Name: モルモットの丸窓膜移植による Ex Vivo 研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: 学ぶモルモットの丸窓膜摘出法によるex vivo内耳薬物輸送研究。この精密な外科的手法は、構造を保持した膜の分離を可能にし、難聴治療のための標的薬物送達戦略の開発に貢献します。

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この研究の一部は、NIDCD Grants No. 1K08DC020780 および 5T32DC000027-33、およびルーベンシュタイン聴覚研究基金の支援を受けました。

すべての動物処置は、動物実験委員会(GP18M226)によって承認されました。Hartleyアルビノモルモット(雄と雌の両方、体重500〜700g)を本研究で使用しました。
1. 手順の設定と準備
<ol><li>実験を開始する前に、すべての機器をエチレンオキシドで滅菌してください。</li>
	<li>施設で承認されたプロトコルに従って動物を安楽死させます。 注:現在の研究では、市販のシリンダーから100%二酸化炭素(CO2)を放出するために、プリチャージされていないチャンバーが採用されました。インラインリストリクターを使用してガス流量を調整し、2020年のAVMAガイドライン11に従って、毎分チャンバーの容積の30%から70%の範囲内に維持しました。</li>
	<li>動物をチャンバーに入れ、二酸化炭素を5分間分注し、CO2 の流れは呼吸停止後1分間維持されます。</li>
	<li>安楽死を確実にするために、呼吸停止後に斬首を行います。</li>
</ol>2.外科的アプローチと摘出
<ol><li>通常の方法でモルモットの頭蓋骨から側頭骨を抽出します12.ロンゲールで余分な軟部組織を取り除きます。外耳口腔、側頭水疱、および顔面管13 を特定します(図1)。</li>
	<li>側頭水疱の腹側側面を6mmのダイヤモンドビット( 材料表を参照)でドリルで穴を開け、中耳腔と外耳道を円周方向に露出させます。</li>
	<li>ロンゲールを使用して、外耳道と鼓膜輪を静かに除去し、同時に関節を分離します。顎関節、顎関節、蝸牛、水平三半規管、および顔面管13 を特定する(図2A)。</li>
	<li>インキュドステープ関節を分離し、鉗子を使用してインカスを除去します。丸い窓の骨のくぼみを特定します。</li>
	<li>6mmのダイヤモンドビットを使用して、蝸牛と鼓膜腔の内側壁を鼓膜管に向かって接続している骨の椎弓をドリルで穴あけします。鼓膜張筋の骨チャネルを慎重に減圧し、28Gの針を使用して鼓膜張筋を取り除きます。 注:鼓膜窩テンソルの内側壁は、RWMの周りの蝸牛骨と直接接続しており、丸い窓まで伸びる可能性のある骨折を引き起こさないように注意が払われています。</li>
	<li>蝸牛と鼓膜腔の下壁をつなぐ骨椎弓を、蝸牛に接する骨の出っ張りが1mmになるまでドリルで取り除きます(図2B)。</li>
	<li>2mmのダイヤモンドビット( 材料表を参照)を使用して、蝸牛の基底ターンで蝸牛造設を行い、丸い窓に約2mmの骨を残します。蝸牛の基部を蝸牛の頂点から分離するために、丸い窓の膜に平行な平面で下向きに蝸牛造設術を続けます。</li>
	<li>蝸牛瘻造設術の切開部を頭蓋底に伸ばすと、頭蓋底部がはるかに密度が高くなり、蝸牛の基底ターンの断面図が得られます。 注:ドリルを内耳道の口腔に向けると、丸い窓に近づきすぎないようにしながら、骨の除去を最大化する軌道が得られます。</li>
	<li>標本を頭蓋底側から検査し、まだ行っていない場合は、内耳道を特定し、蝸牛の開口部にドリルで穴を開けます。28Gの針で蝸牛神経を取り除きます。</li>
	<li>蝸牛側から標本を調べます。基底回転の骨性らせん状椎弓と残りのモディオラスを特定して、鉗子または28Gの針で除去します。</li>
	<li>結合したスカラ鼓膜-スカラ前庭腔をたっぷりと灌漑して、破片を取り除きます。丸い窓は、重なる破片がなく、結腸切除術からはっきりと見えるはずです(図2C)。</li>
	<li>次に、標本を中耳側から調べます。外側三半規管と顔面管を楕円形の窓の高さまでドリルで開けます。鉗子を使用して茎をそっと取り外し、楕円形の窓のニッチを露出させます。注目すべきは、クリスタ・スタペディスとして知られる茎のクルラの間に骨の橋があることです。</li>
	<li>1mmのダイヤモンドドリル( 材料表を参照)を使用して、丸い窓のニッチに隣接する1〜2mmの蝸牛骨を維持するように注意しながら、丸い窓の面に沿って楕円形の窓を伸ばして前庭をさらに開きます(図2D)。</li>
	<li>円形の窓の切り口と丸い窓の両側の蝸牛切除術の切り口をつないで、側頭骨の切り込みを完了します。 注:蝸牛の骨は脆弱なため、標本内の鼓膜窩テンソルを保存し、それを切り裂かないようにすることで、RWMにまで伸びて完全性を損なう蝸牛骨折を防ぐことができます。</li>
	<li>内耳道に隣接する頭蓋底の密集した骨に最終的な付着物を作り、静かに削って切除されたRWM標本にします(図3A)。</li>
</ol>

