Name: プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶ 化学的親和性に基づく細胞外小胞の単離法を用いたプロテオミクス・リン酸化プロテオミクス解析。尿由来EVからのバイオマーカー発見と液体バイオプシーへの応用可能性を探索する。

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この研究の一部は、NIHの助成金3RF1AG064250およびR44CA239845によって資金提供されています。

すべての尿サンプルは、インフォームドコンセント後に健康な個人から収集されました。実験は、ヒトサンプルを含むすべての倫理基準に準拠しており、パデュー大学ヒト研究保護プログラムのガイドラインに準拠しています。
1. 検体採取
<ol><li>15 mLのコニカル遠心チューブで12 mLの尿サンプルを2,500 x g、4°Cで10分間遠心分離し、細胞の破片や大きなアポトーシス体を除去します。</li>
	<li>上清 10 mL を新しい 15 mL チューブに移し、EV 単離を進めます。 注:プロトコルはここで一時停止でき、サンプルは-80°Cで保存し、使用時に37°Cで解凍できます。</li>
</ol>2. EVtrapアプローチによるEV絶縁
<ol><li>メーカーの指示に従って、0.5 mLのローディングバッファー(1:10 v/v比)と100 μLのEVtrapビーズスラリー(1:50 v/v比)をサンプルに加えます。</li>
	<li>サンプルを端から端まで回転させて、室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>15 mLのコニカルチューブを磁気セパレーターラックに置いて、サンプルをペレット化します。上澄みを取り除きます。</li>
	<li>ビーズを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。ピペットで静かに動かし、EVバウンドビーズを再懸濁します。</li>
	<li>チューブを1.5 mLの微量遠心チューブの磁気セパレーターラックに置き、上清を吸引します。P200ピペットを使用して上清を完全に吸引し、ビーズを吸引しないようにします。</li>
	<li>ビーズを1 mLの洗浄バッファーで洗浄します。上澄み液を吸引した直後に緩衝液を添加し、ビーズの乾燥を防ぎます。</li>
	<li>ビーズを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で室温で2回洗浄します。</li>
	<li>ビーズを調製したばかりの100 mMトリエチルアミン100 μLと室温で10分間インキュベートし、1.5 mLの微量遠心チューブ磁気セパレーターラックを使用してEVを含む溶出溶液を回収します。 注:1 mL の 100 mM トリエチルアミンを調製するには、14 μL のトリエチルアミン溶液を水で希釈します。</li>
	<li>ステップ 2.8 を繰り返して、溶出した溶液を混合します。4°Cの真空遠心濃縮機を使用して溶出液を乾燥させます。 注: 実験はここで一時停止できます。乾燥したEVサンプルは、-80°Cで数ヶ月間保存でき、次のステップや結果に悪影響を与えることはありません。</li>
</ol>3. ウェスタンブロッティングによるEVの特性評価
<ol><li>乾燥した EV サンプルの 5%(尿サンプル 0.5 mL に相当)を、10 mM ジチオスレイトール(DTT)を含む 1x ドデシル硫酸リチウム(LDS)サンプルバッファー 20 μL に再懸濁します。 注:0.5 mLの尿からのEVは、ウェスタンブロッティングでCD9(EVマーカー24)シグナルを検出するのに十分です。</li>
	<li>サンプルを95°Cで5分間煮沸します。 サンプルをポリアクリルアミドゲルにロードし、標準プロトコル25に従って電気泳動とイムノブロッティングを行います。</li>
	<li>タンパク質を低蛍光ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに転写した後、トリス緩衝生理食塩水トゥイーン-20(TBST)中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)でメンブレンを室温で1時間ブロックします。TBST バッファー 1 L を調製するには、19 mM トリス塩基、137 mM NaCl、および 1 mL の Tween-20 を加えます。HClを使用してpHを7.4に調整します。</li>
	<li>ウサギ抗CD9抗体を1:5,000の比率で1%BSAのTBSTで4°Cで一晩、または室温で2時間インキュベートします。</li>
	<li>メンブレンをTBSTでそれぞれ5分間3回洗浄します。メンブレンを抗ウサギIgG、HRP結合二次抗体と1:5000の比率でTBST中の1%BSAで室温で1時間インキュベートします。</li>
	<li>メンブレンをTBSTでそれぞれ5分間3回洗浄します。市販の増強化学発光(ECL)基質(1:1の比率)をメンブレンに添加し、化学発光イメージングシステムでシグナルを検出します。</li>
</ol>4. プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のためのサンプル調製
<ol><li>12 mM デオキシコール酸ナトリウム(SDC)、12 mM ラウロイルサルコシンナトリウム(SLS)、100 mM 重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー(TEAB)、10 mM トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、40 mM クロロアセトアミド(CAA)、およびホスファターゼ阻害剤カクテル 1 個を含む新鮮な溶解バッファーを調製します。 注:ストック溶液は、 材料表の説明に記載されています。溶解緩衝液は、必要な容量に応じて所望の濃度になるようにストック溶液を添加することによって調製されます。</li>
