Name: 生活史選択の探索:温度と基質の種類をフバエの幼虫と雌の嗜好の相互作用因子として用いる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: 学ぶフバエの幼虫の餌選択と雌の産卵場所選択の評価法。基質の種類と温度の相互作用を制御された実験条件で解析し、生態学的理解と害虫管理戦略への応用に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Patrícia J. Thyssen氏、Gabriela S. Zampim氏、Lucas de Almeida Carvalho氏には、 L. cuprina のコロニーを提供し、実験の立ち上げに協力していただいたことに感謝します。また、ビデオの撮影と編集をしてくれたラファエル・バロス・デ・オリベイラにも感謝します。この研究は、動物行動学会からV.A.S.C.への発展途上国研究助成金と、T.T.T.へのFAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo助成金(20/05636-4)の支援を受けました。STとDLFは、FAPESP(それぞれ19/07285-7ポスドク助成金と21/10022-8博士奨学金)によって支援されました。V.A.S.C.とAVRは、CNPq博士課程奨学金(それぞれ141391/2019-7、140056/2019-0)の支援を受けました。T.T.T. は CNPq (310906/2022-9) によってサポートされました。

ハエのサンプルは、感染した動物ではなく、トラップを使用して取得しました。SISBIOライセンス(67867-1)が発行され、Calliphoridae科のハエを収集し、実験室条件で飼育しました。昆虫のサンプルは、ブラジルでの研究における倫理的評価を免除されています。ウシの肉と血液は商業的に入手され、倫理的クリアランスは必要ありませんでした。
1.幼虫の摂食の好み
<ol><li>寒天2%を含有するシャーレの調製<ol><li>2%寒天で4つのペトリ皿を準備します。これを行うには、300mLの水に6gの細菌寒天を加え、この混合物を電子レンジで溶かします。次に、容量を4つのガラスシャーレ(150 x 20 mm)に均等に分割し、各シャーレに約70 mLを使用します。 注:必要な実験回数に等しいペトリ皿を準備します。この研究では、36回の繰り返しが使用されました。</li>
		<li>寒天が固まったら、50 mLの円錐形チューブ(直径3 cm)を使用して、所定の切断パターンに従って、寒天にペトリ皿の両側に2つずつ、合計4つの穴を開けます(図1)。 注:このセットアップは、Fouche et al. (2021)40 および Boulay et al. (2016)42 によって以前に記述されたプロトコルと同様です。</li>
	</ol></li>
	<li>基材の調製<ol><li>新鮮な肉を血液で調製するには、200 gの新鮮な牛ひき肉に12 mLの希釈した牛の血液を加えます。よく混ぜます。基材間の相互汚染を避けるために、肉の種類ごとに異なるメスシリンダーとスプーンを使用してください。 注:希釈された血液は、抗凝固剤(3.8%クエン酸ナトリウム)と50%ろ過水と混合された50%の純血で構成されています。</li>
		<li>腐った基質を準備するには、12 mLのろ過水を5日齢の腐った牛ひき肉200 gに加え、よく混ぜます。 注:腐った肉は、新鮮なひき肉を非密閉プラスチックポット(好気性分解と非好気性分解の混合物)で25°Cで5日間インキュベートすることによって得られました。各鍋には200gの新鮮なひき肉が入っていました。その後、使用するまで冷凍しました。</li>
		<li>各ペトリ皿の2つの穴を新鮮な肉と血液の混合物で満たし、残りの2つの穴を腐った肉と水の混合物で埋めます。 注:位置の偏りを避けるために、ペトリ皿の肉の種類ごとに配置を変えてください。たとえば、 図2に示すように、ペトリ皿の中には同じ種類の肉を向かい合わせにする必要がありますが、他の皿では肉の種類を交差させる必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>実験装置<ol><li>室温(RT)が25°Cの場合、加熱パッドを光源の真下に置いて、実験エリアを均一に照らし、光に向かおうと光に逆らう動作の偏りを回避します。加熱パッドの周囲に板紙パッドを置き、実験装置が水平に保たれるようにします。 注:使用した光源は、ネオン管などの白色低発熱発光光でした。温熱パッドは、天井の電球のすぐ下のテーブルの上に置かれました(図3)。</li>
		<li>加熱パッドとレベリング板紙パッドを黒い段ボールで覆い、加熱パッドのスイッチを入れます。 注:黒い段ボールカバーは、行動アッセイに偏りを与える可能性のある視覚的な手がかりを避けるために使用する必要があります。</li>
		<li>寒天と肉の基質が入った6つのシャーレを黒い段ボールの上に置き、各タイプの2つの基材を加熱パッドの上に置き、他の2つを加熱パッドの表面から離します(図2)。基板を約10分間加熱します。 注意: ペトリ皿の蓋に結露が発生する場合があります。</li>
	</ol></li>
	<li>幼虫試験<ol><li>基板の温度(低温側:25±2°C、高温側:33±2°C)を赤外線温度計で確認します。 注:加熱パッドは、実験の全長中、オンのままです。温度測定は、実験の開始時と終了時に行われました。気温は2°C±変動しましたが、それでも暑い状態と寒い状態の間には少なくとも8°Cの温度差がありました。</li>
		<li>希望の温度に達したら、ピンセットを使用して各シャーレの中央に5匹の3齢幼虫を配置し(図2)、シャーレを蓋で覆います。選択実験を 10 分間実行します。 注:一部の幼虫は、ペトリ皿の端や蓋の上を這うことがあります。幼虫が逃げた場合は、ピンセットを使用してペトリ皿の中央に戻します。</li>
		<li>10分後、すべてのペトリ皿を加熱パッドから外し、基板を加熱し続けないように別の表面に置きます。次に、各基質の幼虫の数と、基質を選択しなかった幼虫の数を数えます。 注: Lucilia cuprina の幼虫は、この実験で観察されたように、選択した基質にとどまります。</li>
	</ol></li>
</ol>2.女性の産卵部位の好み
<ol><li>実験装置<ol><li>以前に黒い段ボールで覆われ、白色LEDライトストリップで均一に照らされた通常の棚を使用してください。 注:黒い段ボールカバーは、行動アッセイに偏りを与える可能性のある視覚的な手がかりを避けるために使用する必要があります。白色LEDストリップは、実験のすぐ上の棚の真ん中に縦に固定されています。セットアップに使用した棚は45cm離して配置されました。</li>
		<li>室温(25°C)で、棚の中央に加熱パッドを置きます。加熱パッドの周りの板紙パッドをサポートとして使用して、実験セットアップが水平になっていることを確認します。</li>
