Name: マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶマウス肺静脈の微小解剖と免疫蛍光染色法。心筋スリーブの構造解析により、心房細動の発生機序と治療標的の同定に貢献する研究手法を習得できます。

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この研究は、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.)、China Scholarship Council (CSC201808130158 to R.X.)、German Research Foundation (DFG;血管医学の臨床医科学者プログラム(PRIME)、MA 2186 / 14-1からPT)、およびコロナ財団(S199 / 10079 / 2019からSC)。

マウスの肺静脈の心筋構造の解明

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<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+connexin+43%2C+ion+channels+and+Ca2%2B-handling+proteins+in+rat+pulmonary+vein+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).</li>
<li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunofluorescence+staining%2C+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).</li>
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</ol>

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

このプロトコルでは、マウス心臓のPVを区別して単離し、免疫蛍光染色を行う方法を共有しています。臓器摘出後、心臓と肺を滅菌したスクロース溶液で脱水し、続いて顕微鏡ガイド下で心室を心房と肺葉から分離しました。その後、心臓ベースを準備してPVを視覚化し、肺門からPVを切除しました。その後の免疫蛍光染色は、組織をO.C.T.化合物に包埋し、クライオトームで切断し、cTNTとCx43の免疫蛍光染色を行うことにより、クライオ技術を用いて行った。
PVの単離は、心房細動の不整脈形成におけるPVの役割を研究するのに役立ちます。しかし、マウスのPV単離は困難です。PVはサイズが小さいことに加えて、主気管支と心臓基部の突出した血管の後ろに隠れているため、検出が非常に複雑になります。このプロトコルは、マウスPVを調査するためのシンプルで透明性の高い方法を提供し、その形態学的特徴を詳細に研究するための経済的アプローチを可能にします。提案された採取および調製アプローチは、PV、対応する肺葉、およびLA間の解剖学的関係を保持し、LA-PV組織複合体全体の調査を容易にします。
<p class="jov...

心房細動(AF)は、最も一般的な持続性不整脈です1。心房細動の有病率はさらに増加しており、2060年にはヨーロッパで~1,790万人の患者数が見込まれています1。心房細動は、心筋梗塞、心不全、脳卒中の発症に不可欠な危険因子であり、個人的、社会的、社会経済的に多大な負担をもたらすため、臨床的に非常に重要です1。心房細動は何十年も前から知られていますが、心房細動の病態生理学はまだ完全には理解されていません2。
すでに1990年代後半には、肺静脈(PV)が心房細動を誘発する異所性拍動の主な発生源であるため、心房細動の開始と維持に大きな影響を与えることが研究で実証されています3。PVは他の血管とは構造的に異なることが実証されています。一般的な血管には平滑筋細胞が含まれていますが、PVのチュニカ培地には心筋細胞も含まれています4。げっ歯類では、この心臓の筋肉組織は、肺内および肺外部分、ならびに開口部領域を含むPV全体に遍在する5。ヒトでは、PVには心筋細胞も含まれており、左心房(LA)の心筋、いわゆる心筋スリーブ(MS)の延長部内で観察することができます6,7。
多発性硬化症は心房心筋と形態学的に類似している8。心房とPV心筋細胞の形状とサイズは互いに有意に変化せず、同等の電気生理学的特性を示します8。PV内の電気生理学的記録はMSの電気的活動を証明し、血管造影画像は心拍と同期した収縮を明らかにしました9,10。
ギャップ結合は、6つのコネキシンサブユニットからなる細孔形成タンパク質複合体であり、イオンと低分子の通過を可能にする11。ギャップ結合は細胞間アポジションに存在し、隣接する心筋細胞を相互接続し、心筋細胞間の細胞間電気的結合を可能にする12,13。いくつかのコネキシンアイソフォームが心臓で発現しており、コネキシン43(Cx43)は心臓のすべての領域で発現する最も一般的なアイソフォームである14。以前の研究は、PVの心筋細胞におけるCx43の発現の証拠を提供します15,16。
インタクトPV内のMSは、そのデリケートな構造のため、特に小動物モデルでは依然として困難です。ここでは、顕微鏡ガイド下マイクロダイセクションを使用して、マウスのLAおよび肺葉とともにPVを同定および分離する方法を示します。さらに、PVの免疫蛍光染色を実証し、PV内の心筋細胞とその相互接続を可視化します。