	<li>乾燥したEVサンプルを100 μLの溶解緩衝液に可溶化し、1,100rpmで振とうしながらサンプルを95°Cで10分間加熱します。</li>
	<li>サンプルを室温まで冷却した後、400 μL の 50 mM TEAB を添加して 5 倍に希釈します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、BCAアッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定します。50 mM TEAB で 5 倍に希釈した溶解バッファーをブランクとして使用します。</li>
	<li>酵素とタンパク質の比率が1:50 w/wのトリプシン/Lys-Cミックスを添加し、サンプルを37°Cで一晩インキュベートし、1,100rpmで振とうします。</li>
	<li>50 μL の 10% トリフルオロ酢酸(TFA)を添加してサンプルを酸性化します。</li>
	<li>600 μL の酢酸エチルをサンプルに加え、混合物を 2 分間ボルテックスします。</li>
	<li>サンプルを20,000 x g で3分間遠心分離し、上層(有機層)を除去します。吸引中に界面を乱さないようにしてください。</li>
	<li>手順4.7〜4.8を繰り返します。真空遠心濃縮機を使用して水相を乾燥させます。</li>
	<li>乾燥したサンプルを 200 μL の 0.1% TFA に再懸濁してペプチドを酸性化し、メーカーの指示に従って C18 脱塩チップを使用してサンプルを脱塩します。チップを 200 μL の 0.1% TFA 含有 80% アセトニトリルでコンディショニングし、続いて 200 μL の 0.1% TFA で 2 回コンディショニングします。酸性化したペプチドサンプルをチップにロードし、200 μL の 0.1% TFA でチップを 3 回洗浄します。200 μL の 0.1% TFA 含有 80% アセトニトリルでペプチドを溶出します。</li>
	<li>真空遠心濃縮機を使用して溶出液を乾燥させます。プロテオミクス解析のために、ペプチドサンプルの2%(尿サンプル0.2 mLに相当)を別々に乾燥させます。サンプルの残り(98%)をリン酸化プロテオミクス分析に使用します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、リン酸化ペプチド濃縮キットを使用してサンプルからリン酸化ペプチドを濃縮します。エンリッチメントについては、以下で説明する手順を実行します。<ol><li>乾燥したサンプルを200 μLのローディングバッファーに再懸濁します。50 μLのビーズをサンプルに加え、室温で20分間激しく振とうします。ビーズを含むサンプルをフリットチップにロードし、100 x gで1分間遠心分離します。</li>
		<li>チップを 200 μL のローディングバッファーで洗浄し、続いて洗浄バッファー 1、洗浄バッファー 2 の順に洗浄します。20 x g で 2 分間、100 x g で 1 分間遠心分離して、3 つの洗浄ステップをすべて実行します。</li>
		<li>ビーズの入ったチップを新しいチューブに入れて、溶出したリン酸化ペプチドを回収します。チップに溶出バッファー50 μLを加え、20 x gで2分間遠心分離します 。 さらに50 μLの溶出バッファーをチップに加え、20 x gで2分間遠心分離します。最後にもう一度、100 x gで1分間遠心分離します。</li>
	</ol></li>
	<li>溶出したリン酸化ペプチドを真空遠心濃縮機で乾燥させます。</li>
</ol>5. LC-MS/MS分析
注:さまざまな LC-MS/MS システム/設定、およびデータ依存性取得(DDA)などのデータ取得方法を使用できます。
<ol><li>乾燥したプロテオーム/リン酸化プロテオームサンプルを0.1%ギ酸(溶媒A)に再懸濁し、メーカーの指示に従ってサンプルをロードします。</li>
	<li>液体クロマトグラフィー(LC)システムを介してトラップイオンモビリティー飛行時間型 MS にサンプルを注入し、プリセットの標準化された Whisper 40 サンプル/日メソッドを使用します。ペプチドは、 材料表に記載されているように、15 cm の C18 カラム(内径 75 μm、粒子径 1.9 μm)で分離されます。</li>
	<li>プロテオミクス解析では、300-1200 m/z、0.6-1.50 1/K0 のランプあたりの質量範囲で、サイクルタイム 1.38 秒のパラレルアキュムレーションシリアルフラグメンテーションとデータ非依存取得(dia-PASEF)取得法を組み合わせてデータを取得します。</li>
	<li>リン酸化プロテオミクス解析では、400-1550 m/z および 0.6-1.50 1/K0 のランプあたりの質量範囲で dia-PASEF 取得法を使用し、サイクルタイムは 1.38 秒でデータを取得します。</li>
	<li>生ファイルをプロテオミクスソフトウェアにロードし、ライブラリフリーのデータに依存しない取り込みワークフローを使用して、シグナルの抽出、同定、定量を行います。<ol><li>検索設定には、 ホモ・サピエン スデータベース、トリプシン/P酵素を含む特定の消化物タイプ、7つの最小ペプチド長、52の最大ペプチド長、2つの切断ミス、固定修飾としてのシステインでのカルバミドメチル、アセチルタンパク質Nターム、メチオニンでの酸化、およびセリン、スレオニン、チロシンでのリン酸化(リン酸化プロテオミクス分析用)、および最大可変修飾として5を使用します。PSM、ペプチド、およびタンパク質群におけるFDRを0.01に設定します。 注:このプロトコルでは、Spectronautソフトウェアが使用されました。DIA-NNやPEAKSなどの他のDIAデータ検索ソフトウェアも一般的に使用されています。DDAモードでデータを取得した場合は、MaxQuantやProteome Discovererなどのソフトウェアが該当します。</li>
	</ol></li>
</ol>

