Name: アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー研究のためのマウス後肢外植モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶマウス後肢外植モデルを用いたアキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー。多軸機械ひずみパターンを再現し、線維軟骨形成の分子メカニズムを解明する革新的な実験プラットフォームを探索する。

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著者らは、P30AR06965ロチェスター大学筋骨格研究センターの組織学、生化学、分子イメージング(HBMI)コアのJeff Fox氏とVidya Venkatramani氏による支援と支援に感謝しています。さらに、著者らは、多光子顕微鏡法の支援について、ロチェスター大学医療センターの光学顕微鏡およびナノスコピーセンター(CALMN)に感謝します。この研究は、R01 AR070765 と R01 AR070765-04S1、および 1R35GM147054 と 1R01AR082349 から資金提供を受けました。

腱インピンジメントの理解 – メカノバイオロジー研究のためのマウス外植片モデル

著者は何も開示していません。

この研究で説明した組織培養プロトコルと組み合わせた実験的なマウス後肢外植片プラットフォームは、アキレス腱挿入時のインピンジメント駆動線維軟骨形成のメカノバイオロジーを研究するための適切なモデルを提供します。この外植片モデルの有用性は、7日間の静的衝突後のトルイジン青色染色の有意かつ空間的に不均一な変化に伴う細胞生存率の維持を示す代表的な結果によって実証されています。これらの発見は、他のモデルおよび臨床研究と一致する、機械的衝突に続発するGAGに富むマトリックス分子の代謝の変化を示唆しています3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ...