モルモット丸窓膜の説明

<ol><li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery%3A+our+own+findings+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Otol%22%5BJournal%5D)">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li>
<li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear%3A+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li>
<li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+delivery%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope+Investig+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li>
<li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li>
<li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li>
<li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li>
<li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105(2022).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li>
<li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticles%3A+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li>
<li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2020+Edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li>
<li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li>
<li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li>
<li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037(2022).</li>
<li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li>
<li>Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li>
<li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789(2023).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032(2021).</li>
<li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061(2021).</li>
</ol>

著者らは開示すべきものはありません。

耳への局所薬物送達では、RWMは治療薬が内耳に到達するための主要な通過経路です。正確で信頼性の高いベンチトップモデルは、新しい送達手段の輸送メカニズムと透過性をよりよく理解し、医薬品開発のために必要です。この研究では、モルモットのRWM移植が実行可能で信頼できる手順であり、薬物と膜の相互作用の体系的な調査を可能にすることを実証します。LundmanらとKelsoらは、以前に同様のRWM透過性モデルを利用することを説明しました2,16;しかし、外科的摘出の具体的なステップはこれまで詳細に説明されておらず、蝸牛の骨の脆弱性と複雑な解剖学的構造は、無傷のRWMを一貫して一括して採取するという課題を提起してきました。
モルモットRWMは、蝸牛のスカラティンパニの末端に位置し、蝸牛骨の薄い層に囲まれています。移植プロセス中にこの骨構造が骨折すると、周囲の蝸牛骨が無傷で残っていないとRWMが引き裂かれる傾向があるため、標本が使用できなくなる可能性があります。私たちのグループは、骨密度の推移により、丸い窓から骨折が伝播する可能性が高まるため、高密度の頭蓋骨基底骨と脆い蝸牛の接合部付近で掘削すると、骨折が最も頻繁に発生することに注意しました。このため、RWに近接して蝸牛に付着している鼓膜窩テンソルの密度の高い骨を維持することで、特に高齢の動物で標本採取の収量が増加することが示唆されています。骨の破壊は、蝸牛の内容物の除去中にも発生する可能性があります。周囲の蝸牛骨の操作を最小限に抑えて、骨性らせん状椎弓層を静かに除去するように注意する必要があります。
このモデルで考慮すべき重要な詳細は、移植後のRWMの実行可能性です。以前のグループは、哺乳類のRWMが抽出後24〜48時間生存可能であることを示唆しています17。本研究は、これらの知見を反映しています。一貫した輸送研究と無傷の細胞構造を示す組織学的分析(図2A)は、実験時のモルモットRWMの生存率を裏付けています。抽出された標本の全体的な健康を維持するために、RWMは抽出され、安楽死の3時間以内に埋め込まれます。
in vivoにおけるRWM全体の薬物動態の研究において、外リンパの分布と濃度の測定を行うことは、依然としてかなりの技術的困難を抱えています1。鼓室内送達方法と適用量の変更により、さまざまな治療結果が得られています。これらの困難は、迷路内の複雑な流体力学と、耳管を通る注入された物質の不規則な排出によって悪化します。記載された移植方法は、RWMおよび ex vivo モデルとしてのその透過性に影響を与える要因の単離研究を可能にする。さらに、外植片は、超音波マイクロバブル18 や化学的に誘導された接合部変調19など、RWM透過性を増大させるために現在採用されている様々な方法の直接的な調査および可視化も可能にする。薬物送達に関与する特定のエンドサイトーシスメカニズムに関する今後の研究も、このベンチトップモデルの恩恵を受けるでしょう。

