Name: 強膜過剰発現と2D一軸張力 の組み合わせによる 人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: 学ぶ腱組織工学の革新的手法。Scleraxis過剰発現と2D一軸張力を組み合わせ、iPSC由来間葉系幹細胞からiTenocytesを効率的に誘導する技術。腱損傷治療への応用が期待されます。

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この研究は、NIH/NIAMS K01AR071512 と CIRM DISC0-14350 から Dmitriy Sheyn に部分的に支援されました。2つのレンチウイルスパッケージングプラスミドは、サイモン・ノット研究所(シダーズ・サイナイ医療センター生物医科学科)からの寄贈品でした。

iPS細胞由来iTenocytesによる効果的な細胞治療への活用

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<li>Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenogenic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells+dictated+by+properties+of+braided+submicron+fibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).</li>
<li>Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tendon-specific+markers+in+various+human+tissues%2C+tenocytes+and+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+and+Regenerative%22%5BJournal%5D)">Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells.</a> Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).</li>
<li>Shukunami, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scleraxis+is+a+transcriptional+activator+that+regulates+the+expression+of+Tenomodulin%2C+a+marker+of+mature+tenocytes+and+ligamentocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3155(2018).</li>
<li>Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+tendon+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of tendon cell fate during development.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).</li>
<li>Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tppp3%28%2B%29Pdgfra%28%2B%29+tendon+stem+cell+population+contributes+to+regeneration+and+reveals+a+shared+role+for+PDGF+signalling+in+regeneration+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis.</a> Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).</li>
<li>Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+and+ligament+regeneration+and+repair%3A+clinical+relevance+and+developmental+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+loading+models+for+tendon+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro loading models for tendon mechanobiology.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).</li>
<li>Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cellular+strain+models+of+tendon+biology+and+tenogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748(2022).</li>
<li>Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+into+the+effects+of+the+hierarchical+structure+of+tendon+fascicles+on+micromechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+H%22%5BJournal%5D)">An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).</li>
<li>Tatullo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+influence+of+tissue+culture+plates+and+extracellular+matrix+on+mesenchymal+stem+cell+behavior%3A+A+topical+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Immunopathology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).</li>
<li>Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+behavior+using+biophysical+and+biochemical+cues%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).</li>
<li>Papalamprou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+iPSC+differentiation+into+iTenocytes+using+combined+scleraxis+overexpression+and+cyclic+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).</li>
<li>Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+tendon+reporters%2C+ScxGFP+and+ScxAP%2C+using+regulatory+elements+of+the+scleraxis+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).</li>
<li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li>
<li>Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-based+product+characterization+for+clinical+trials%3A+an+FDA+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).</li>
<li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal%2Fstem+cells%3A+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+%28IFATS%29+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+%28ISCT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li>
<li>Dunkman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tendon+injury+response+is+influenced+by+decorin+and+biglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+transcription+factors+in+tendon+development+and+differentiation%3A+their+potential+for+tendon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration.</a> Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).</li>
<li>Bloor, A. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+safety+and+efficacy+of+iPSC-derived+mesenchymal+stromal+cells+in+acute+steroid-resistant+graft+versus+host+disease%3A+a+phase+I%2C+multicenter%2C+open-label%2C+dose-escalation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).</li>
<li>McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-compatible+and+xeno-free+cultivation+of+mesenchymal+progenitors+derived+from+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11(2019).</li>
<li>Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).</li>
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<li>Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+and+cell-cell+contact+on+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 98, 184-191 (2016).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PLoS One. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+orientation+is+guided+by+strain+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28United+Kingdom%29%22%5BJournal%5D)">Cellular orientation is guided by strain gradients.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).</li>
<li>Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+scleraxis+overexpression+combined+with+cyclic+strain+enhances+ligament+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+scleraxis+synergistically+promote+the+commitment+of+human+ES+cells+derived+MSCs+to+tenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes.</a> Scientific Reports. 2, 977(2012).</li>
<li>Kataoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neo-genesis+of+tendon%2Fligament-like+tissue+by+combination+of+mohawk+and+a+three-dimensional+cyclic+mechanical+stretch+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307(2020).</li>
</ol>

