Name: ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞における微小管ネットワークの可視化手法。共焦点顕微鏡と免疫染色を用いて微小管動態を解析し、神経系の細胞骨格制御タンパク質の役割を解明する。

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論文に関する議論とコメントをしてくれたYing Xiong博士に感謝します。この研究は、中国国家科学基金会(NSFC)からC.M.(31500839)への助成金によって支援されています。

1.幼虫の解剖
注:解剖液の血リンパ様生理食塩水(HL3.1)18と固定液4%パラホルムアルデヒド(PFA)19,20は、温度が低すぎると微小管が解重合するため、室温で使用します。
<ol><li>長い鈍い鉗子を持つ徘徊する3番目の 幼虫を選びます。HL3.1で洗浄し、実体顕微鏡下の解剖皿に置きます。 注:徘徊する第3齢幼虫は、枝分かれした前気孔によって識別され、約96時間(25°C)21で管の周りを這います。</li>
	<li>背側または腹側を上にして幼虫を配置します。背側は2本の長い気管で、腹側は腹部の歯状突起帯で識別します。<ol><li>観察する組織に応じて、背側または腹側の解剖を選択します。これにより、特定の対象領域をより正確かつ詳細に表示できます。NMJと筋細胞の観察のために、幼虫の背側と腹側をそれぞれ切り開きます。</li>
	</ol></li>
	<li>口のフックと尻尾をピンで留めます。ピンを調整して、幼虫を伸ばした状態に保ちます。幼虫が乾燥するのを防ぐために、HL3.1を一滴加えます。 注:Ca2+ -free HL 3.1は、解剖中の筋肉の収縮を最小限に抑えるために使用できます。</li>
	<li>解剖ハサミを使用して、後端の近くに小さな横方向の切り込みを入れますが、後端を切り落とさないでください。次に、腹側正中線に沿って前端に向かって切断します。</li>
	<li>幼虫の四隅に4本の昆虫ピンを挿入します。幼虫がすべての方向に最大限に伸びるように昆虫ピンを再調整します。</li>
	<li>鉗子を使用して、筋肉を傷つけずに内臓を取り除きます。</li>
</ol>2.固定
<ol><li>100 μL の PFA(4%)を添加し、枝肉を解剖皿に固定したまま 40 分間浸漬します。 注意: PFAは危険であるため、皮膚との直接接触や吸入を避けるために効果的な保護対策が講じられています。</li>
	<li>ピンを取り外し、サンプルを2 mLの微量遠心チューブに移します。0.2% Triton X-100(0.2% PBST)を含む1xリン酸緩衝生理食塩水でPFAを洗い流し、脱色シェーカーで15 rpmで10分間、2 mL微量遠心チューブを満たします。洗浄プロセスを5回繰り返します。</li>
</ol>3. 免疫細胞化学
<ol><li>枝肉をブロッキング剤(0.2%PBST中の5%ヤギ血清)に浸し、室温で40分間ブロッキングします。</li>
	<li>ブロッキング剤を除去し、0.2% PBSTで希釈した一次抗体200 μL(例:抗α-チューブリン、1:1000、抗フッチュ、1:50)を4°Cで一晩希釈したものと交換します。モノクローナル抗αチューブリンによる免疫染色により、筋肉微小管を可視化します。抗Futschは、NMJの微小管形態を間接的に反映することができます。</li>
	<li>一次抗体のインキュベート後、幼虫を0.2%PBSTで10分間洗浄します。</li>
	<li>幼虫を200 μLの二次抗体(例:ヤギ抗マウス-488、1:1000)と0.2%PBSTで希釈し、室温で暗所で1.5時間インキュベートします。</li>
	<li>次に、TO-PRO(R) 3 ヨウ化物 (T3605) などの核色素を 1:1000 の濃度でインキュベーションチューブに 30 分間添加し、暗所で微小管を染色します20,22。</li>
	<li>二次抗体と核色素を0.2% PBSTで10分間洗い流します。暗闇の中で5回繰り返します。</li>
</ol>4. 取り付け
<ol><li>幼虫の死骸を0.2%PBSTに入れたスライドガラスに置き、実体顕微鏡で調整します。幼虫の死骸の内面が上を向いており、すべての幼虫の死骸が希望どおりに配置されていることを確認してください。</li>
	<li>余分なPBST溶液をワイプで吸収し、褪色防止封入剤を静かに一滴加えます。</li>
	<li>スライドにカバーガラスを置き、解剖した幼虫をゆっくりと優しく覆い、気泡を防ぎます。</li>
	<li>カバーガラスの周りにマニキュアを塗ります。スライドを暗い場所に置いて、蛍光の減衰を減らします。</li>
</ol>5. 画像取得
<ol><li>画像を取得するには、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用し、60倍の油浸対物レンズ(開口数1.42)などを選択し、実験に基づいてレーザー出力と波長を調整します。</li>
	<li>NMJを同定するには、セグメントA3の筋肉4の画像をキャプチャします( 図1Fの位置に示されているように)。488 nmレーザーを選択してαチューブリンまたはFutschを活性化し、543 nmレーザーを選択してHRPイメージングトラックを活性化します。パラメータを800ピクセル×800ピクセルのフレームサイズ、2.0のデジタルズーム、NMJの0.8μmのイメージング間隔に調整します(図2)。</li>
	<li>筋肉の微小管を特定するには、気管枝が少ないセグメントA3-A5の筋肉2( 図1Gの位置に示されているように)の画像を撮影します。αチューブリンの活性化には488 nmレーザーを、T3605イメージングトラックの活性化には635 nmレーザーをお選びください。パラメータを1024ピクセル×1024ピクセルのフレームサイズ、3.0のデジタルズーム、および筋肉細胞の0.4μmのイメージング間隔に調整します(図3)。</li>
</ol>