精密な生体流体分析のためのEV分離の強化

<ol><li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+extracellular+vesicles%3A+Biogenesis%2C+RNA+cargo+selection%2C+content%2C+release%2C+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Maacha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles-mediated+intercellular+communication%3A+roles+in+the+tumor+microenvironment+and+anti-cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance.</a> Mol Cancer. 18 (1), 55(2019).</li>
<li>van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Becker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((extracellular+vesicles+in+cancer%3A+cell-to-cell+mediators+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis.</a> Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).</li>
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<li>Urabe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).</li>
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<li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteins+in+extracellular+vesicles+as+candidate+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).</li>
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<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
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<li>Iliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-derived+extracellular+vesicle+phosphoproteomics+through+chemical+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification.</a> J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).</li>
<li>Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analyses+of+kinase-dependent+tyrosine+phosphoproteomes+based+on+metal+ion-functionalized+soluble+nanopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).</li>
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<li>Nunez Lopez, Y. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+proteomics+and+phosphoproteomics+identify+pathways+for+increased+risk+in+patients+hospitalized+with+COVID-19+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Res+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565(2023).</li>
<li>Hinzman, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-omics+approach+identifies+pancreatic+cancer+cell+extracellular+vesicles+as+mediators+of+the+unfolded+protein+response+in+normal+pancreatic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232(2022).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Sci Rep. 6, 22519(2016).</li>
<li>Searle, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+high+quality+libraries+for+DIA+MS+with+empirically+corrected+peptide+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions.</a> Nat Commun. 11 (1), 1548(2020).</li>
<li>Skowronek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+in-depth+coverage+of+the+%28Phospho-%29proteome+with+deep+libraries+and+optimal+window+design+for+dia-PASEF%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF.</a> Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279(2022).</li>
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著者は、競合する金銭的利益を宣言します。Anton Iliuk と W. Andy Tao は、EVtrap ビーズを開発し、PolyMAC リン酸化ペプチド濃縮キットを商品化した Tymora Analytical Operations の共同設立者です。