すべての著者には、開示すべき利益相反はありません。

このプロトコルでは、(1)iMSCへのiPS細胞の誘導、(2)レンチウイルスベクターを用いたSCXの過剰発現、(3)2D一軸張力による細胞の成熟の3つの主要なステップでiTenocytesが生成されます。
iPS細胞をiMSCに分化するために提示されたプロトコルは、私たちのグループ2によって以前に説明されています。その発表以来、臨床試験でiMSCを使用するための確立されたプロトコル21、22、23、および市販の分化キットなど、多数のプロトコルが開発されています。iMSCのトリリネージの可能性のレビューも以前に調査されています2。方法論は異なりますが、すべてのプロトコルでは、MSC表面マーカーの安定した発現を確保するために、いくつかの継代でiMSCの分化後増殖の必要性が強調されています。この段階で、約70%のコンフルエンスで1:3の分割比を使用すると、継代後4〜6日以内に比較的コンフルエントなプレートが得られます。
形質導入に最適な力価を選択する際には、細胞の生存率と効率のバランスを取ることが重要です。力価100%で形質導入されたiMSCは、SCX-GFP陽性細胞が最高レベルを示す可能性がありますが、これらの細胞は形質導入後に3継代の分裂を停止したことは注目に値します(図3C)。したがって、100%未満の力価を使用することをお勧めします。シリコンプレートを播種する前に、フローサイトメトリーを用いてSCX-GFPレベルを再評価することをお勧めします。効率が所望の閾値を下回っていることがデータから示されている場合は、特にin vivoアプリケーションにおいて、播種前にiMSCSCX+細胞を選別することをお勧めします。
iMSCSCX+細胞をシリコーンプレートに播種したら、37°Cで一晩インキュベートして、細胞を接着させてから伸長させる必要があります。シリコーンプレート中の1.25×104セル/cm2の記載された細胞密度は、静電気張力に寄与し得る単層の過成長を防止するために最適化された24。さらに、研究は、さまざまな硬さの基質中のコンフルエント培養における細胞間直接接触が細胞の挙動を変化させる可能性があることを示唆しています24,25,26。パイロット実験では、特に後の時点で、シリコーンプレートからの目に見える細胞剥離が観察されました(図4D)。これは、オーバーコンフルエンス24によるECM細胞シートの形成に起因している可能性がある。したがって、重要なパラメータには、細胞密度とストレッチ発作の数が含まれます。現在の方法では、遺伝子発現解析によるテノジェニックポテンシャルの評価のために、3日目と7日目に細胞を採取しました。ただし、細胞を2Dバイオリアクターで少なくとも3日間延伸し、その後、過増殖や細胞剥離を防ぐために、伸張したプレートと静的プレートをモニタリングすることをお勧めします。
数回のストレッチ発作の後、ある程度の細胞のアライメントと組織化が観察されます(図4C1、E)。これは、in vitroで一軸ひずみに応答してひずみ軸に垂直な細胞のアライメントが観察される多くの研究と一致しています24,27。これに対し、静的プレートは確率的セル構成を示します(図4C2、E)。
私たちの知る限り、MSCを腱細胞またはリガメントサイトに分化するためのSCXの過剰発現と機械的刺激の相乗効果を調査した研究はごくわずかです24,28,29。Gasparらは、ここで説明したものと同様の2Dバイオリアクターシステムを採用しましたが、より高いレベルの全ひずみを適用しました(1Hzで10%、12時間/日)。興味深いことに、BM-MSCとヒトテノサイトにおけるSCX、TNMD、およびCOL1a1の発現の変化を検出することはできませんでした。しかし、これは彼らの研究24で使用されたより高い適用株に起因する可能性があります。Chenらは、レンチウイルスベクターを用いて、多層シートにアセンブルしたヒトESC-MSCにおいてSCXを過剰発現させた。彼らは、一軸の繰り返し荷重(1Hzで10%ひずみ、2時間/日、最大21日間)を加え、COL1a1、COL1a2、COL14、およびTNMDのアップレギュレーションとECM堆積の増加を観察しました29。Nicholsらは、C3H10T1/2細胞に完全長マウスScx cDNAを一過性にトランスフェクションし、単軸サイクリックひずみ(1%、1Hz、30分/日、最大14日間)で3Dコラーゲンハイドロゲルで細胞を培養しました。我々の発見と同様に、彼らのグループは、緊張した過剰発現のコンストラクトでSCXとCOL1A1の発現の上昇を観察したが、周期的な伸長に応答してTNMDの発現に変化は見られなかった28。
さらに、MKXのような他の腱関連マーカーの過剰発現を考慮することは興味深いかもしれません。Tsutsumiらは、C3H10T1/2細胞でMKXを過剰発現させ、3Dシステムで周期的な機械的伸張を施すことの複合効果を調査しました。彼らは、コラーゲン線維束とアクチンフィラメントのアライメントとともに、SCX、COL1a1、DCN、およびCOL3a1の有意なアップレギュレーションを示しました30。
iTenocytesを生成するためのこの方法には限界があることを認識することが重要です。市販の2Dバイオリアクターは概念実証作業に有利ですが、そのサイズが収率を制限します。これらの細胞がハイスループットアッセイに必要であったり、腱修復療法のための既製の細胞源として必要とされる場合は、単軸延伸を大規模に実施できるシステムの探索を検討する必要があります。さらに、さらなる研究には、安定したテノジェニック発現を確認するためのiTenocytesの増殖を含める必要があり、 in vivo 再生への寄与を評価することは、テノジェニックポテンシャルを評価するために重要です。