アキレス腱や回旋筋腱板腱を含む多くの腱は、正常な解剖学的位置により骨のインピンジメントを経験します1,2,3,4.腱の衝突は、縦方向の繊維軸に横方向に向けられた圧縮ひずみを生成します5,6,7.腱インピンジメントの領域は、グリコサミノグリカン(GAG)含量が著しく増加した無秩序なコラーゲンネットワーク内に、縮小した丸い細胞(線維軟骨細胞)が埋め込まれている独特の線維軟骨表現型を示します2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24.これまでの研究では、腱のインピンジメントによって生じる異種の機械的環境が、凝集したプロテオグリカン(特にアグリカン)の沈着を促進し、このGAGに富むマトリックスを維持していることが示唆されているが、その根底にあるメカニズムは不明である1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.線維軟骨は健康な腱の侵食領域では正常な特徴ですが、過剰な線維軟骨形成に関連する異常なプロテオグリカン代謝は、慢性的に侵迫した腱に不釣り合いに出現する一般的で衰弱性疾患である腱鞘炎の特徴です1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49.したがって、腱インピンジメントは、回旋筋腱板疾患や挿入性アキレス腱炎(IAT)など、最も一般的な腱鞘炎のいくつかを引き起こす重要な外因性要因として臨床的に認識されています50,51,52.現在、腱鞘炎の治療は非効率的です。例えば、IAT患者の約47%は、保存的管理に失敗した後に外科的介入を必要とし、術後の転帰はさまざまである53,54,55,56.インピンジメントと腱鞘炎の間には明らかな関係があるにもかかわらず、インピンジメントされた腱の細胞が機械的環境を感知して応答するメカノバイオロジカルメカニズムは十分に説明されておらず、腱鞘炎の病因の理解が曖昧になり、不十分な治療につながります。
外植モデルは、腱メカノバイオロジーの研究において有用なツールである57,58.腱インピンジメントのメカノバイオロジーを理解するための最初のステップとして、いくつかの先行研究は、細胞または腱外植片を切除した単純な一軸圧迫を適用した後の細胞応答を調査しています27,29,30,31,32,33,34,39。しかし、in vitroの細胞は、菌株伝達を促進し、機械的変形によって放出される重要な成長因子とサイトカインを隔離し、メカノトランスダクションに関与する焦点接着複合体の基質を提供する細胞外および細胞周囲マトリックスを欠いています57,59。さらに、in vitroおよび切除された外植片研究は、in vivoでの腱の衝突によって生成される多軸機械的ひずみ環境を再現することができず、これは衝突領域の解剖学的特徴に依存します5,6。インピンドされたアキレス腱挿入の文脈では、これには、踵骨後滑液包およびケーガー脂肪パッド60,61,62,63などの周囲組織が含まれる。逆に、腱インピンジメントのin vivoモデル25,28,36,37,38,64,65,66は、腱に直接加えられる荷重の大きさと周波数を最小限に制御することを可能にし、これは腱メカノバイオロジーを研究するためのin vivoモデルのよく知られた限界である57,58、67,68,69,70。in vivoでの腱のひずみ測定が困難なため、これらのモデル内で発生する内部ひずみ環境は、多くの場合、十分に特徴付けられていません。