感音難聴の治療のために、新しいクラスの治療法が登場しました。これらの治療薬の臨床集団への翻訳は、内耳への安全で効果的な輸送経路によって制限されています。動物実験における in vivo 送達の現在の方法は、内耳への開窓または中耳腔と蝸牛を隔てる非骨性バリアである丸窓膜(RWM)を介した拡散のいずれかに依存しています1。
外科的開窓と内耳へのマイクロインジェクションはどちらも侵襲的であり、残存する内耳機能にリスクをもたらす可能性があります2。したがって、RWMは局所薬物送達の重要な経路であり、モルモットは、医薬品開発のためにRWM全体および内耳で局所薬物動態を研究するために使用される主要な前臨床動物モデルです3,4。モルモットのRWMは、ヒトのRWMよりも薄いが、同じ3層構造を共有している。直径約1mm、厚さ15〜25μmで、結合組織層5を挟む2つの上皮細胞層からなる。中耳に面した上皮層は密集し、タイトジャンクションを介して接続されていますが、内耳とスカラティンパニに面した層は構造が緩く、細胞間接着が顕著ではありません。
モルモットRWMの薬物透過性を調査する現在の前臨床試験は、in vivoの中耳注射とそれに続く内耳内の外リンパ液のサンプリングに依存しており、RWM輸送の特定の研究は不可能です6,7。RWM外植片の断片は前臨床試験で使用されてきましたが、壊れやすくサイズが小さいため、RWM2全体に水密シールを必要とする薬物および車両輸送の体系的なマイクロ流体研究には適していません。他のグループは、RWM 8,9,10を近似するために、培養したヒト上皮細胞を用いたin vitroモデルを採用しました。しかし、これらのコンストラクトの大部分は、外側の上皮層にのみ焦点を当てており、天然組織構造の複雑さを捉えていません。RWM全体の輸送メカニズムをより詳細に理解するには、ターゲットを絞ったex vivo研究が必要です。
この研究では、モルモットRWMの移植と周囲の骨サポートを実証し、膜の完全性を維持し、薬物送達車両のRWM輸送の特定の研究のために設計された実験パラダイムでの使用を説明します。

<table><tbody><tr><td>1 mm ダイヤモンドボールドリルビット</td><td>Anspach</td><td>1SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>2 mm ダイヤモンドボールドリルビット</td><td>Anspach</td><td>2SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>6 mm ダイヤモンドボールドリルビット</td><td>Anspach</td><td>6D-G1</td><td></td></tr><tr><td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td><td>Anspach</td><td>EMAX2PLUS</td><td>どんな骨切断ドリルシステムでも機能します</td></tr><tr><td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. 取り外し可能な 1 mL BD Luer-Lok シリンジ</td><td>付きベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー&nbsp;</td><td>382903057894</td><td>27-28 G ニードル</td></tr><tr><td>ゴリラ エポキシ</td><td>ゴリラ</td><td>4200101</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-CAST</td><td>ワールド精密機器</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr></tbody></table>