		<li>加熱パッドとレベリング板紙パッドを黒い段ボールで覆い、すべての基材の下に同じ視覚パターンを保ちます。</li>
		<li>1つの棚に2つの十字型のガラス容器を置き、それぞれに黒い段ボールと加熱パッドの上に2本のアームが必要です。実験開始前に、白色LEDライトストリップと加熱パッドのスイッチを入れてください。</li>
		<li>70%エタノールを使用して十字架(十字架と蓋の内側)を清掃し、臭いの汚染を防ぎます。</li>
	</ol></li>
	<li>基材の調製<ol><li>5日齢の腐った肉または新鮮な肉5g(各タイプの基質に2つ)を入れたクロスごとに4つのシャーレ(60 mm x 15 mm)を準備します。 注:ペトリ皿は、実験の反復回数に4倍の回数を合わせた量に等しくなります。この研究では、30回の繰り返しが使用され、合計120枚のペトリ皿が準備されました。</li>
		<li>新鮮な肉に1mLの希釈した牛の血液(抗凝固剤と50%ろ過水を含む50%の純血)を加え、腐った肉に1mLのろ過水を加えます。肉の種類ごとに異なるスプーンを使用して、肉(新鮮または腐った)と液体(血液または水)を完全に混合します。 注:雌のアッセイのための肉の調製は幼虫のアッセイと非常によく似ていますが、雌の試験は幼虫の試験よりも長く実行されるため、量は異なります。肉の種類ごとに異なるピペットチップとスプーンを使用して、基材間の臭いの相互汚染を防ぐことを忘れないでください。</li>
		<li>アルコールが十字架から完全に蒸発したかどうかを確認します。次に、十字架の各腕の先端に4つのシャーレ(各種類の肉を加熱パッドに1つ、加熱パッドの表面から他の2つ)を置きます(図4)。蓋で十字架を閉じ、基板を約10分間加熱します。 注:さらに、位置の偏りを避けるために、クロスのさまざまな肉の種類の配置を変えてください。例えば、 図 4 に示すように、ある交配種では、隣接する腕に同じ種類の肉が描かれている必要がありますが、他の交配種では、同じ種類の肉が互いに向かい合っている必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>女性テスト<ol><li>ハエのケージに妊娠中の雌を集め、個々のチューブに隔離します。 注:妊娠中の女性は、妊娠していない女性とは対照的に、肥大した白っぽい黄色の腹部を持っていることを特徴としています(図5)。妊娠中の雌は、実験のために羽化後10〜16日の間に収集されました。</li>
		<li>赤外線温度計を使用して、クロス内の基板の温度(低温側:25±2°C、高温側:33±2°C)を確認します。 注:幼虫試験と同様に、加熱パッドは実験の全長にわたってオンのままです。温度測定は、実験の開始時と終了時に行われました。気温は2°C±変動しましたが、それでも暑い状態と寒い状態の間には少なくとも8°Cの温度差がありました。</li>
		<li>各十字架の中央の開口部に1匹の妊娠中の女性を含むチューブを逆さまに置きます。女性が十字架に入ったら、チューブを取り外し、小さな蓋で開口部を閉じます。すべての十字架を閉じた後、棚の前面に黒い段ボールを置き、実験セットアップを囲みます。実験を4時間実行します。</li>
		<li>その後、メスをチューブで慎重にキャッチして取り出し、基板に卵がないか確認します。</li>
		<li>各ペトリ皿の蓋を、各クロスから基板タイプで識別します。70%エタノールを使用して、テストからの臭いから十字架(十字架と蓋の内側)をきれいにします。 注:実験直後に卵を数えることができない場合は、基質の入ったペトリ皿を-20°Cで保存することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>卵の数 注:ペトリ皿の基質が凍結している場合は、カウントする前に解凍してください。<ol><li>実体顕微鏡を使用して、各基質に産卵された卵の数を数えます。ブラシと水を使用して卵を分離し、卵を数えます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. データ分析と統計
<ol><li>選好指数の計算<ol><li>幼虫(n = 36)および雌(n = 30)のテストの繰り返しごとに、すべての基質(新鮮で暑い+新鮮な寒さ+腐った熱い+腐った冷たい)の幼虫または卵の合計数に対する新鮮な基質(新鮮なホットおよびフレッシュコールド)に存在する幼虫または卵の比率を決定することにより、肉(PI肉として指定)の選好指数を計算します。 PI肉 =(#新鮮な基質上の幼虫または卵)/#幼虫または卵の総数 注意: 「ホット」と「コールド」という用語は、それぞれ33±2°Cおよび25±2°Cの温度条件を示します。</li>
		<li>同様に、幼虫と雌のテストの各反復の温度の選好指数(PItemp)を、高温基質に存在する幼虫または卵の数(新鮮、高温、腐った高温)を、すべての基質上の幼虫または卵の総数(新鮮、高温、新鮮、低温+腐った高温、腐った低温)で割ったものとして計算します。 PItemp = (# 高温基板上の幼虫または卵) / # 幼虫または卵の総数 注:1に近い値は、フレッシュまたはホットの基材の好みを反映し、ゼロに近い値は、腐ったまたは冷たい基材の好みを示します。PIは、手動で計算することも、提供されたコード(補足ファイルS1および補足ファイルS2)を使用して計算することもできます。</li>
	</ol></li>
	<li>観測された選好とシミュレートされたランダムデータとの比較<ol><li>提供されたコード(補足ファイルS1および補足ファイルS1)を実行してシミュレーションデータを生成し、観測データと比較します。 注:このコードは、幼虫と雌の1000のシミュレートされたランダムデータセットを生成し、シミュレートされた各複製の選好指数(PI)と L.cuprinaの観察データを計算します。シミュレーションでは、幼虫と雌の両方が基質の選好を示さず、ランダムな選択を行うと仮定しています。シミュレーションには、幼虫が基質を選択しない確率、成虫の雌が単一の基質に産卵を集中させる確率、または異なる基質に卵を均一に分配する確率など、さまざまなシナリオを含む動物の重要な行動的側面が組み込まれています。一般化線形モデル(GLM、ファミリー:準二項式、リンク:ロジット)を使用して、挙動アッセイから観察されたデータとシミュレートされたランダムデータを比較しました。採用されたGLMは、選好指数(PI)が0から1の範囲で有界であるため、この分析に適していました。GLMは、非正規分布の応答変数の処理に長けており、ロバストな統計的比較を可能にします。この選択により、行動アッセイから観察されたデータと、シミュレートされたランダムデータによって生成された複雑なパターンを効果的に比較できるようになり、有意義な洞察が促進されました。他の構造化データセットでは、コードの微調整が必要になる場合があります。</li>
	</ol></li>
</ol>