腱と靭帯の修復における現代の問題に取り組むには、細胞ベースの治療に適した適切な細胞候補が必要です。腱修復のための組織工学における研究の1つの手段には、潜在的な戦略として、骨髄由来間葉系間質細胞(BM-MSC)および脂肪組織由来間質細胞(ASC)の探索が含まれます。これらの細胞は、多能性能力、豊富な量、およびin vivoでの再生能力を持っています。さらに、動物モデル1では、治癒能力の向上と機能的転帰の改善が示されています。それにもかかわらず、これらの細胞は、限られた自己複製能力、表現型の多様性、そして特に腱形成のための限られた能力を示します。人工多能性幹細胞(iPS細胞)技術は、その優れた自己複製能力と比類のない発生適応性により、これらの制約に対する解決策を提供します。私たちの研究チームなどは、iPS細胞を間葉系間質細胞様体(iMSC)に分化させることに成功しました2,3。そのため、iMSCは腱細胞治療用途の同種ソースとなる可能性を秘めています。
強膜(SCX)は、腱の発達に不可欠な転写因子であり、分化した腱細胞の最も早く検出可能なマーカーと考えられています。さらに、SCXは、1a1型鎖コラーゲン1(COL1a1)、モホーク(MKX)、テノモジュリン(TNMD)などの下流の腱分化マーカーを活性化します4,5,6。腱の成熟中に発現する他の遺伝子には、チューブリン重合促進タンパク質ファミリーメンバー3(TPPP3)および血小板由来成長因子受容体アルファ(PDGFRa)7が含まれます。これらの遺伝子は腱の発達と成熟に不可欠ですが、残念ながら腱組織に特有のものではなく、骨や軟骨などの他の筋骨格組織に発現しています5,7。
腱の発達中のマーカーの発現に加えて、機械刺激は胚の腱の発達と治癒に不可欠な要素です4,5,6。腱は機械応答性があり、環境に応じて成長パターンが変化します。分子レベルでは、生体力学的手がかりは、テノサイトの発達、成熟、維持、および治癒応答に影響を与えます8。さまざまなバイオリアクターシステムが、生理学的負荷と生体力学的手がかりをモデル化するために利用されています。これらのモデルシステムには、ex vivo組織ローディング、二軸または一軸張力を適用する2D細胞ローディングシステム、および足場およびハイドロゲルを使用する3Dシステムが含まれる9,10。2Dシステムは、腱特異的遺伝子または細胞運命の文脈における細胞の形態のいずれかに対する機械的刺激の影響を研究する場合に有利であり、3Dシステムは細胞とECMの相互作用をより正確に再現することができます9,10。
2Dローディングシステムでは、細胞と培養基質の間のひずみが均一であるため、細胞の細胞骨格に加えられる負荷を完全に制御できます。二軸負荷と比較して、テノサイトは主にin vivoでコラーゲン束からの一軸負荷を受けるため、一軸負荷はより生理学的に関連しています9。日常の活動中、腱は最大6%ひずみ11の一軸引張荷重を受けることがわかっています。具体的には、以前の研究では、4%〜5%の生理学的範囲内の負荷が、SCXやTNMDなどの腱関連マーカー発現を維持することにより、腱生成分化を促進し、コラーゲン産生を増加させることが示されていることがわかっています9,10。10%を超える菌株は、外傷的には関連している可能性がありますが、生理学的には関連していません12,13。
ここでは、テノサイトの生成に不可欠である可能性のある機械的および生物学的刺激の相乗効果を考慮に入れたプロトコルが提示されます。まず、フローサイトメトリーを用いたMSC表面マーカーによって確認された、胚様体を成長因子に短期間曝露 することにより 、iPS細胞をiMSCに誘導する再現性のある方法について説明します。次に、iMSCがSCXの安定した過剰発現(iMSCSCX+)を持つように設計するためのレンチウイルス形質導入法について詳しく説明します。細胞をさらに成熟させるために、iMSCSCX+ をフィブロネクチンでコーティングしたシリコーンプレートに播種し、CellScale MCFXバイオリアクターを使用して最適化された一軸張力プロトコルを受けます。腱形成能は、初期および後期の腱マーカーのアップレギュレーション、ならびにコラーゲン沈着を観察することによって確認された14。iTenocytesを生成するこの方法は、腱細胞治療アプリケーションのための無制限の既製の同種ソースを提供する可能性のある概念実証です。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>細胞解離試薬</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌溶液</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>抗CD105</td><td>Ancell</td><td>326-050</td><td></td></tr><tr><td>APCマウス 抗ヒト CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>559942</td><td></td></tr><tr><td>APCマウス IgG2 K アイソタイプコントロール</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>555745</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark ウシ胎児血清</td><td>GeminiBio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Biglycan</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Hs00959143_m1</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>A3733</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン I 型 α 1 鎖ヒト Taqman プライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Hs00164004_m1</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン III 型 α 1 鎖ヒト Taqmanプライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Hs00943809_m1</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>ミリポア Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、低グルコース、ピルビン酸、グルタミン、フェノールなし レッド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>イーグルの最小必須培地 (EMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチンウシ血漿</td><td>Σ Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FITC マウス 抗ヒト CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>ブタ皮からのゼラチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス IgG1-PE</td><td>バイオ・ラッド</td><td>STAR117</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T/17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>IMDM、フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21056023</td><td></td></tr><tr><td>iPSCs: 83i-cntr-33n1</td><td>Cedars-Sinai iPSCコアファシリティ</td><td>N/A</td><td>https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/</td></tr> <tr><td>アイソタイプコントロール抗体、マウス IgG2a-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-271</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>2503081</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>354230</td><td>基底膜マトリックス</td></tr><tr><td>MechanoCulture FX</td><td>CellScale</td><td>N/A</td><td>ストレッチ装置</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>モヒカン ヒト Taqman プライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Hs00543190_m1</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>血小板由来成長因子受容体 A ヒト Taqman プライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Hs00998018_m1</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene 感染/トランスフェクション試薬</td><td>Millipore</td><td>Sigma TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト&nbsp;TGF-beta 1タンパク質 ヒト Taqmanプライマー</td><td>RnDシステム</td><td>240-B</td><td></td></tr><tr><td>強膜症 ヒト Taqmanプライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Hs03054634_g1</td><td></td></tr><tr><td>SCXA (SCX) (NM_00108050514) ヒトタグ付き ORFクローン</td><td>OriGene</td><td>RC224305L4</td><td></td></tr><tr><td>シリコンプレート</td><td>CellScale</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>テネイシンCヒト Taqman プライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Hs00370384_m1</td><td></td></tr><tr><td>テノモジュリン ヒト Taqman プライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Hs00223332_m1</td><td></td></tr><tr><td>トロンボスポンジン 4 ヒト Taqman プライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Hs00170261_m1</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬、BioT</td><td>Bioland Scientific LLC</td><td>B01-01</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td> <td>サーモフィッシャー</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>チューブリン重合促進タンパク質ファミリーメンバー3</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>Hs03043892_m1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632二塩酸塩</td><td>バイオジェム1293823</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