モルモットの丸窓膜移植による ex vivo 研究

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

内耳への効率的で低侵襲な薬物送達は大きな課題です。丸窓膜(RWM)は、内耳への数少ない入り口の1つであり、研究の重要な焦点となっています。しかし、RWMの単離は複雑なため、その薬物動態に関する理解は依然として限られています。RWMは、外側の上皮、中間結合組織層、内側上皮層の3つの異なる層で構成されており、それぞれが独自の送達特性を持っている可能性があります。
RWM全体の輸送を調査するための現在のモデルでは、in vivo動物モデルまたは細胞培養または膜断片に依存するex vivo RWMモデルが利用されています。モルモットは、内耳内の薬物動態を調査するための検証済みの前臨床モデルとして機能し、蝸牛への送達担体のトランスレーショナル開発のための重要な動物モデルです。本研究では、モルモットRWMを周囲の蝸牛骨とともに移植し、卓上での薬物送達実験を行うアプローチについて述べる。この方法では、ネイティブのRWMアーキテクチャを維持でき、現在のベンチトップモデルよりも輸送の障壁をより現実的に表現できる可能性があります。

図3Aに示されるように、この方法は、無傷のモルモットの丸い窓膜を、周囲の硬い骨のリングで移植することを可能にする。RWMは、円周方向に骨輪に完全に接続されている必要があります。蝸牛の骨折は認められません。ヒトの丸い窓の標本と比較して、モルモットのRWMは偽膜を覆っていません。さらに、人間とは異なり、モルモットの茎のクルーラの間には骨の橋があり、茎の上部構造を抽出する前に破砕と除去が必要です。代表的なRWMの組織学的分析(図3B)は、隣接する無傷の丸い窓のニッチを持つ明確な3層の上皮構造を示しています。
技術の観点からは、2つの重要なステップがあります。まず、ステップ2.7で結腸切除術を行う場合、バリの先端のジッターが蝸牛の外傷性骨折を引き起こし、丸い窓の膜にまで及ぶ可能性があるため、先端ではなくドリルビットの赤道を使用して切断することが重要です。第二に、内耳道を完全に掘り出すことは、蝸牛神経の完全な除去と骨螺旋状椎弓の解剖を容易にするため、実験的サンプリングのために蝸牛側の統一された空洞を形成することが重要です (図2C)。
RWMの抽出に成功した後、私たちのグループは、膜の薬物動態特性を評価するために修正されたUssingチャンバーを利用しました。修正されたUssingチャンバーは、上皮膜の輸送特性を評価するために、鼓膜膜、丸窓膜、および網膜組織の他のグループによって検証されています14,15。この3Dプリントデバイスは、Poly-Jet Veroを使用して構築され、それぞれに400μLの流体チャンバーを備えた2つの三角形のベースピースで構成されています(図3)。RWMの骨の縁は、2液性エポキシ(Gorilla、材料表を参照)を使用してベースに貼り付けられ、続いてシリコンシーラント(材料表を参照)を使用して水密シールを確保します(図4)。エポキシやシーラントがメンブレンに接触しないように細心の注意を払っています。RWMを挟んだ状態で、2つのベースをエポキシで接着します。輸送実験では、ローディング(中耳面)は送達体(または目的の分子)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされ、サンプリングチャンバー(スカラ鼓膜面)はPBSのみで満たされます。一定の時間間隔で、サンプリングチャンバーからの液体は完全に吸引され、新しいPBSに置き換えられます。
各実験では、装置内の試料の周囲に水密シールと、微細穿孔のない完全に無傷の膜の両方を確保するために、品質管理対策が講じられます。褐色の鉄芯ナノ粒子溶液を用いた代表的な結果を以下に示します。水密シールの定量的検証は、各サンプリング間隔中にサンプリングチャンバーの全容積を吸引することによって行われます。サンプリングチャンバーから液体が漏れると、吸引量が満杯に満たなくなります。各実験の終了時に、ローディングチャンバー内の流体量も同じままである必要があります。また、対象液は茶色なので、万が一漏れても容易に見えます。
メンブレン内で漏れがないようにするために、いくつかのアプローチが取られました。まず、この研究で使用したRWM標本はすべてすぐに抽出され、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、および電子顕微鏡画像により、マイクロパーシン目のない無傷の細胞および膜構造が確認されます(図3A、B)。第二に、ナノ粒子の送達に対する効果を比較するために、RWM標本のサブセットにマイクロパーフォレーションを意図的に作成しました。サンプリングおよびローディングチャンバーの吸引液の目視検査は、試験片の完全性と水密の取り付けをさらに確認するのに役立ちます。ミシン目のあるRWMでは、ローディングチャンバーとサンプリングチャンバーの平衡化が急速に行われ、明確な色の変化によって観察できます(補足図1)。