ショウジョウバエの神経筋接合部および筋細胞における微小管ネットワークの表示

<ol><li>Halpain, S., Dehmelt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP1+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP1 family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 7 (6), 224(2006).</li>
<li>Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+microtubule-associated+protein+2+%28MAP2%29+and+its+relevance+for+the+regulation+of+the+neuronal+cytoskeleton+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function.</a> Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).</li>
<li>Dehmelt, L., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP2%2FTau+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 6 (1), 204(2005).</li>
<li>Roll-Mecak, A., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing enzymes.</a> Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).</li>
<li>Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-depolymerizing+kinesins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-depolymerizing kinesins.</a> Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).</li>
<li>Bramblett, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+tau+phosphorylation+at+Ser396+in+Alzheimer%27s+disease+recapitulates+development+and+contributes+to+reduced+microtubule+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding.</a> Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).</li>
<li>Van Vactor, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+morphogenesis%2C+active+zone+organization+and+structural+plasticity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).</li>
<li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch%2F22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).</li>
<li>Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch+regulates+synaptic+microtubule+organization+and+is+necessary+for+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth.</a> Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111 (3), 319-330 (2002).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).</li>
<li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).</li>
<li>Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+katanin+in+severing+microtubules+in+the+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron.</a> The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidgetin+regulates+cultured+astrocyte+migration+by+severing+tyrosinated+microtubules+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge.</a> Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).</li>
<li>Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Tau+and+taxol+on+polymerization+of+MCF7+microtubules+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro.</a> International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).</li>
<li>Velasco, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+depolymerization+contributes+to+spontaneous+neurotransmitter+release+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro.</a> Communications biology. 6 (1), 488(2023).</li>
<li>Höög, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+reveals+a+flared+morphology+on+growing+microtubule+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends.</a> Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+mutations+rescue+human+tau-induced+microtubule+defects+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Mao, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+protein+Katanin+regulates+neuromuscular+junction+development+and+dendritic+elaboration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila.</a> Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Tubulin-specific+chaperone+E+functions+at+neuromuscular+synapses+and+is+required+for+microtubule+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation.</a> Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).</li>
<li>Sarthi, J., Elefant, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dTip60+HAT+activity+controls+synaptic+bouton+expansion+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PloS one. 6 (10), 26202(2011).</li>
<li>Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+factor+essential+for+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A protein factor essential for microtubule assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hereditary+spastic+paraplegia+gene%2C+spastin%2C+regulates+microtubule+stability+to+modulate+synaptic+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function.</a> Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

ここでは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部および筋肉細胞の解剖および免疫染色に関するプロトコルについて説明します。考慮すべき重要なポイントがいくつかあります。まず、解剖プロセスでは、観察された筋肉の損傷を避けることが重要です。鉗子と筋肉の直接接触を防ぐために、内臓を切除する前にフィレットを固定する価値があるかもしれません。筋肉の損傷や幼虫の表皮からの分離を避けるために、洗浄およびインキュベーション中にシェーカーの速度が15rpmを超えないようにすることが重要です。さらに、NMJの形態を鮮明かつ完全に撮影するためには、皮膚の伸展を正確に制御する必要があります。抗体の濃度、固定、ブロッキング、およびインキュベーション時間を最適化するために、予備実験を実施することをお勧めします。固定時間は約40分に制限されています。短すぎたり長すぎたりしても、微小管ネットワークの免疫染色は助長されません。
ニューロンの微小管は密集しており、従来の顕微鏡では鮮明に可視化することが困難です。ショウジョウバエの筋肉細胞は神経細胞に比べて著しく大きく、セグメントA3の...