強膜過剰発現と2d一軸張力 の組み合わせによる 人工多能性幹細胞由来itenocytesの生成

Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension

腱と靭帯の修復における今日の課題は、腱の再生を促進するための細胞ベースの治療の適切で効果的な候補を特定する必要があります。間葉系間質細胞(MSC)は、腱修復のための潜在的な組織工学戦略として研究されています。それらは多能性であり、 in vivoで再生する可能性がありますが、自己複製能力には限界があり、表現型の不均一性を示します。人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、その高い自己複製能力と比類のない発生可塑性により、これらの制限を回避することができます。テノサイトの発生において、強膜(Scx)は腱分化の重要な直接的な分子調節因子です。さらに、機械調節は、胚性腱の発達と治癒を導く中心的な要素であることが示されています。そのため、私たちは、テノサイトの生成に不可欠である可能性のある生物学的および機械的刺激の相乗効果をカプセル化するプロトコルを開発しました。iPS細胞は間葉系間質細胞(iMSC)となるように誘導され、フローサイトメトリーにより古典的な間葉系間質細胞マーカーで特徴付けられました。次に、レンチウイルスベクターを用いて、iMSCを形質導入し、安定的に過剰発現するSCX(iMSCSCX+) を発現させた。これらのiMSCSCX+ 細胞は、2Dバイオリアクターを用いた一軸引張荷重により、さらにiTenocytesに成熟させることができます。得られた細胞は、初期および後期の腱マーカーのアップレギュレーション、ならびにコラーゲン沈着を観察することによって特徴付けられました。iTenocytesを生成するこの方法は、腱細胞治療アプリケーション用の潜在的に無制限の既製の同種細胞源を開発する研究者を支援するために使用できます。