さらに、微小穿孔RWMの輸送は、インタクトメンブレンで観察された最大分散よりも高いことがわかりました(補足図2)。これらが組み合わさって、試験片を囲む水密シールとRWMの完全性のための品質管理メカニズムとして機能します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig01.jpg"> 図1:モルモット側頭骨の術前画像。 鼓膜水疱、外耳道、顔面管(※)は、モルモット側頭骨の術前画像です。スケールバー = 1 cm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig02.jpg"> 図2:術中画像。 円形の窓膜とインカス(*)、蝸牛(**)、茎(†)、および減圧された内耳道(‡)との関係を示す術中画像。影付きの領域は、除去される試験片の部分を示します。(A)鼓膜と顔面神経を除去した後のモルモット中耳腔(ステップ2.3)。(B)鼓膜張管の減圧後の中耳腔(ステップ2.6)。(C)蝸牛瘻造設術および内耳内容物の除去後のRWMの基礎図(ステップ2.11)。(D)茎の除去と前庭の識別後のRWMのビュー(ステップ2.13)。スケールバー= A、B (1 cm); C、D (5 mm)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig03.jpg"> 図3:最終的なRWM標本と組織学。 (A)モルモットの骨輪を持つ肉眼標本。スケールバー = 1 cm。 (B)外植されたモルモットの丸い窓膜の組織学は、無傷の3層構造を示しています。スケールバー = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig04.jpg"> 図4:膜貫通輸送実験用マイクロ流体デバイス。 (A)膜貫通輸送実験に用いるマイクロ流体デバイスの図。(B、C)実験用の印刷されたマイクロ流体デバイス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:5時間の鉄芯ナノ粒子送達実験におけるチャンバー内容物の装填とサンプリング。 (A)インタクトRWMのローディングチャンバーは、ナノ粒子の濃度が低下するにつれて、色の強度が徐々に低下します。(B)インタクトRWMのサンプリングチャンバーは、低レベルのナノ粒子送達と一致して、経時的に安定した着色を示します。(C)穴あきRWMのローディングチャンバーは、内容物がサンプリングチャンバーと平衡化するにつれて、色の濃さが急速に低下します。(D)穴あきRWMのサンプリングチャンバーは、時間の経過とともに色が徐々に増加し、高レベルのナノ粒子送達と一致しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:ナノ粒子の送達における代表的な輸送結果。 モルモットRWMを無傷および穿孔のあるナノ粒子(ポリエチレングリコールコーティングを施したFe3O4 コア、平均半径77 nm)を送達した場合の代表的な輸送結果(平均± SD、n ≥ 3 RWM実験)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルはモルモットの一時的な骨からの円形の窓の膜のexplantationのための方法を輪郭を描いて、 ex vivo の調査に貴重な資源を提供する。

モルモットの丸窓膜移植による Ex Vivo 研究

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

当グループでは、難聴などの内耳疾患の治療のための薬剤や薬物送達担体の研究を行っています。丸い窓の膜は、局所的に塗布された薬剤が蝸牛に入るのを防ぐ重要な障壁であり、私たちは現在、この障壁を通過するようにナノ粒子送達車をどのように設計できるかを理解しようとしています。丸窓膜が薬物輸送の観点からどのように機能するかを理解することは、耳への効果的な薬物送達戦略を開発する上で非常に重要です。モルモットは、耳への薬物送達を研究するための重要な前臨床動物モデルです。しかし、厚さわずか17ミクロンのこの脆弱な膜を薬物輸送研究のために単離することは、依然として大きな課題です。ここでは、効率的なベンチトップ薬物輸送研究を可能にするモルモットの丸窓膜の抽出法について説明します。内年への薬物送達の現在の研究は、主にin vivo実験モデルとそれに続く外リンパサンプリングに依存しており、円形の窓の膜輸送メカニズムの特異的で的を絞った研究は不可能です。本研究では、モルモットの丸い窓膜を周囲の骨支持体で抽出する方法を実証する。この方法により、天然組織構造の完全性が維持され、丸い窓膜を介した薬物送達の正確で標的を絞った研究が可能になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、外科的内リンパ水腫を生成するためにモルモットの内リンパ管を妨害する方法を示しています。...

