを示しています(右)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig04.jpg"> 図4:分子の着地イベントの数が少なすぎる、理想的、または多すぎるサンプル濃度の代表的な例。 マイクロ流体チップの観察領域の表面に着地した分子は、質量測光画像のレシオメトリックビューにダークスポットとして表示されます。最適な濃度は、データ収集中に着陸イベントの理想的な密度が発生する可能性のあることです(中央)。着陸事象密度が低すぎると(上は「少なすぎる」)、質量測光データの正確な統計解析ができません。高すぎると(下が「多すぎる」)と、着地分子が空間的に重なり合い、データ品質が低下します。これらの画像は、質量光度計を使用してデータ収集ソフトウェアでキャプチャされました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig05.jpg"> 図5:質量測光用のデータ解析ソフトウェアの画面キャプチャ。 ここでは、データ収集ソフトウェアからエクスポートされた.mpファイルをロードしてデータを分析できます。処理されたデータから数値を生成できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig06.jpg"> 図6:この実験のマスコントラストキャリブレーションの画面キャプチャ。 使用したキャリブラントはβ-アミラーゼで、モノマー(56 kDa)、ダイマー(112 kDa)、および四量体(224 kDa)の3つの種を形成することが知られています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig07.jpg"> 図7:質量ヒストグラムは、サンプルを迅速に希釈した後にのみ複雑な形成を明らかにします。 手動希釈(オレンジ)またはマイクロ流体HCシステム(青)による急速希釈後のIgGおよびFcRnを含むサンプルの測定について、質量ヒストグラムと対応するベストフィットガウス分布が示されています。質量ラベルは、ガウス曲線の平均値が急速希釈後に測定された質量ヒストグラムに適合することを示しています。手動希釈後、FcRnモノマー(手動希釈で測定した52 kDa)およびIgGモノマー(152 kDa)に対応するピークが観察されました。急速希釈後、FcRnおよびIgGモノマーに加えて、1:1および1:2の化学量論を持つFcRn二量体およびIgG-FcRn錯体に対応するピークも明確に観察されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
補足データ 図1:急速希釈後の対照サンプルの質量測光測定では、タンパク質分解は示されませんでした。 (A)質量ヒストグラムとFcRnのみのサンプルの最適ガウス分布。急速希釈前の初期サンプル濃度は 20 μM で、流速は 0.5 μL/min に設定しました。FcRnモノマー(53 kDa)およびFcRn二量体(97 kDa)に対応する質量ピークが観察されました。(B)IgG(ハーセプチン)のみのサンプルの質量ヒストグラムと最適なガウス分布。急速希釈前の初期サンプル濃度は2μMで、流速は1μL/minに設定しました。IgGモノマー(155 kDa)に対応する単一の質量ピークが観察されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/Supplementary%20Data%20Figure%201.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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