微小管(MT)は、細胞骨格を構成する構成要素の1つとして、細胞分裂、細胞増殖と運動性、細胞内輸送、細胞形状の維持など、さまざまな生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。微小管の動態と機能は、MAP1、MAP2、タウ、カタニン、キネシンなどの他のタンパク質との相互作用によって調節されます1,2,3,4,5。
ニューロンでは、微小管は軸索と樹状突起の発達と維持に不可欠です。微小管の異常は、機能不全やニューロンの死さえも引き起こします。例えば、アルツハイマー病患者の脳では、タウタンパク質の過剰リン酸化により微小管ネットワークの安定性が低下し、神経学的不規則性が引き起こされます6。したがって、微小管ネットワークを調べることは、神経発達と神経疾患の病因の理解に貢献します。
神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロンの軸索末端と筋線維の間に形成される末梢シナプスであり、シナプスの構造と機能を研究するための優れた強力なモデルシステムです7。フッチはショウジョウバエのタンパク質で、哺乳類に見られる微小管結合タンパク質MAP1Bと相同である8。ニューロンにのみ発現し、NMJのシナプスボタンの発達に関与している8,9。野生型では、NMJ突起の中心に沿って走る糸状束を抗Futschで免疫染色することで可視化します。NMJの末端に達すると、この束は微小管からなるループを形成するか、またはその糸状構造を失い、びまん性および点状の外観をもたらす能力を有する10。微小管ループは一時停止した成長円錐と関連しており、微小管アレイが安定していることを示唆している11。そのため、フッチ染色によりNMJにおける微小管の安定な発生を間接的に決定することができます。ショウジョウバエの幼虫の筋肉細胞のサイズが大きいため、微小管ネットワークを明確に視覚化できます。微小管ネットワークの安定性に影響を与える要因は、微小管の密度と形状を分析することで見つけることができます。同時に、筋肉細胞の微小管ネットワークの状態をNMJの結果と交差検証して、より包括的な結論を得ることができます。
微小管のネットワークとダイナミクスを調べるために、多くのプロトコルが採用されています。しかし、これらの研究はしばしばin vitro研究に焦点を当てている12,13,14,15,16。或いは、いくつかのin vivo実験では、細胞骨格を検出するために電子顕微鏡法が用いられている17。蛍光標識抗体または化学色素のタンパク質またはDNAへの特異的結合によると、ここで紹介する方法により、NMJの微小管ネットワークをin vivoの個々のニューロンレベルで検出することができ、その結果は筋肉細胞での観察によって裏付けられています。このプロトコルは、ショウジョウバエのメラノガスターで利用可能な強力な遺伝ツールと組み合わせると、シンプルで安定しており、反復性があり、生体内の神経系における微小管ネットワーク調節タンパク質の役割について、多様な表現型検査および遺伝子スクリーニングを可能にします。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor Plus 405 phalloidin</td><td>invitrogen</td><td>A30104</td><td>dilute 1:200</td></tr><tr><td>Enhanced Antifade Mounting Medium</td><td>Beyotime</td><td>P0128M</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW 共焦点顕微鏡</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse anti-Body, Alexa Fluor 488 conjugated</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11001</td><td>dilute 1:1,000</td></tr><tr><td>Laser confocal microscope LSM 710</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>66vision</td><td>54138B</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗フッチ抗体</td><td>発達研究ハイブリドーマバンク&nbsp;&nbsp;</td><td>22C10</td><td>dilute 1:50</td></tr><tr><td>マウス抗アルファ抗体</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td>dilute 1:1,000</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>和光</td><td>168-20955</td><td>最終濃度:PBバッファー中4%</td></tr><tr><td>ステンレス製 微細ピン</td><td>Entomoravia</td><td></td><td>0.1mm</td></tr><tr><td>Diam Stereomicroscope SMZ161</td><td>Motic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stereoscopic fluorescence顕微鏡 BX41</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テキサス州 赤結合ヤギ 抗HRP</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td></td><td>希釈 1:100</td></tr><tr><td>TO-PRO(R) 3 ヨウ化物</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>希釈 1:1,000</td></tr><tr><td>転写脱色シェーカー TS-8</td><td>キリンベル実験器具</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>BioFroxx</td><td>1139</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット&nbsp;</td><td>デュモン</td><td>500342</td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