どれも宣言されていません。

特にフクロバエの寄生の文脈における食性の進化を理解するには、摂食や産卵のさまざまなライフステージにわたる基質の好みを調べる必要があります。そこで、本研究では、フクロバエの幼虫や雌の基質選好性を調べるための頑健で簡便な手法を提案した。これらの方法は、通性寄生性フガンガンであるLucilia cuprinaでテストされました2。興味深いことに、この実験では、L. cuprinaの幼虫が25°Cで肉を腐らせる傾向がはっきりと見られ、これは屍食性の種が通常使用する条件と一致しています。これは、Lucilia sericataとCalliphora vicinaの新鮮な肝臓基質の好みを示し、腐った基質が生存と成長に悪影響を与えることを示したFoucheらの研究とは異なります40。しかし、肉の腐敗の程度(7日間対5日間)と分解プロセス(純粋な嫌気性と好気性および嫌気性)が異なっていたため、両方の研究の結果を比較することは困難です。使用する種も異なっ...

ハエ、特に萼類のムコイド(フクロバエ、イエバエ、ヒツジバエ、肉バエなど)は、寄生行動や死死仙食行動など、幅広い生活様式を示す1。寄生種は通常、ウジ虫(幼虫)による生きた組織の蔓延であるミイアシスを引き起こします2。Calliphoridae科では、ウジ虫の蔓延による経済的損失と動物福祉の悪さの原因となる主要な家畜害虫です2,3,4,5,6,7。新世界と旧世界のスクリューワーム(それぞれCochliomyia hominivoraxとChrysomyia bezziana)などの偏性寄生虫は、ヒツジのフクロバエ(Lucilia cuprinaとLucilia sericata)などの通性寄生虫とともに特に問題があります4,7,8,9,102,5,6。7.屍食性を含む非寄生種は、腐敗や壊死した有機物で発生し、不衛生な環境でよく見られます。彼らの厳密に非寄生的なライフスタイルは、ハエの幼虫を使用して壊死組織の傷をきれいにするウジ虫療法にうまく使用できます11,12,13。フクロバエは、最近死亡した遺体を見つけてコロニーを形成した最初の生物の1つであり、発育中の幼虫が死亡時刻を推定する手段として機能するため、法医学でも使用されています14。
ブローフライのライフスタイルは、人間の利益に関連して重要であるため、さまざまな調査研究の対象となっています(例:15、16、17、18、19、20、21)。種のライフスタイルを支配する生物学的メカニズムを理解することは、害虫種の防除を目的とした方法を改善するための貴重な洞察を提供することができます。さらに、コガネムシのライフスタイルの多様性と進化は、複雑な形質(寄生など)の起源とメカニズムを研究するための理想的な状況を提供します。生きた組織を餌とするウジ虫による寄生は、Calliphoridae科内で数回独立して進化してきた22,23。しかし、フクロバエの食性の進化史はまだほとんど知られておらず、研究は機能アッセイの助けを借りずに系統発生に沿って習性をマッピングすることに限定されています(例:16,19,22)。例えば、義務性寄生虫がジェネラリスト(通性寄生虫)から進化したのか、それとも屍食性種から直接進化したのかは不明である。ライフスタイルの進化的変化に伴う分子的、生理学的、行動学的プロセスもほとんどわかっていません。
これに関連して、ヒツジのフクロバエLucilia cuprinaなどの通性寄生虫は、宿主の寄生虫として、または死体の屍姦虫として発生する可能性があり、ライフスタイルの選択を制御する要因とメカニズムを調査する可能性を提供します。Lucilia cuprinaは、特に害虫と見なされているオーストラリアで、羊のハエの攻撃を引き起こすことで知られるコスモポリタン種です3,16。L. cuprinaによるミヤ症は、他の家畜、ペット、および人間にも発生する可能性があります3,24,25,26,27,28,29,30。しかし、その幼虫は壊死組織や腐敗物質でも発生する可能性があり、この種は死体を見つけてコロニーを形成するのが非常に速いため、法医昆虫学で成功裏に使用されています31,32,33,34。フクロバエの寄生性と非寄生性のライフスタイルは幼虫期によって定義されますが、産卵部位を選択するのは成虫の雌です。その結果、成虫の雌は幼虫の行動が制限されているため、幼虫のライフスタイルに大きな影響を与えます。しかし、雌の選択は、幼虫が選択肢を提示されたときに同じ基質を好むことを必ずしも意味するものではない35。1つの仮説は、雌が生きた組織に卵を産むことにつながる行動の変化は、寄生的な生活様式への初期の切り替えの一部であった可能性があるというものです。得られた幼虫の事前適応または生理学的能力は、生きた組織上での発達の成功に不可欠であり、寄生生活様式の出現につながった。そのため、影響を受けるプロセスと選択されるプロセスは、必ずしも両方のライフステージ間で一致するとは限りません。
これに関連して、フクロバエ、特にL. cuprinaの幼虫の摂食基質(幼虫選好アッセイ)と産卵部位(雌の選好アッセイ)に関する行動嗜好をテストするために、2つの方法が開発されました。これらの方法では、温度と肉の鮮度という2つの相互作用する要因が考慮されます。筋虫症のほとんどの症例は恒温動物で発生するため、温度が重要な要素として選択されました2。したがって、33°Cの温度が「寄生生活因子」の代理として選択され、25°C(室温)の温度が「非寄生因子」を表します。25°Cは、ブラジルで記録された年間平均気温を表すため、選択されました(国立気象研究所、INMET)。さらに、2種類の肉基質が検討されたが、いずれもウシ由来である:(i)寄生性生活様式の基質を模倣した血液を添加した生肉(寄生性フクロバエ社ヒトボラックスを実験室条件36で飼育するために使用される)、および(ii)屍食生活様式の基質を模倣した5日齢の腐肉。ウシ基質は、生態学的に正当化可能な基質であると同時に、入手可能性、費用対効果、および実用性の点でいくつかの利点を提供するため、実験室条件27,37,38,39でL.cuprinaを飼育するために一般的に使用されます。フクロバエの腐った基質と新鮮な基質の影響を比較した他の研究40,41では、7日齢の腐った基質(嫌気性条件)を使用し、腐った基質が発生速度、生存率、および成長に悪影響を与えることを示しました。 L. cuprinaは、通常空気にさらされる新鮮な死体にコロニーを形成することが知られているため、私たちは、5日齢の腐った肉(牛ひき肉)を非密閉性の鍋(好気性および嫌気性分解)で使用し、屍食性の基質を模倣することにしました。
ここで紹介する実験計画は、個々の因子とその複合効果に対する選好を見分けるという利点があります。さらに、スコアリングされた表現型、すなわち幼虫の摂食基質の選択と産卵数は、フクロバエ種の生物学的および生態学的側面に直接関連しています。これらのプロトコルの適合性は、 L. cuprinaにおける有効性を実証することによって強調されています。さらに、 L. cuprina で得られた観察結果をシミュレートされたランダムデータと比較するために使用できる統計分析用のスクリプトが提供されており、堅牢な統計分析と解釈を保証します。