ヒトiPS細胞からiMSCへの分化 前述したように、iPS細胞をiMSCに分化させるための現在のプロトコルには、胚様体の形成が含まれます2。このプロセスは、iPS細胞からiMSCを誘導するのに約10日かかります(図1A)。ただし、新しく生成された iMSC を少なくとも 2 回継代することを強くお勧めします。これにより、ゼラチンでコーティングされたプレートが不要になるだけでなく、安定したMSC発現が確立されます。分化後6継代の後に実施したフローサイトメトリー定量では、CD44(83.1%)、CD90(88.4%)、CD105(99.2%)などの古典的なMSC表面マーカーの発現が高止まりする、ほぼ純粋な細胞集団が実証されました17,18(図1B)。形態的には、iMSCは骨髄MSCによく似ており、細長く線維芽細胞のように見えます(図1C)。
レンチウイルス形質導入を用いたSCXを過剰発現させるiMSCの遺伝子工学 レンチウイルスは、SCXBを挿入してSCX-GFP+を発現させたpLenti-C-mGFPベクターをHEK293T/17細胞と2つのパッケージングプラスミドとともにトランスフェクションすることによって産生されました。トランスフェクションは、BioT(μl)とDNA(μg)の比率が1.5:1のBioTメソッド15、16 を用いて行いました。
HEK293T/17細胞を、トランスフェクションの18〜24時間前に5.3×10、4 細胞/cm2 の密度で播種した。トランスフェクション時には、低効率の力価を避けるために、細胞のコンフルエント度が80%〜95%に達する必要があります(図2B1、左)。プラスミドカクテルを添加してから 24 時間以内に、ある程度の毒性が観察され、48 時間でピークに達しました(図 2B2)。SCXレンチウイルスベクターはGFP標識であるため、GFP発現は48時間後に観察できるはずです(図2B3)。GFP発現と組み合わされた高い毒性の存在は、トランスフェクションの成功の信頼できる指標です。レンチウイルスを48時間および72時間で収集し、フローサイトメトリーおよび遺伝子発現解析を用いて形質導入効率を評価しました。GFP陽性細胞の絶対強度は、SCX積分の代理として使用され、力価が高いほど有意に高かった(図3A)。形質導入効率は、SCX-GFP+ 細胞の割合として測定され、レンチウイルス量に基づく用量反応効果を示しました(図3B)。異なる継代でのiMSCSCX+ のフローサイトメトリーでも、導入遺伝子の発現レベルや形質導入細胞の割合に変化はなく、高い安定性が示されました(図3C)。さらに、選別せずに4週間の定期培養を行った後、iMSCSCX+ はSCXの安定した過剰発現を維持しました(図3D)。75%レンチウイルスを用いて、力価に基づいて大規模な形質導入を行いました(図2C)。
iMSCSCX+の機械的負荷 iMSCSCX+細胞を、細胞密度1.25 x 104 cells/cm2(図4A、B)で変形可能なシリコンプレートに播種し、伸長プロトコルを開始する前に細胞を接着できるようにしました。最終的な播種密度は、単層の異常増殖を防ぐために最適化されました。播種密度が高すぎると、細胞の収縮が早まり、細胞死が早まることは注目に値します(図4D)。静的対照群では、細胞を同一のプレートに播種したが、延伸は行わなかった。iMSCSCX+細胞を2Dバイオリアクターで最低3日間、最大7日間、4%の一軸ひずみと0.5Hzで1日あたり2時間伸張しました。このストレッチ療法は、生理学的に関連性があると説明されているものと一致しています9。数日間の伸長後、ランダムな細胞組織化を示した静的グループと比較して、ある程度の細胞組織化が観察されます(図4C)。アクチンフィラメントのファロイジン染色は、静的プレートで観察されたランダムな細胞組織とは対照的に、細胞が伸長方向に対して垂直に成長しているように見えることをさらに強調しています(図4E)。新たに生成されたiTenocytesを特徴付けるために、以前に報告されたように、遺伝子発現解析のために3日目と7日目に細胞を採取しました14。遺伝子発現解析により、0日目のiMSCのみと比較して、3日目と7日目の両方でテノジェニック遺伝子(SCX、THBS4、COL1a1、BGN、MKX、およびTPPP3)5,7,19,20に有意なアップレギュレーションがあるため、iMSCSCX+細胞は機械応答性であることが明らかになりました(図5A)。さらに、延伸7日後の培地中のコラーゲン沈着は、iMSCSCX+延伸群で他のすべての群と比較して有意に高かった(図5B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig01.jpg"> 図1:iMSC分化の概略図とフローサイトメトリーの特性評価。 (A)iTenocyteの生成とiMSC誘導のタイムラインの全体的な概略図。Papalamprou A. et al.14の許可を得て転載。(B)フローサイトメトリー定量では、分化後6継代後にiPS細胞由来MSCの古典的なMSC表面マーカーを発現する細胞の割合が高いことが示されています。Sheyn D. et al.2の許可を得て翻案。 (C) 分化後の細胞の位相差画像は、線維芽細胞様の形態を示しています。