この原稿では、マウス後肢外植片全体の踵骨へのアキレス腱挿入のインピンジメントを再現するカスタム実験プラットフォームを提示し、この組織培養プロトコルと組み合わせると、外植片培養で7日間にわたって生存率を維持し、腱インピンジメントの生物学的後遺症の研究を可能にします。このプラットフォームは、3Dプリントされたポリ乳酸(PLA)ベースに基づいて構築されており、グリップと3DプリントされたPLAボリュームリダクションインサートの取り付けの基礎を提供します。グリップは、後肢の尾側を上に向けて、上肢と膝をアキレス筋腱接合部に近位に固定するために使用され、超音波プローブまたは倒立顕微鏡を使用してアキレス腱を上から画像化できます(図1A)。減容インサートは、ベースのトラックに沿ってスライドし、組織培養培地の必要量を減らします。後ろ足に巻き付けられた編み込みラインは、ベースデザインと3DプリントされたPLAクリップを利用してプラットフォームからルーティングされます。紐を引っ張ることで、後足が背屈し、アキレス腱の挿入が踵骨に押し付けられ、横方向の圧縮歪みが上昇します5,6(図1A)。プラットフォームは、組織培養培地に浸された後肢の外植片を維持するアクリル浴内に含まれています。ピンと張った紐を粘着テープで浴槽の外側に固定すると、足首の背屈が維持され、アキレス腱挿入の静的インピンジメントが発生します。3DプリントされたコンポーネントのCADファイルは、複数のフォーマット(補足ファイル1)で提供されており、実験のニーズに合わせて変更するために、さまざまな商用および無料のオープンソースCADソフトウェアにインポートできます。製造に3Dプリンターを利用できない場合は、CADファイルをオンライン3Dプリントサービスに提供して、低コストで部品をプリントして出荷することができます。
重要なことに、上腕三頭筋-アキレス腱複合体は、膝関節と足首関節の両方にまたがっています71,72,73。その結果、アキレス腱の引張ひずみは膝の屈曲の影響を受けます。膝の伸展はアキレス腱に緊張をかけますが、膝の屈曲は緊張を軽減します。最初に膝を伸ばし、次に足首を受動的に背屈させることで、衝突した挿入時の圧縮ひずみを引張ひずみに重ね合わせることができます。逆に、膝を屈曲させた状態で足首を受動的に背屈させることで、引張ひずみが軽減され、圧縮ひずみが残ります。現在のプロトコルでは、そのような 3 つの条件が検討されています。1)静的インピンジメントの場合、足を脛骨に対して110°<に背屈させて挿入をインピンディングし、膝を曲げて緊張を軽減します。2)ベースラインテンショングループでは、膝を伸ばした状態で足首を背屈145°以上に伸ばし、挿入時に主に引張緊張を発生させます。3)無負荷群の場合、外植片は、外部から負荷がかからない状態で、膝と足首を中立位置にしてペトリ皿で培養します。上記の角度は、足と脛骨が180°の角度で平行で、90°の角度で垂直である座標系に対して写真で測定されます。
プロトコルの主なステップには、1)後肢の外植片の解剖と皮膚と足底腱の慎重な除去が含まれます。2)48時間のデキサメタゾン前処理後の外植片培養。3)組織切片および組織学的染色;4)線維軟骨形成を評価するためのカラー画像解析。解剖後、各後肢外植片をデキサメタゾン74を添加した培地中で48時間前処理する。各マウスの対側肢は、ペアワイズ比較のために別々の実験グループに割り当てられ、生物学的変動を制御するのに役立ちます。前処理後、外植片を上記のようにプラットフォームに配置し、さらに7日間培養します(図1B)。48時間の前処理の直後に外植片を除去する前処理(0日目)グループへの追加の比較が行われます。
外植片培養後、後肢を切り落とし、ホルマリンを固定し、脱灰し、パラフィンに包埋します。矢状方向の連続切片は、筋腱接合部から踵骨挿入までのアキレス腱を視覚化し、腱全体を切片の深さを追跡することができます。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を介したdUTP X-nickラベリング(TUNEL)は、アポトーシスに続発するDNA損傷を可視化し、生存率を評価するために使用されます。トルイジンブルーの組織学とカスタムカラー画像解析を行い、GAG染色の変化を定量化します。次に、トルイジンブルーで染色した組織切片をSHGイメージングに使用し、コラージュ線維組織の変化を特徴付けます(図1B)。
提供された代表的な結果は、GAGリッチマトリックスの組織学的染色の変化と、モデル内の7日間の静的衝突によって生成された細胞外コラーゲンネットワークの混乱を示唆しています。このモデルは、インピンジメントによる線維軟骨性変化の根底にある分子メカニズムを探るために利用することができます。