<table><tbody><tr><td>寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05038-500G</td><td>微生物学用</td></tr><tr><td>黒い段ボール</td><td>-</td><td>-</td><td>70x50 cm</td></tr><tr><td>の抗凝固剤とウシの血液&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>抗凝固剤(3.8%クエン酸ナトリウム)を含む50%の純粋なウシの血液+ ろ過された水の50%</td></tr><tr><td>ウシのひき肉</td><td>-</td><td>脂肪</td><td>の約7-8%</td></tr><tr><td>ブラシ</td><td>-</td><td></td><td>プラスチック</td></tr><tr><td>円錐形チューブ</td>ファ<td>ルコンまたはジェネリック</td><td>-</td><td>50mL</td></tr>で作られました <tr><td>十字型ガラス容器</td><td>手作り</td><td>NA</td><td>48x48 cm、高さ8 cm、幅</td></tr><tr><td>8 cm三角</td><td>Vidrolabor</td><td>NA</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>シンセ</td><td>A1084.01.BL</td><td>70%エチルエタノール絶対+ 30%ろ過水</td></tr><tr><td>メス</td><td>シリンダーNalgonまたはジェネリック</td><td>-</td><td>500mLおよび50mL</td></tr>加熱<tr><td>パッド</td>Thermolux-30x40 <td></td><td></td><td>cm寸法、40 W、127 V</td></tr><tr><td>赤外線温度計</td><td>HeTaiDa</td><td>HTD8808</td><td>非接触体温計(サンプルレート:0.5 S、 精度:&plusmn;0.2 °;C、 測定:5-15 cm)</td></tr><tr><td>ペトリ皿(ガラス)</td><td>精密</td><td>NA</td><td>150x20 mm寸法</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;&nbsp;</td><td>(注:ペトリ皿は一度だけ使用するとプラスチックにすることができます)</td></tr><tr><td>ペトリ皿PS</td><td>Cralplast</td><td>18130</td><td>60x15 mm寸法</td></tr>プラスチック<tr><td>パスツールピペット</td><td></td><td>--</td><td>3 mL(総容量)</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>シンセ</td><td>C11033.01.AG</td><td>3.8%クエン酸ナトリウム(ろ過水1Lで希釈した38 g)</td></tr><tr><td>スプーン</td><td></td>-<td>-</td><td>1スプーン以上が必要です。肉の基材の種類ごとに1つずつ使用してください。できればステンレス鋼。</td></tr><tr><td>ステンレス鋼のへら</td><td>ジェネリック</td><td>-</td><td>フラットエンドとスプーンエンド</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td> Bioptika-WF10X<td></td><td></td><td>/22 レンズ</td></tr><tr><td>ピンセット</td> -<td></td><td></td><td>- 金属製で細かい点</td></tr><tr><td>白色 LED ライトストリップ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>4.8 W、2x0.05 mm&sup2;、320 ルーメン、色温度:6500 K (白)</td></tr></tbody></table>

生活史選択の探索:温度と基質の種類をフバエの幼虫と雌の嗜好の相互作用因子として用いる

Exploring Life History Choices: Using Temperature and Substrate Type as Interacting Factors for Blowfly Larval and Female Preferences

フクロバエ(双翅目:Calliphoridae)は、通常、偏性寄生、通性寄生、および完全な屍姦に分類される、幅広い幼虫のライフスタイルを示します。いくつかの寄生種は、義務性および通性の両方で、幼虫がミイアシス(生きた組織へのウジの蔓延)を引き起こす可能性があるため、衛生的および経済的に重要であると考えられています。しかし、産卵部位の選択には成虫の雌が決定的な役割を果たしており、幼虫の食性や発育状況を大きく左右していることは注目に値する。この研究では、幼虫の摂食嗜好と雌の産卵部位の嗜好をテストするために、2つのプロトコルが提案されています 肉の基質の種類と温度の2つの相互作用要因を考慮します。ここで紹介するセットアップでは、2つの温度(33±2°Cと25±2°C)と2種類の肉基質(新鮮な肉に血液と5日齢の腐った肉)の4つの選択肢アッセイで、 Lucilia cuprina の幼虫と妊娠した雌を試験することができました。幼虫または妊娠中の雌は、25°Cの腐った肉(屍食性種の状態をシミュレート)、33°Cで血液を補給した新鮮な肉(寄生種の状態をシミュレート)、および2つの対照、33°Cの腐った肉、または25°Cの血液を補給した新鮮な肉のいずれかで、それぞれ穴を掘るか産卵するかを選択できます。 選好は、各反復の各オプションに産み付けられた幼虫または卵の数をカウントすることによって評価されます。観察された結果をランダム分布と比較することで、選好の統計的有意性を推定することができました。その結果、 L. cuprina の幼虫は25°Cで腐った基質を強く好むことが示された。 逆に、雌の産卵部位の嗜好は肉の種類によってより多様であった。この方法論は、同様のサイズの他の昆虫種の好みをテストするために適応させることができます。他の質問は、代替条件を使用して調べることもできます。