スケールバー = 200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig02v2.jpg"> 図2:iMSCSCX+ の生産回路図。 (A)第2世代 SCXレンチウイルスベクターを用いたトランスフェクションとiMSCの形質導入の全体像。Papalamprou A. et al.14の許可を得て転載。(B1)プラスミドカクテルを添加する前のHEK293T/17細胞。(B2)HEK293T/17細胞は、48時間後にGFPを発現し、毒性を示します。(B3)HEK293T/17細胞で観察できるGFPの発現は、トランスフェクションが成功したことを示しています。(C)作製されたiMSCSCX+ 細胞(力価75%)は、核内でSCX-GFP+ を発現します。スケールバー = 400 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig03.jpg"> 図3:フローサイトメトリーと遺伝子発現による形質導入効率の決定。 GFP陽性細胞の絶対強度は、フローサイトメトリーを用いたSCX統合のプロキシとして使用しました。レンチウイルスのMOIを評価するために、すべての細胞についてフローサイトメトリー解析によりベクター力価を検証しました。(A)ウイルス力価ごとの絶対蛍光。(B)形質導入効率は、SCX-GFP+ 細胞の割合として評価されます。形質導入効率におけるレンチウイルス負荷の用量反応効果は、フロー結果をGFP+細胞のパーセンテージとして提示した場合に観察されました。MOI、感染の多重度、n = 3つの独立した形質導入。一元配置分散分析は、力価を比較するために使用されました。データはSD±平均です。*p &lt; 0.05です。(C)数回の継代後のiMSCSCX+ のフローサイトメトリーでは、安定した導入遺伝子発現のレベルに変化はなく、形質導入細胞の割合にも変化がないことが示されました。力価100%で形質導入されたiMSCは、P3で分裂を停止しました。(D)iMSCをSCX-GFP+ レンチウイルスベクター(75%、MOI = 2.9 e5 TU/mL)で形質導入し、ソーティングなしで4週間の定期培養でSCXの遺伝子発現を評価しました。SCX発現はiMSCSCX+ で有意にアップレギュレーションされ、4週間後にはSCXの安定した過剰発現を示しました。TU、形質導入ユニット;データは平均± SD、**p &gt; 0.01 です。Papalamprou A. et al.14の許可を得て転載。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig04.jpg"> 図4:iMSCSCX+ を2Dバイオリアクターに播種し、繰り返し伸長します。 (A)2Dバイオリアクターの概略図。Papalamprou A. et al.12の許可を得て転載。(B)細胞は、まず柔軟なシリコンプレートに播種され、37°Cでインキュベートされ、2Dバイオリアクターで周期的に伸長する前に接着できるようにします。(C)iMSCSCX+ を2Dバイオリアクターで最大7日間延伸しました。静的コントロールの場合、細胞は同一のプレートに播種されましたが、伸縮は行われませんでした。(C1)7日後の静的コントロールプレートは、細胞の確率的配置を示します。(C2)7日後に延伸したプレートは、比較的多くの細胞組織化を示します。(D)観察すべきでないものの3つの例。細胞の播種密度が高すぎたり、細胞が何日も引き伸ばされたりすると、細胞が剥離し始めます。(D1)細胞はわずかに成長しすぎているだけです。黄色の矢印は、細胞の早期収縮の始まりを示します。(D2)適度なレベルの生い茂り。細胞がプレートから剥離し始めます。(D3)重度の過成長。細胞はもはや単層で成長しておらず、3D構造を形成しています。黒のスケールバー = 400 μm。白色のスケールバー = 1000 μm。 (E)7日間の延伸後(または静的プレートの場合は培養中)、細胞をアクチンフィラメントのファロイジンで固定し(赤)、核のDAPIで対比染色しました(青)。白色のスケールバー = 200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig05.jpg"> 図5:2DバイオリアクターにおけるScxの過剰発現と一軸伸長によるテノジェニックマーカー遺伝子発現の刺激。 (A)iMSCSCX+ を2Dバイオリアクターで7日間延伸しました。静的コントロールの場合、細胞は同一のプレートに播種されましたが、伸縮は行われませんでした。遺伝子発現解析により、iMSCSCX+ は機械応答性であることが明らかになりました。ND = 検出なし。一元配置分散分析を使用して、 各時点とd0 です。N = 8/グループ。(B)2Dバイオリアクターでの7日間の延伸後のコラーゲン沈着。データは平均± SD です。n = 8/グループ; *p &lt; 0.05、**p &lt; 0.01、***p &lt; 0.001、****p &lt; 0.0001。Papalamprou A. et al.12の許可を得て転載。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