微小管ネットワークは、神経系の不可欠な構成要素です。多くの微小管調節タンパク質の変異は、神経発達障害や神経疾患に関連しており、微小管関連タンパク質タウから神経変性疾患、微小管切断タンパク質スパスチンおよびカタニン60は、それぞれ遺伝性痙性対麻痺および神経発達異常を引き起こします。神経細胞内の微小管ネットワークの検出は、神経疾患の病態解明に有利である。しかし、ニューロンのサイズが小さく、軸索微小管束が密集しているため、微小管ネットワークの可視化は困難です。本研究では、ショウジョウバエの微小管ネットワークを可視化するために、幼虫の神経筋接合部と筋細胞を解剖し、α-チューブリンと微小管関連タンパク質Futschの免疫染色を行う方法について述べる。神経筋接合部はシナプス前部とシナプス後部の両方の微小管を観察することを可能にし、ショウジョウバエ幼虫の筋肉細胞のサイズは微小管ネットワークの明瞭な可視化を可能にします。本研究では、ショウジョウバエのカタニン60を変異させて過剰発現させ、神経筋接合部や筋細胞の微小管ネットワークを調べることで、神経発達におけるカタニン60の制御的役割を正確に明らかにしました。従って、ショウジョウバエのmelanogasterの強力な遺伝用具と結合されて、このプロトコルは神経系のmicrotubuleネットワークの規定する蛋白質の役割のための遺伝のスクリーニングそしてmicrotubuleの原動力の分析を非常に促進する。

私たちは、神経筋接合部(NMJ)と筋肉細胞の両方の微小管ネットワークを可視化するための段階的な手順を示しました。模式図(図1A-E)に従って解剖した後、免疫染色を行い、その後、レーザー共焦点顕微鏡または実体蛍光顕微鏡で画像を観察して収集します(図1F、G)。
NMJのシナプス前部とシナプス後部の両方の微小管構成を抗αチューブリンで標識することができ、レーザー走査型共焦点顕微鏡の層厚を選択することにより、異なるスライスの微小管形態が表示されます(図2A-C)。Futschは、ニューロンの軸索における微小管の組織化を明らかにすることにより、神経追跡にも使用されています。抗HRPは、神経細胞膜10,23,24<sup c...

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ ジョウバエのmelanogasterの強力な遺伝用具と結合されて、このプロトコルは神経系のmicrotubuleネットワークの規定蛋白質の役割のための遺伝のスクリーニングそしてmicrotubule原動力の分析を非常に促進する。

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

現在、微小管の動態はEB1などの微小管結合タンパク質を介して間接的に観察されています。アルファベットチューブリンヘテロ二量体は細胞質内に豊富に存在するため、隣接するチューブリンヘテロ二量体は生体内の微小管ネットワークのダイナミクスを欠いています。私たちのプロトコルは、神経筋シナプスと筋肉細胞の微小管を視覚化します。ショウジョウバエのメラノガスターで利用可能な強力な遺伝学的ツールと組み合わせることで、in vivoの神経系における微小管ネットワーク調節タンパク質の役割に関する多様な表現型検査と遺伝子スクリーニングが可能になります。私たちの研究は、細胞骨格と神経発達の関係、および神経疾患への影響に焦点を当てています。私たちは、細胞骨格制御タンパク質が神経細胞に及ぼす影響に着目することで、神経疾患の神経発達と単為生殖のメカニズムを解明したいと考えています。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、分析する方法を示しています...

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

このプロトコルは、解剖さショウジョウバエの幼虫の免疫組織化学を実行する方法を示しています。...

ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学

ここでは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でシナプス伝達を測定するための電気生理学的方法を説明します。誘発放出は、運動ニューロンの軸索を刺激することによって人工的に開始され、NMJの透過は、筋肉に誘発シナプス後応答によって測定することができる。...

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

我々は、共焦点顕微鏡で蛍光染料を使用して、ライブハエの幼虫の小説インサイドアウトの組織調製物におけるグリア -...

ライブの視覚化ショウジョウバエ</em蛍光色素で>グリア - 神経筋接合部

このプロトコルは、無傷の麻酔とイメージングのための信頼性の高い方法を説明します...

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

このようなニューロンの樹状突起のような複雑な細胞の形状は、開発中に達成されるかを理解するために、それは正確にアッセイの微小管の組織にできることが重要です。ここでは、樹状突起分枝のニューロン感覚樹状突起の微小管の組織、気管、筋肉を調べるために堅牢な免疫標識法を説明し、他の...

免疫組織学的な感覚ニューロンの樹状突起における微小管の標識、気管、との筋肉ショウジョウバエ幼虫の体壁

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)は、シナプスの形態と機能を研究するためのモデルとして使用されます。このビデオでは、研究者がNMJを特徴付けるために定量化する重要な特徴について説明します。このプロトコル例は、定量を自動的に実行できるソフトウェアを示しています。...

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)の定量化:シナプスの形態と機能を評価する方法

ここで我々 は説明の幼虫が 3...

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

このレポートは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部を視覚化するための新しいサンプル調製手順を提供します。この方法は、従来の方法と比較してサンプルのカールを防ぐのにより効果的であり、 ショウジョウバエの...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

学ぶショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞における微小管ネットワークの可視化手法。共焦点顕微鏡と免疫染色を用いて微小管動態を解析し、神経系の細胞骨格制御タンパク質の役割を解明する。

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

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