提示された方法の有効性を実証するために、実験は、通性寄生性フガンバエであるLucilia cuprina(科:Calliphoridae)の実験室集団を用いて行われました2。本種について得られた生データセット全体は、幼虫および雌の基質選好性試験の結果とともに補足ファイルS3にあります。幼虫と雌が何らかの基質を好むかどうかを評価するために、観察されたデータを、それぞれがランダムな選択を表す1000のシミュレーションデータセットと比較しました(補足ファイルS1のコードを参照)。統計的に有意な比較の割合(p &lt; 0.05)を選好を評価する尺度として使用した。この分析から、観察されたデータとシミュレートされたランダム選択データセットのそれぞれとの間の1000の比較すべてが肉と温度条件で有意に異なることがわかったため、幼虫は25°Cで腐った基質に対して顕著な好みを示したことが明らかになりました(図6A、表1)。同様に...

本明細書では、フクロバエの幼虫および雌の食物源および産卵嗜好を評価するための2つのプロトコルが詳述されている。これらは、基板の種類と温度という2つの相互作用する要因を持つ4つの選択肢で構成されています。このアッセイにより、幼虫の食物源の好みと雌の産卵部位の好みを決定することができます。

Blowflies (Diptera: Calliphoridae) present a wide range of larval lifestyles, typically classified as obligate parasitism, facultative parasitism, and ...