EVの効果的な単離は、EV中の低存在量のタンパク質やリン酸化タンパク質を検出するために不可欠な前提条件です。このニーズを満たすための多くの方法が開発されているにもかかわらず、大多数は依然として回収率の低下や再現性の低さなどの制限に悩まされており、大規模な研究や日常的な臨床現場での利用を妨げています。DUCは一般にEV分離の最も一般的な方法と見なされており、通常、追加の洗浄ステップは、ターゲットEVの純度を高めるために適用されます27,28。この手順は、より面倒で時間のかかるDUCプロセス(>6時間)につながります。さらに、DUC後のEV回収率の低さは複数の研究で報告されており29,30、図2の結果に示されています。これに対し、EVtrapは効率的なEVアイソレーション(<1時間)と高い回収率を提供します(...

細胞外小胞(EV)は、あらゆる種類の細胞から分泌される膜内包ナノ粒子であり、血液、尿、唾液などの体液中に存在します1,2,3,4。EVは、宿主細胞の生理学的および病理学的状態を反映する多様な生理活性分子の貨物を運んでいるため、疾患の進行における重要な要因として機能します4,5,6。さらに、広範な研究により、症状の発症または腫瘍の生理学的検出の前に、EVベースの疾患マーカーを特定できることが確立されています5,6,7。
リン酸化は、細胞のシグナル伝達と調節における重要なメカニズムとして作用します。したがって、リン酸化タンパク質は、異常なリン酸化イベントが細胞シグナル伝達経路の調節不全や癌などの転移性疾患の発症と関連しているため、バイオマーカー発見のための貴重な情報源を提供します8,9,10。リン酸化動態のプロファイリングにより、疾患特異的なリン酸化タンパク質シグネチャーを潜在的なバイオマーカーとして同定することができますが、リン酸化タンパク質の存在量が少なく、動的な性質は、バイオマーカーとしてのリン酸化タンパク質の開発において大きな課題となっています11,12。特に、EV内に内包された低存在量のリン酸化タンパク質は、細胞外環境での外部酵素消化から保護されています8。したがって、EVおよびEV由来のリン酸化タンパク質は、がんやその他の疾患の早期発見におけるバイオマーカー発見の理想的な情報源となります。
EVにおけるタンパク質のリン酸化の解析は、がんのシグナル伝達と早期疾患診断を理解するための貴重なリソースを提供しますが、効率的なEV分離法の欠如が大きな障壁となっています。EVの絶縁は、通常、差動超遠心分離(DUC)によって実現されます13。しかし、この方法は時間がかかり、スループットが低く再現性が低いため、臨床的な意味合いには適していません13,14。ポリマー誘起沈殿15などの代替EV単離アプローチは、非EVタンパク質の共沈による特異性の低さによって制限される。抗体ベースのアフィニティー捕捉16 やアフィニティー濾過17 などのアフィニティーベースのアプローチは、特異性を高めますが、容量が少ないため、回収率が比較的低く制限されます。
EVのリン酸化蛋白質動態を探る上での課題を解決するため、当グループでは、EVを機能性磁気ビーズに捕捉する化学的親和性に基づく細胞外小胞全回収精製(EVtrap)技術を開発しました18。これまでの結果から、この磁気ビーズベースのEV分離法は、幅広い生体液サンプルからEVを分離するのに非常に効果的であり、DUCや他の既存の分離方法と比較して、汚染を最小限に抑えながらはるかに高いEV収率を達成できることが実証されています18,19。私たちは、EVtrapと私たちのグループによって開発されたチタンベースのリン酸化ペプチド濃縮法を利用することに成功しました20 多様な生体液に由来するEVのリン酸化プロテオームをプロファイリングし、さまざまな疾患の潜在的なリン酸化タンパク質バイオマーカーを検出します19,21,22。
ここでは、流通するEVを分離するためのEVtrapに基づくプロトコルを紹介します。このプロトコルは、尿路EVに焦点を当てています。また、ウェスタンブロッティングを用いた絶縁型EVの特性評価についても実証しています。次に、プロテオミクス分析とリン酸化プロテオミクス分析の両方のためのサンプル調製と質量分析(MS)取得について詳しく説明します。このプロトコルは、尿中EVプロテオームとリン酸化プロテオームをプロファイリングするための効率的で再現性のあるワークフローを提供し、EVとその臨床応用に関するさらなる研究を促進します23。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>ライフサイエンス製品</td><td>M-1700C-LB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ 磁気セパレーターラック</td><td>Sergi Lab Supplies</td><td>1005</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐形遠心分離チューブ</td><td>コーニング&nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>15 mLチューブ磁気セパレーターラック</td><td>Sergi Lab Supplies</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG、HRPリンク抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップインキュベートシェーカー</td><td>Bioer</td><td>DIS-87999-3367802</td><td>Bioer Thermocell Mixing Block MB-101</td></tr><tr><td>CD9 (D3H4P) ウサギmAb</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>13403S</td><td></td></tr><tr><td>クロロアセトアミド</td><td>Σ -Aldrich</td><td>C0267-100G</td><td>還元硫化基のアルキル化に使用されます。