<table><tbody><tr><td>接着スライド</td><td>Epredia</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>AF568-secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td>宿主:ヤギ、反応性:ウサギ</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym LE</td><td>840104</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-secondary antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4408S</td><td>宿主:ヤギ、反応性:マウス</td></tr><tr><td>抗コネキシン 43/GJA1 抗体</td><td>アブカム</td><td>ab11370</td><td>ポリクローナル抗体 クローン GJA1 宿主 ウサギ&nbsp;</td></tr><tr><td>抗cTNT抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-12960</td><td>モノクローナル抗体、クローン:13-11、宿主:マウス</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Brush</td><td>Lukas&nbsp;</td><td>5486</td><td>size 6</td></tr><tr><td>カバー スリップ</td><td>エプレディア</td><td></td><td>24 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>クライオトーム クライオスター NX70</td><td>エプレディア&nbsp;</td><td></td><td>設定: 試験片温度: -18 >C、ブレード温度:-25°C;C</td></tr><tr><td>DFC365FXカメラ</td><td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DM6 B 蛍光顕微鏡</td><td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dubeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)1x conc.</td><td>ギブコ</td><td>14040133</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>デュモン #5FS 鉗子</td><td>F.S.T.91150-20</td><td></td> <td>2 個入</td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>F.S.T.</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>蛍光実装媒体</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Cell nuclei counterstaining</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>FIJI</td><td></td><td>解析・処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>ライカ DM6 B</td></tr><tr><td>ミクロトームブレード S35</td><td>Feather</td><td>207500000</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノーマルヤギ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S26-M</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16%</td><td>Pierce</td><td>28908</td><td>メタノールフリー</td></tr><tr><td>パスツールピペット用</td>イメージングソフトウェア<td>VWR</td><td>612-1681</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>100 mm 直径</td></tr><tr><td>ロッカー 3D デジタル</td><td>IKA Sch&uuml;トラー</td><td>00040010000</td><td></td></tr><tr><td>スライド染色ジャー</td><td>EasyDip</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>標本型</td><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>4557</td><td>25 mm x 20 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>StainTray M920 染色システム</td><td>StainTray</td><td>631-1923</td><td>20スライド用染色システム</td></tr><tr><td>ステリカン ニードル</td><td>ブラウン</td><td>4657705</td><td>G 27 - プロトコルStudent Vannas Spring Scissors F.S.T.のインジェクション(step 2)およびピン留め(step 3および4)に使用されます</td></tr><tr><td></td><td>。</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>スーパー PAP ペン リキッドブロッカー</td><td>スーパー PAP ペン</td><td>N71310-N</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ブラウン</td><td>4606108V</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>トリス ベース</td><td>ロシュ</td><td>TRIS-RO</td><td>コンポーネント 1x トリス緩衝生理食塩水 (TBS)</td></tr> <tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

肺静脈(PV)は、心房性不整脈における異所性拍動の主要な原因であり、心房細動(AF)の発症と進行に重要な役割を果たします。PVには、心筋細胞で構成される心筋スリーブ(MS)が含まれています。MSは、異所性電気インパルスを生成する能力など、心臓の働く心筋との類似性を維持するため、AFの開始と維持に関与しています。げっ歯類は広く使用されており、心筋細胞は血管壁全体に広く存在するため、肺静脈心筋を研究するための優れた動物モデルを表す可能性があります。しかし、マウスPVの正確なマイクロダイセクションと調製は、臓器のサイズが小さく、解剖学的構造が複雑なため、困難です。
マウスの左心房(LA)をPVとともに単離するための顕微鏡ガイド下顕微解剖プロトコルを実証します。 心臓トロポニン-T(cTNT)およびコネキシン43(Cx43)抗体を使用して免疫蛍光染色を行い、LAとPVの全長を可視化します。10倍および40倍の倍率でのイメージングは、PV構造の包括的なビューと心筋構造への詳細な洞察を提供し、特にMS内のコネキシン43の存在を強調しています。

12-16週齢のマウス10匹でPVのマイクロダイセクション、染色、イメージングを行いました。プロトコールに従って、すべての実験マウスでLAとともにPVをマイクロダイクすることに成功し、8匹のマウスでPVを包括的に把握した切片を取得しました。LA-PV接合部のPVオリフィス(PVO)領域、肺外PV(PV ex)(肺門とLA-PV接合部の間のPV)、肺内PV(PVin)(肺組織に囲まれたPV)を特定するために、10倍の倍率で概要画像を撮影しました(図2)。上記の領域の拡大画像は、40倍の倍率対物レンズで取得されました(図3)。
その結果、PVO、PVex、PVinに典型的な筋条線を有する特異的なcTNTシグナルが見つかりました(図3)。Cx43は3つのPV領域すべてで見られ、ほとんどが隣接する心筋細胞間で投射されていました...