ブローバエは、義務性または通性寄生虫、および腐性屍食性である可能性のある多様なハエのグループです。寄生性種は生体組織のみを食べ、脊椎動物にミイアシスを引き起こしますが、腐死性寄生種は腐敗した有機物を食べます。通性寄生虫は、生きている物質と腐敗した物質の両方を食べ、寄生虫として生きるかどうかです。幼虫期が最も問題となるが、雌は産卵する場所を選択するため、幼虫が餌を食べて成長する場所を主に制御する上で決定的な役割を果たします。ここで紹介する方法の全体的な目標は、幼虫の餌基質の好みと雌の産卵部位の選択の両方を評価することです。幼虫の摂食の好み。ステップ1、寒天2%のペトリ皿の準備2%寒天でペトリ皿を準備します。そのためには、300ミリリットルの水に6グラムの細菌寒天を加え、この混合物を電子レンジで溶かします。次に、ボリュームを4つのペトリ皿に分けます。希望する反復回数に応じて、寒天でペトリ皿の数を準備します。寒天が固まったら、ペトリ皿の両側に2つの穴をあけた直径3センチメートルの50ミリリットルの円錐形のチューブに、論文で提供されているカッティングペッターを使用して寒天に4つの穴を開けます。ステップ2、基板の調製。新鮮な肉を血液で調製するには、抗凝固剤溶液と半分ろ過水で半分の血液である12ミリリットルの希釈した牛の血液を使用します。次に、この溶液を200グラムの新鮮な牛ひき肉に加え、よくかき混ぜます。基質間の他の汚染を避けるために、肉の種類ごとに異なる目盛りシリンダーとスプーンを使用することを忘れないでください。腐った基質を準備するには、腐った肉200グラムに12ミリリットルのろ過水を加え、新鮮な肉と同じようにかき混ぜます。実験開始に先立ち、インキュベーター内で25°Cで5日間腐らせます。肉の基質を準備した後、寒天の穴を両側の新鮮な肉と腐った肉で埋めます。ここに示しているように、ペトリ皿の肉の位置をランダム化することを忘れないでください。ステップ3、実験のセットアップ。摂氏25度の部屋では、光源の真下に加熱パッドをセットして、光に近づいたり反対に偏ったりする広い挙動で嗜好アッセイを均一に照らします。次に、加熱パッドの周りの板紙をサポートとして使用して、すべてを同じレベルに保ちます。すべてのセット、加熱パッド、サポート板紙の上に黒い段ボールを置き、すべての基材の上に同じ色のパターンを保ちます。寒天と肉の基質が入った6つのシャーレを、加熱パッドに各タイプ1つずつ、加熱パッドの表面の外側に2つの基材を入れた黒い段ボールの上に置きます。これを行うと、ペトリ皿のそれぞれに、新鮮で冷たい、腐ったと冷たい、新鮮で暑い、そして最後に腐って熱いという4つの基質を持たせることができます。基板を約10分間加熱します。ステップ4、幼虫テスト。赤外線温度計で基板の温度を確認します。寒いほうは25°Cくらい、暑いほうは33°Cくらいです。希望の温度に達したら、ピンセットを使用して各ペトリ皿の中央に5匹の3齢幼虫を配置します。次に、ペトリ皿に蓋をして、選択実験をちょうど10分間実行します。実験中、幼虫はペトリ皿の周りを這い回り、4つの選択肢から選択します。幼虫が逃げた場合は、ピンセットで取り、シャーレの中央に戻します。10分後、すべての実験ペトリ皿を加熱パッドから取り出し、別の表面に置きます。次に、各基質に何匹の幼虫がいるかを数えます。色とりどりの幼虫は、選択した基質にとどまることが観察されています。女性の産卵部位の好み。ステップ1、実験のセットアップ。この作業は、以前は黒い段ボールで覆われていた通常の棚で行うことができます。これらの段ボールは、幼虫アッセイと同様に必要であるため、成虫の雌には視覚的な手がかりがありません。また、棚にはLEDストリップを均等に並べる必要があります。摂氏25度の部屋で、棚の中央に温熱パッドを置きます。加熱パッドの周りの板紙をサポートとして使用して、すべてを同じ高さに保ちます。すべてのセットの上に黒い段ボール、加熱パッド、サポート板紙を置き、すべての基板の上に同じ色のパターンを保ちます。2つの異なる十字架の間にある同じ十字の2つのアームの下に加熱パッドを配置します。