400 mMを水に新たに調製します。</td></tr><tr><td>酢酸エチル&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>E145-4</td><td>沈殿剤洗剤</td></tr><tr><td>Evosep One&nbsp;</td><td>Evosep</td><td></td><td>液体クロマトグラフィーシステム</td></tr><tr><td>Evotips</td><td>Evosep</td><td>EV2013</td><td>Evosep Oneシステム用サンプルローディング&nbsp;</td></tr><tr><td>EVtrap</td><td>Tymora Analytical</td><td></td><td>機能性磁気ビーズ、ローディングバッファー、洗浄バッファー&nbsp;</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF メンブレン</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>IPFL00010</td><td>ブロッティングメンブレン&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pepsep C18 15 x 75 x 1.9</td><td>Bruker&nbsp;</td><td>1893473</td><td>セパレーション列&nbsp;</td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤カクテル2</td>シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>P5726-5ML</td><td>100X、ホスファターゼ阻害剤。</td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤カクテル3</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P0044-1ML</td><td>100X、&nbsp;ホスホターゼ阻害剤&nbsp;</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>ThermoFisher</td><td>32106</td><td>HRP substrate&nbsp;</td></tr><tr><td>PolyMAC リン酸化ペプチド濃縮キット</td><td>Tymora Analytical</td><td></td><td>Polymer based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment</td></tr><tr><td>Nadium deoxycholate&nbsp;</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td>溶解バッファー用界面活性剤。ストック溶液として120 mMを水に調製します。</td></tr><tr><td>ラウロイルサルコシネートナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>L9150-50G</td><td>溶解バッファー用洗剤。ストック溶液として120 mMを水に調製します。</td></tr><tr><td>timsTOF HT</td><td>Bruker</td><td></td><td>トラップドイオンモビリティー飛行時間型質量分析</td></tr>計 <tr><td>TopTip C-18 (10-200 &mu;L) ヒント&nbsp;</td><td>Glygen</td><td>TT2C18.96</td><td>脱塩法</td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>471283-100ML</td><td>EV 溶出用。&nbsp;</td></tr><tr><td>ビカボン酸トリエチルアンモニウム緩衝液</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>T7408-100ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>302031-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>C4706</td><td>ジスルフィド結合の還元に使用されます。200 mMを水に溶かしてストック溶液として調製します。ストック溶液を少量に分注し、at-20&degに保管します。C(複数回の凍結融解サイクルを避けてください)。</td></tr><tr><td>トリプシン/Lys-C MIX</td><td>サーモフィッシャー</td><td>PIA41007</td><td></td></tr></tbody></table>

プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語)

Chemical Affinity-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Biofluids for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis

生体液由来の細胞外小胞(EV)は、近年、リキッドバイオプシーの分野で大きな注目を集めています。ほぼすべての種類の細胞から放出され、宿主細胞のリアルタイムスナップショットを提供し、細胞機能や疾患の発症および進行の主要なプレーヤーとして、タンパク質、特にリン酸化などの翻訳後修飾(PTM)を持つタンパク質を含む豊富な分子情報が含まれています。しかし、現在のEV単離法では収率や不純物が少ないため、生体液からのEVの単離は依然として困難であり、EVリン酸化タンパク質などのEV貨物の下流分析は困難です。ここでは、ヒト尿などの生体液からのEV単離のための官能基化磁気ビーズに基づく迅速で効果的なEV単離法と、EV単離後の下流プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析について説明します。このプロトコルにより、尿中EVの高い回収率と、EVプロテオームおよびリン酸化プロテオームの高感度プロファイルが可能になりました。さらに、このプロトコルの汎用性と関連する技術的考慮事項についてもここで説明します。

このプロトコールは、EVの単離から下流のプロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析までの包括的なワークフローを実証します(図1)。三重の尿サンプルはEV分離にかけられた。単離されたEVは、ウェスタンブロッティングによって特徴付けられ、その後、タンパク質抽出、酵素消化、ペプチドクリーンアップなどの質量分析ベースのプロテオミクスサンプル調製のために処理されました。リン酸化プロテオミクス分析では、金属イオンで機能化された可溶性ナノポリマーに基づいて、リン酸化ペプチドをさらに濃縮しました。ペプチドサンプルとリン酸化ペプチドサンプルの両方を、データ非依存モードで高分解能イオンモビリティー質量分析により分析しました。結果の生ファイルを ホモ・サピエンス ・データベースと照合し、同定とMS2レベルの定量のために、ライブラリフリーのデータに依存しない取得ワークフローを実行しました。
単離されたEVの特性評価と回収率の推定のために、まずEVを含む尿相当量0.5 mLをゲルにロードしてウェスタンブロッティングを行い、EV...

本プロトコルは、機能化された磁気ビーズを利用して尿中細胞外小胞を効率的に隔離するための詳細な説明を提供します。さらに、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、リン酸化プロテオミクスなどのその後の分析も網羅しています。

Extracellular vesicles (EVs) from biofluids have recently gained significant attention in the field of liquid biopsy. Released by almost every type of ...

私たちは、細胞外小胞を用いたバイオマーカーの探索に取り組んでいます。重要なステップの 1 つは、それらを効率的かつ選択的に分離することです。EVtrapは、磁気ビーズベースの分離に基づいており、ハイスループットで使いやすく、特に臨床用途に容易であることから、当社に大いに役立ちます。私たちは、乳がん、腎臓がん、パーキンソン病などのさまざまな疾患のタンパク質とリン酸化タンパク質バイオマーカーの発見にこのプロトコルを使用しています。このバイオマーカーは、生体液に由来します。EVはリキッドバイオプシーに使用できる可能性があり、臨床診断と治療をさらに改善することができます。現在、細胞外小胞の単離に最も一般的に使用されているアプローチは、超遠心分離と沈殿ですが、これらの方法は汚染物質の共分離に限定されており、効率も低いです。したがって、当社のEVtrap法は、EVを分離するためのより効果的な方法を提供し、より再現性と感度の高い方法を可能にし、下流の分析にも役立ちます。現在取り組んでいるのは2つのことです。まず、EVの分離と下流分析、特にマスバックアップベースの分析のための方法とプロトコルの開発を続けています。2つ目は、EVtrapの利点から、臨床分野でのさまざまな用途を模索していることです。