<table><tbody><tr><td>吸収性アンダーパッド</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td>ベンチトップ解剖</td></tr><tr><td>用 アクリルバス</td><td>ソース 1</td><td>X001G46CB1</td><td>培養培地に沈められた外植片プラットフォームを含む</td></tr><tr><td>オートクレーブビン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>13-361-20</td><td>二次封じ込めとして使用され、2つのプラットフォームを保持します</td></tr><tr><td>ベース</td><td>-</td><td>-</td><td>補足ファイルとして提供されるCADファイルから3D印刷</td></tr><tr><td>編組ライン</td><td>KastKing</td><td>30lbテスト</td><td>足を包み込み、足首の背屈を適用するために使用されます</td></tr><tr><td>クリップ</td><td>-</td><td>-</td><td>補足ファイルとして提供されるCADファイルから3D印刷</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-541-034</td><td>長方形、No.2、50 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>サイトシール XYL</td><td>VWR</td><td>8312-4</td><td>トルイジンブルー染色組織をカバースリップするためのキシレンベースの封入剤セクション</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>MP バイオメディカル LLC</td><td>194561</td><td>CAS#50-02-2</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)、ThermoFisher</td><td>D12345</td><td>CAS#67-68-5 による無水 Invitrogen は、デキサメタゾンを濃縮ストック溶液に可溶化するために使用</td><td></td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>スコッチ ブランド</td><td>34-8724-5195-9</td><td>グリッププラテンにサンドペーパーを取り付けるには</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム (1XDMEM)</td><td>Gibco by ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>高グルコース、(-)ピルビン酸、(+)グルタミン</td></tr><tr><td>EDTA四ナトリウム塩二水和物</td><td>Thermo Scientific ChemicalsJ15700</td><td>。A1</td><td>CAS#10378-23-1、サンプル脱石灰のための14%EDTA溶液を作るのに使用</td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ</td><td>Thermo Scientific</td><td>T038181000</td><td>CAS#64-17-5、1 L供給</td></tr><tr><td>泡生検パッド</td><td>ライカ</td><td>3801000</td><td>処理カセットと一緒に使用され、固定および脱灰中に足首関節を所望の位置に保持するのに役立ちます</td></tr><tr><td>鉗子、#SS 標準 Inox</td><td>Dumont</td><td>11203-23</td><td>ストレート、滑らか、細かいヒント</td></tr><tr><td>鉗子、マイクロアドソン 4.75インチ</td> <td>フィッシャーブランド</td><td>13-820-073</td><td>まっすぐで細い先端 鋸歯状の歯</td></tr><tr><td>ガーネット サンドペーパー、50-D グリット</td><td>ノートン</td><td>M600060 01518</td><td>または他の粗いグリット サンドペーパー</td></tr><tr><td>氷河酢酸</td> フィ<td>ッシャー ケミカル</td><td>A38S-500</td><td>CAS#64-19-7、トルイジン ブルー組織学に使用される酢酸ナトリウム緩衝液の pH を調整するため、および 14% EDTA 脱灰溶液</td></tr><tr><td>グリップ</td><td>ADMET</td><td>GV-100NT-A4</td><td>プロトコルに記載されているステンレス製バイスグリップ、ネジ、スプリングが含まれています</td></tr><tr><td>Histobond 接着顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>16005-108</td><td>後肢の矢状切片は、すべての染色プロトコルを通じてこれらのスライドに確実に接着</td></tr>します <tr><td>その場細胞死検出キット、TMR レッド</td><td>ロシュ</td><td>12156792910</td><td>TUNELアッセイ</td></tr><tr><td>ラベリングテープ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>15-959</td><td>または好みの</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A4544-100G</td><td>CAS#50-81-7、培養培地製剤用</td></tr>中<tr><td>性緩衝ホルマリン、10%</td><td>ライカ</td><td>3800600</td><td>サンプル固定用、5ガロン供給</td></tr><tr><td>ヌンクシャーレ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P7741-1CS</td><td>直径100mm×高さ25mm、プロトコルに記載されているように、70mLの培養培地に浸漬した外植片を維持します</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(100X)</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>5mLから500mL 1X DMEMを1% v/v (1X)作業濃度</td></tr><tr><td>ポリ乳酸(PLA) 1.75mmフィラメント</td>ハッチ<td>ボックス</td><td>-</td><td>3Dプリンター押出機と互換性のあるフィラメント径を選択、 お好みの色で。</td></tr><tr><td>プロセッシングカセット</td><td>ライカ</td><td>3802631</td><td>固定、脱灰、パラフィン包埋用</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>P36931</td> TUNEL Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6 の後に<td>組織切片を覆うための封入剤</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> TUNELプロトコルのはさみで<td>抗原賦活化に使用</td></tr><tr><td>Fine</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td>ストレート、シャープ</td></tr><tr><td>スライド染色セット、12 位</td>メルセデス <td>サイエンティフィック&nbsp;</td>トル<td>イジンブルー組織学用12枚のステインディッシュとスライドディッパー付き</td><td>MER 1011</td>ラック</tr> 酢<tr><td>酸ナトリウム、無水</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>A1318430</td><td>CAS#127-09-3、トルイジンブルー組織学の緩衝液を作るために使用</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Accu-Edge ロープロファイル ミクロトームブレード</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td>パラフィン切片化用</td></tr><tr><td>トルイジンブルーO</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>348601000</td><td>CASの#92-31-9</td></tr><tr><td>体積削減インサート</td> <td>-</td><td></td> <td>補足ファイルとして提供されるCADファイルから3Dプリント</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td>組織学的染色のための4ガロンの供給</td></tr></tbody></table>

アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー研究のためのマウス後肢外植モデル

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

骨への腱の衝突は、横方向の圧縮ひずみが著しく上昇した多軸の機械的ひずみ環境を生成し、グリコサミノグリカン(GAG)に富むマトリックスの蓄積とコラーゲンネットワークのリモデリングを特徴とする局所的な線維軟骨表現型を誘発します。線維軟骨は健康な腱の侵食領域では正常な特徴ですが、過剰なGAG沈着とコラーゲンネットワークの混乱は腱鞘炎の特徴です。したがって、インピンジメントは、腱鞘炎の開始と進行における重要な外因性因子として臨床的に認識されています。それにもかかわらず、腱インピンジメントの根底にあるメカノバイオロジーは研究が不十分なままです。腱インピンジメントに対する細胞応答を解明するための以前の取り組みは、細胞に一軸圧迫を適用し、in vitroで腱外植片を切除しました。しかし、単離された細胞は、機械応答に重要な3次元の細胞外環境を欠いており、 in vitro および切除外植片研究の両方で、in vivoでの腱の衝突によって生成される多軸ひずみ環境を再現することができず、これは衝突領域の解剖学的特徴に依存します。さらに、腱インピンジメントの in vivo モデルでは、機械的ひずみ環境を制御できません。これらの限界を克服するために、アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジーを研究するのに適した新しいマウス後肢外植片モデルを提示します。このモデルは、アキレス腱を その場で 維持して局所的な解剖学的構造を維持し、受動的に加えられた足首背屈時にアキレス腱が踵骨に挿入されることによって発生する多軸ひずみ環境を再現し、細胞を本来の環境に保持します。このモデルに不可欠な組織培養プロトコルについて説明し、7日間にわたる持続的な外植片の生存率を確立するデータを提示します。代表的な結果は、組織学的GAG染色の亢進とインピンジメントに続発するコラーゲン線維のアライメントの低下を示しており、線維軟骨形成の上昇を示唆しています。このモデルは、さまざまな機械的負荷レジメンの調査に容易に適応でき、インピンジメントに応答してアキレス腱の表現型変化を媒介するメカニズムを特定するために、目的の分子経路を操作することができます。

TUNELで染色した組織切片の代表的な画像は、実験グループ全体で7日間の外植片培養後のアキレス腱の体内のアポトーシス核が最小であることを示しています(図2A)。これらの画像の定量化により、組織培養プロトコルは、ロード条件全体で 7 日間の外植片培養後、アキレス腱内で平均最大 78% の生存率を維持するという証拠が得られます(図 2B)。
定性的には、強化されたトルイジンブルー染色は、無負荷のコントロールと比較して7日間の静的衝突後に高く評価され(図3A、B)、特に踵骨に隣接する深い象限で、以前に最大横圧縮ひずみを測定しました5,6。これらのトルイジンブルー染色組織切片の定量化は、対側の非負荷外植片と比較して、静的インピンジメントの7日後の色相(<stron...

マウス後肢外植片におけるアキレス腱挿入のインピンジメントによって引き起こされる線維軟骨性変化を再現するカスタム実験プラットフォームと組織培養プロトコルを提示し、腱インピンジメントのメカノバイオロジーを探索するのに適したモデルを提供します。

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

私たちは、腱インピンジメントの根底にあるメカノバイオロジーと、このユニークな機械的要求が健康と疾患における局所的な繊維軟骨形成を促進するプロセスを研究しています。本研究では、衝突によって生じる多軸力学的ひずみの空間的に不均質なパターンに対するモデリングのためのマトリックスの特性評価と、この応答を媒介する分子機構の同定を目指します。インピンジメントメカノバイオロジーを研究するための In vitro モデルでは、単離された腱細胞に単純な圧縮を適用したり、部分的および全体の腱外植片に人工的な一軸圧縮を適用したりしています。腱インピンジメントの動物モデルを確立し、in vivoでの腱インピンジメントの外部発生源を外科的に操作し、身体活動を再開した後の生物学を探求しました。単離された細胞は、メカノ応答に不可欠な3次元の細胞外環境を欠いているため、in vitroモデルには大きな制限があります。切除された外植片モデルはこの制限を回避しますが、どちらもin vivoでの衝突によって生成された多軸ひずみパターンを再現できません。逆に、動物モデルでは、内部組織の緊張を測定または制御する能力が限られています。インピンジメントメカノバイオロジーを研究するためのマウス後肢外植片モデルは、細胞を細胞外環境内に維持し、インピンジメントされたアキレス腱挿入の局所解剖学的構造をその場で保存し、受動的に加えられた関節運動によるインピンジメントの制御された処方を可能にし、測定可能で十分に特徴付けられた組織ひずみの多軸パターンを再現します。

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