これにより、棚のスペースをより有効に活用できます。実験開始前にLEDライトと加熱パッドを点灯してください。十字型のメガネは、テスト間の臭いの汚染を避けるために、常に70%エタノールで清掃することを忘れないでください。ステップ2、基板の調製。プラスチック製のペトリ皿に5グラムの新鮮な肉または腐った肉を入れて準備します。基質は幼虫試験と同じで、新鮮で生後5日で腐っています。各十字架には合計4つのペトリ皿が必要で、2つは新鮮な肉で、2つは腐った肉で。新鮮な肉には、抗凝固剤で血液の半分と水の半分である1ミリメートルの希釈した牛の血液を加えます。腐った肉には、ろ過した水を1ミリ加えます。腐った肉と新鮮な肉の間の臭いの相互汚染を避けるために、両方の基質をよくかき混ぜ、異なるスプーンを使用することを忘れないでください。十字架の上でアルコールが完全に蒸発していないか確認してください。次に、十字架の腕の先端に肉の入ったシャーレを4つ置き、各種類の肉を1つずつ加熱パッドに置き、残りの2つを加熱パッドの表面の外側に置きます。これにより、十字架のそれぞれに、新鮮で冷たい、腐ったと冷たい、新鮮で暑い、そして最後に腐って暑いという4つの基質を持つことができます。十字架の開口部を閉じ、基板を約10分間加熱します。ステップ3、女性テスト。ハエのケージでメスを集めます。腹部が肥大して白っぽい黄色をしているのが特徴です。個々のチューブのクロスごとに1つのメスを分離します。赤外線温度計で基板の温度を確認します。寒いほうは25°Cくらい、暑いほうは33°Cくらいです。各クロスの中央の開口部に、つかんだ女性が入ったチューブを1本置きます。女性が十字架に入った後、蓋で開口部を閉めます。すべての女性を各十字架に配置した後、棚の開いた部分を黒い段ボールで閉じて、外部光源から保護します。実験をちょうど 4 時間実行します。この時間が終了したら、チューブを使用してクロスから女性を取り外します。次に、基板上に他の位置があるかどうかを確認します。各ペトリ皿の蓋を基板の名前で識別します。70%エタノールを使用して、テストからの臭いから十字架をきれいにします。ステップ4、卵の数。ペトリ皿は、カウントする前に冷凍することができます。この場合、ペトリ皿を解凍します。次に、実体顕微鏡を使用して各基質中の卵の数をカウントします。データ分析と統計。ステップ1、選好指数の計算。行動テストの反復ごとに、基質の種類と温度について個別に選好指数が計算されます。基質タイプの選好指数は、新鮮な肉の基質上の幼虫または卵の数を、すべての基質上の幼虫または卵の総数で割った値で表されます。温度の選好指数は、高温の基質上の幼虫または卵の数を、すべての基質上の幼虫または卵の総数で割った値で表されます。両方のインデックスの選好を考慮すると、1に近い値は、新鮮な基質または高温の基質の選好を反映しています。また、ゼロに近い値は、腐った基板や冷たい基板を好むことを意味します。ステップ2では、観察された選好とランダムな選択を比較します。Y軸には温度の嗜好指数、X軸には肉の嗜好指数を可視化できます。幼虫や雌がある条件を好むかどうかを判断するために、シミュレーションデータを使用して結果を無作為の選択と比較しました。私たちの幼虫の結果は、温度と肉の好みの点で、すべてのシミュレーションデータセットから大幅に遅れていました。図式的には、幼虫が腐った冷たい基質を強く選好していたことは明らかです。その結果、肉の種類に対する女性の好みは、比較の約30%で無作為の選択と有意に異なっていることがわかった。温度については、比較の約70%が有意な選好をもたらしました。どちらのプロトコルも、肉の種類と温度という2つの相互作用要因について、幼虫と雌の好みをテストする可能性を提供します。テストは簡単で、同じサイズや他の条件の他の種の好みをテストするために適応させることができます。動物の行動は非常に多様であり、いくつかの環境要因の影響を受けることがわかっているため、不均等な照明、長引く臭い、および共有器具を介したその他の基質の汚染を避けるために特別な注意を払う必要があります。ご覧いただきありがとうございます。