本稿では、レンチウイルスベクターを用いた強膜の過剰発現と2Dバイオリアクター による 一軸延伸を組み合わせたiPS細胞由来間葉系間質細胞を作製し、iTenocytesを作製する手順について述べる。

強膜過剰発現と2D一軸張力 の組み合わせによる 人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

Today&#39;s challenges in tendon and ligament repair necessitate the identification of a suitable and effective candidate for cell-based therapy to ...

腱損傷は、米国で最も蔓延している筋骨格系の問題の1つであり、年間推定3,300万人が罹患しています。私たちの研究は、患者の転帰を劇的に改善できる腱を修復するための細胞および組織工学的アプローチの開発に焦点を当てています。腱の研究を進めるために使用されている現在の技術には、人工多能性幹細胞などのさまざまなソースからの幹細胞の使用と、バイオリアクター、遺伝子工学生体材料、および腱に必要な環境の手がかりを模倣するためのその他の組織工学技術の使用が含まれます。腱が起源からどのように発達するかについての私たちの理解は限られています。腱の成熟期に非常に高度に発現するよく知られた遺伝子がいくつかあります。しかし、残念ながら、それらは腱組織に固有のものではありません。このため、研究者が腱の分化の成功を標準的に評価することは困難です。プロトコルは、IPCの優れた分化の可能性と、腱の発達に関してこれまでにわかっていることを利用しています。私たちの目標は、腱細胞治療アプリケーションのための同種細胞源を開発することです。私たちの研究室では、腱の発達をよりよく理解するために、硫酸腱が関与する経路の解明に焦点を当てました。私たちは、この知識を組織工学技術や生体材料と組み合わせて実装し、従来の腱修復のより効果的な代替法を開発したいと考えています。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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