このプロトコルはマウスの肺静脈の顕微鏡検査導かれた隔離そしてimmunofluorescenceの汚損を示す。左心房、肺静脈、および対応する肺を含む組織サンプルを調製し、心臓トロポニンTおよびコネキシン43について染色します。

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

心房細動は最も一般的な不整脈ですが、複雑な病態生理学はまだ完全には理解されていません。私たちの研究により、心房細動の開始と維持につながるメカニズムの理解を深めることに貢献しています。医学研究をベンチからベッドサイドまで翻訳することは大きな課題です。これに対処するために、マウスモデルから大型動物モデル、ブタまでの細胞モデルからトランスレーショナルパイプラインを確立し、新しい治療標的の同定と検証を可能にしました。マウスは不整脈の研究によく使用されます。しかし、マウスの肺静脈を研究することは困難です。肺静脈は、患者の心房細動の主な引き金です。私たちのプロトコルは、さらなる調査を実施するために肺静脈を特定して微細解剖するための効果的なガイドラインを提供します。

microdissection-immunofluorescence-staining-myocardial-sleeves-murine

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このプロトコルでは、W eは心房性不整脈に貢献したマウスとヒトの心の中に（また、心臓メラノサイトとも呼ばれます）メラニン細胞様細胞の新規な集団を同定したマウスでトリガします。...

マウスの心臓から初代メラノサイト様細胞を単離する

出典: Brown, A. O.、およびOrihuela, C. J. 心臓微小病変における肺炎連鎖球菌の可視化およびその後の心臓再構築。 J. Vis. Exp.

マウス心臓組織切片における細菌充填微細病変の免疫染色による画像診断

例えば、高血圧または心筋梗塞などの心血管疾患のマウスモデルにおける心筋細胞送達は、回生広く研究において、異なる細胞型の治療可能性を試験するために使用される。そのため、詳細な説明およびこの外科処置の明確な可視化は、小型げっ歯類の心血管細胞治療の分析の限界と利点を定義するのに役立ちます。...

心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

最小限の侵襲操作によるマウスの心筋梗塞の再現性の高いモデルが記述されています。モデル化が容易に行えるため、高い再現性と生存率を実現しています。したがって、記載されているモデルは、3Rの原則(Replacement(置換)、Refinement(改良)、Reduction(リペアメント)、Refinement(リファインメント)、Reduction(リダクション)の要求に応じて、必要な動物の数を減らします。...

マウスにおける心筋梗塞を誘発する低侵襲手術手順

ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 +白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。...

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

心エコー検査は、マウスで多用されます。高価な高分解能超音波デバイスは、この目的のために開発されています。このプロトコルでは、心臓形態を決定する組織学的形態計測学的解析と組み合わせて現実的な心エコー手順について説明します。...

マウスの心臓形態の心エコー検査・組織学的検討

この研究は、マウスの心を研究するのに光クリアと組み合わせて両面イルミネーション ライト シート蛍光顕微鏡 (LSFM)...

マウス心臓の研究のための光シート蛍光顕微鏡

ここでは、中隔動脈がカニュール化および加圧されるように、動脈灌流圧および流れを維持する動脈灌流圧および流れのex...

マウス心臓における毛細血管、細動脈、および周囲細胞の動的測定とイメージング

マウス心臓の洞房結節(SAN)と房室結節(AVN)のホールマウント免疫蛍光染色のための段階的なプロトコルを提供します。...

マウスの洞房結節と房室結節のホールマウント免疫蛍光染色、共焦点イメージング、3D再構成

ここでは、イソレクチンB4の単一染色を使用して、マウス全体の肺組織の肺微小血管密度の偏りのない定量を行うためのシンプルで経済的なプロトコルについて説明します。...

小葉全体のマウスにおける肺微小血管密度の定量化

再灌流性急性心筋梗塞 (repAMI) における心臓損傷の 3 次元 (3D)...

ライトシート蛍光顕微鏡を用いた再灌流急性心筋梗塞における心臓損傷と免疫応答の同時3D解析

学ぶマウス肺静脈の微小解剖と免疫蛍光染色法。心筋スリーブの構造解析により、心房細動の発生機序と治療標的の同定に貢献する研究手法を習得できます。

マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色

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