内リンパ管の閉塞による内リンパ水腫の外科的誘導

このビデオでは、ブタの眼から虹彩と網膜色素上皮細胞を分離し、in vivoおよびex...

IPEおよびRPE細胞の単離:単離されたブタの眼から色素性上皮細胞を取得する技術

このビデオでは、採取した豚の肺から細気管支組織を抽出する外科的処置について説明します。ex...

ブタの細気管支組織抽出:ブタの肺から細気管支組織切片を解剖する手順

ここでモルモット モデルにおける心筋細胞ヒト iPS 細胞由来心筋パッチの注入後、左心室 cryoinjury の誘導のためのプロトコルを提案する.

モルモット モデルにおける心筋傷害の後 - 心筋パッチのこと由来の注入

この記事では、実験的な内リンパ性水力を誘導するために、モルモット内リンパ嚢を抹消し、細かいピックで内リンパ管を傷つけるための硬膜外アプローチを示しています。...

モルモットの内リンパ性水力を誘導する改訂された外科的アプローチ

ここでは、種々の哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ)から一次虹彩および網膜色素上皮細胞を単離およびトランスフェクトするプロトコルが提示される。この方法は、ヒトに移管可能なエクスビボ分析およびインビボ研究のための様々なセットアップにおける眼遺伝子治療アプローチを研究するのに理想的である。...

非ウイルス遺伝子治療のための哺乳動物一次色素上皮細胞の単離、培養、遺伝子工学

網膜色素上皮(RPE)の網膜下移植は、変性網膜疾患の治療のための最も有望なアプローチの1つです。しかし、大眼動物モデルでの前臨床試験の実施は依然として困難です。このレポートは、ミニブタへの細胞キャリア上のRPEの網膜下移植のガイドラインを提示します。...

ミニブタのキャリアへのRPEの網膜下移植:術前準備、手術手技、および術後ケアのガイドライン

糸球体濾過率(GFR)は、腎機能を評価するための理想的なマーカーです。しかし、イヌリン注射と連続血液および尿分析を用いた標準的な測定方法は実用的ではありません。この記事では、子豚のGFRを経皮的に測定する実用的な方法について説明します。...

機械的換気仔豚における糸球体濾過率の経皮吸収型測定

我々は、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)細胞の細胞を単離するための簡単で効率的な方法を説明する。この手順により、遺伝子発現解析を含む、単離されたRPEに関するフォローアップ分子生物学的研究が可能になります。...

モルモットの目からの網膜色素上皮細胞の分離

この研究は、ブタモデルで慢性皮質記録を繰り返すためのスケーラブルで信頼性が高く、再現性のある方法を示しています。この方法は、疼痛研究や神経疾患診断など、神経科学のさまざまな分野で応用されています。...

ブタの麻酔中に皮質記録を繰り返すための慢性頭蓋窓法

ここでは、マウスの眼から網膜を分離し、 ex vivo での長時間の実験を行うための詳細な方法論を提供します。このプロトコルは、生体組織中に網膜グリア をin situ...

マウス網膜におけるグリア相互作用を研究するための ex vivo 外植片モデル

学ぶモルモットの丸窓膜摘出法によるex vivo内耳薬物輸送研究。この精密な外科的手法は、構造を保持した膜の分離を可能にし、難聴治療のための標的薬物送達戦略の開発に貢献します。

モルモットの丸窓膜移植による Ex Vivo 研究

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