chemical-affinity-based-isolation-extracellular-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

血液中に存在する細胞外小胞は、さまざまな疾患の新規バイオマーカーとして提案されています。ここでは、末梢血サンプルから大きな原形質膜由来の微小胞を単離し、その後の従来のフローサイトメトリーとウェスタンブロッティングによる分析のためのプロトコルを紹介します。...

末梢血からの微小胞の単離とキャラクタリゼーション

ここでは、我々 は脳、腫瘍標本を含む全体の組織から小さな細胞小胞 (Ev) を分離するための詳しいプロトコルを提供します。このメソッドでは、さらに下流解析の固体ティッシュから EVs...

全体組織からの細胞の小胞の抽出

本報告書は、ミクログリアまたは血液マクロファージからの細胞外小胞(EV)単離に関する時系列的要件を強調している。ミクログリア由来EVは神経突起の伸長因子として評価され、血液マクロファージ由来EVはインビトロアッセイにおけるC6グリオーマ細胞浸潤の制御で研究された。目標は、これらのEV機能を特定の微小環境における免疫メディエーターとして理解することです。...

細胞外小胞由来免疫細胞由来の特徴と細胞環境への機能的影響の研究

ここでのプロトコルは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、細胞外小胞を馴化細胞培養培地から適切に分離できることを示しています。...

馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

本プロトコルは、末梢血および固体組織から細胞外小胞を抽出し、その後表面抗原およびタンパク質カーゴのプロファイリングを行う方法を記載している。...

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

このプロトコルは、エアスプレーノズルのサイズ、シース液の圧力、サンプルフロー圧力、電圧、ゲイン、およびトリガーしきい値パラメータを最適化することにより、小さな細胞外小胞の迅速かつサイズ固有の分離方法を提供します。...

低分子細胞外小胞のハイスループット単離および精製のためのフローサイトメトリーソーティングパラメータの最適化(英語)

細胞外小胞は生物医学的応用に大きな期待を寄せていますが、現在の単離法は時間がかかり、臨床使用には実用的ではありません。本研究では、大量の生体液から細胞外小胞を最小限のステップで連続的に直接単離できるマイクロ流体デバイスを紹介します。...

二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

ポリカーボネート超遠心チューブを洗浄および再利用して、プロテオミクス実験に適した細胞外小胞分離を行うための詳細なプロトコルが提供されています。...

細胞外小胞のプロテオミクス分析におけるポリカーボネート超遠心チューブの再利用

この記事では、ヒト血漿由来の細胞外小胞(EV)の単離、特性評価、定量の方法論について説明し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用した EV...

心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

ここでは、ヒト被験者の涙や唾液などの生体液から採取された細胞外小胞(EV)の特性評価法を示します。この方法で使用されるスキャナーは、サンプルの1μLからEVの表現型、サイズ、および総粒子数を検出することができます。...

体液からの細胞外小胞の特性評価

このプロトコルは、酵素的消化およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、マウスの骨格筋および骨髄から小さな細胞外小胞を分離し、構造的に複雑で収量の少ない組織から小胞富集部分を再現可能にして下流の分子解析を可能にします。...

サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離

学ぶ 化学的親和性に基づく細胞外小胞の単離法を用いたプロテオミクス・リン酸化プロテオミクス解析。尿由来EVからのバイオマーカー発見と液体バイオプシーへの応用可能性を探索する。

プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語)

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