exploring-life-history-choices-using-temperature-substrate-type-as

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

ショウジョウバエは温度の小さな変化を区別できるため、好ましい温度条件の環境を選択できます。このビデオでは、ショウジョウバエの幼虫の温度選好を線形の温度勾配でテストする行動アッセイについて説明します。...

温度勾配アッセイ:ショウジョウバエの幼虫の温度選好性を試験する方法

ショウジョウバエの雌は、基質の中から選択し、産卵に魅力的な場所を選択します。このビデオでは、産卵選好アッセイと呼ばれる、彼らの意思決定をテストする行動アッセイについて説明しています。注目のクリップでは、カスタムメイドのセットアップで手順を実演しており、研究者は同時に多くの女性の行動をテストできるだけでなく、ビデオ録画やオプトジェネティックセットアップにも対応しています。...

ショウジョウバエ産卵選好アッセイ:ハエの意思決定をテストする方法

ここでは、ショウジョウバエの幼虫のために明暗選好テストを記述します。このアッセイは、光センシングと処理photobehaviorの自然免疫と概日規制に関する情報を提供します。...

に自然免疫とサーカディアン規制Photobehaviorを勉強する光プアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

我々は最近、ハエの好ましい温度が日中に上昇し、夜の間に落ちる新しい ショウジョウバエ 概日出力、温度好みリズム(TPR)を同定した。TPRは、別の概日出力、運動活動から独立して規制されています。ここでは、...

ショウジョウバエにおける温度嗜好挙動とその概日リズムの設計と解析

このプロトコルは、Drosophila melanogasterの産卵嗜好を単一動物の解像度でテストするためのハイスループットアッセイを説明しています。...

個々の産卵環境を調べるために、ハイスループットアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

ここでは、連続的な温度勾配を利用したショウジョウバエ幼虫の最寄りの環境温度を決定するプロトコルを提案する.

ショウジョウバエ幼虫の温度設定を決定する温度勾配試験

ここでは、提案する土壌要因 (例えば基板の種類と含水率) への応答でEctropis grisescensの成熟した幼虫の蛹化の好みを調査するためのプロトコル選択生物検定を使用します。蛹化の動作に影響を与える要因を決定するない選択生物検定のプロトコルとの生存本e. grisescens.

蛹化の好みとEctropis grisescensの出現成功の勉強をお選びいただき、いいえ選択生物検定

ここで時間と空間で高速かつ正確な温度変化を生成するプログラム可能な温度制御のアリーナを使用して温度変化でショウジョウバエの歩行のパフォーマンスを自動的に決定するためのプロトコルを提案する.

空間と時間の温度変化に対応したショウジョウバエのパフォーマンスを決定する自動化された方法

臭気媒介昆虫の行動のアッセイのためここでは、建設と風洞の使用を述べる。風洞の設計により視覚刺激といくつかの方法、臭いの源のリリース。風洞実験は、行動的にアクティブな揮発性化学物質を識別するために重要なメソッドです。...

においの風洞媒介昆虫行動アッセイ

昆虫は、彼らが内にとどまろうとする最適な環境温度範囲を持っており、多くの外的および内的要因がこの好みを変える可能性があります。ここでは、昆虫が自然の行動を自由に発揮できるようにする、温度選択を研究するための費用効果が高く簡単な方法について説明します。...

蚊やその他の外温線の温度選好性の決定

電量呼吸法は、小さな生物の代謝率を測定するのに理想的です。本研究においてショウジョウバエ(Drosophila...

電量マイクロレスピロメトリーを用いたショウジョウバエのメラノガスターにおけるO2消費量の測定

学ぶフバエの幼虫の餌選択と雌の産卵場所選択の評価法。基質の種類と温度の相互作用を制御された実験条件で解析し、生態学的理解と害虫管理戦略への応用に貢献します。

生活史選択の探索:温度と基質の種類をフバエの幼虫と雌の嗜好の相互作用因子として用いる

さらに動画を探す