Name: マウスの6つの後肢筋の酵素的解離によって得られた無傷の短、中、および長の骨格筋線維:指屈筋を超えて (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶマウス後肢6筋からの酵素的解離による無傷骨格筋線維の分離法。最大6mmの長さの線維を取得し、興奮収縮結合機構の生理学的研究に応用可能です。

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著者らは、動物と写真の助けをしてくれたUdeAのRobinson Ramírez教授と、技術サポートをしてくれたCarolina Palaciosに感謝の意を表します。KaikaのJohan Pinedaは、カラーカメラと蛍光カメラのセットアップを手伝ってくれました。クイーンズランド大学のShyuan Ngoさんが原稿の校正をしてくれました。この研究は、CODI-UdeA(2021年2月22日から2020-34909、2022年3月31日から2021-40170、SIU)およびコロンビアのメデジンにあるPlanning Office-UdeA(E01708-KおよびES03180101)からJCCに資金提供されました。資金提供者は、データの収集と分析、原稿の執筆または提出には参加しませんでした。

可変長マウス筋線維の酵素的単離と特性評価

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

成熟した骨格筋生物学の研究に利用できるモデルを補完するために、ここでは、短繊維、中線維、長線維を持つさまざまなマウスの筋肉の酵素解離の成功を実証します。これらの繊維は、骨格筋におけるCa2+ トランジェントのMT-II動態の一般化可能性の実証を可能にする。また、インタクト中の繊維の種類は、筋肉全体を分類した。FDBが生理学的実験に最も使用される筋肉であることから、解離後の細胞懸濁液中に存在する線維の種類を評価しました。
筋肉生物学研究のための短繊維、中繊維、長繊維のバッテリー 解剖技術、酵素処理の期間、使用する酵素の種類、および粉砕手順は、無傷の酵素解離繊維を得るためのプロトコル内の重要なステップです。解剖は、不必要なストレッチを避けながら、低酸素下での時間を短縮するために、できるだけ早く行う必要があります。後者の点は、ヒラメ筋に特に関連しており、腓腹筋-ヒラメ筋複合体を引き上げて除去してはならない。さらに、広範な酵素処理(~3時間)20,48<sup...

哺乳類の成熟した骨格筋は多機能組織です。それは代謝を高度に調節し、熱産生の主な源であり、その動的特性はそれに呼吸、体節の移動、またはある点から別の点への変位に重要な役割を果たします1,2,3。骨格筋は、ミオパチー、ジストロフィー、サルコペニアなどの遺伝性および慢性疾患、および心血管代謝性疾患などの多くの非筋肉慢性疾患を含む多くの疾患の病態生理にも関連しています3,4,5,6,7,8。
健康と病気の文脈における成熟した骨格筋の構造的および機能的特性のex vivo研究は、主に2つの実験モデル、つまり全筋肉と孤立した繊維によって可能になりました。20世紀には、研究者は、運動単位、繊維の種類、および収縮と弛緩の力と動力学などの動的特性について学ぶために、さまざまな小さな種の無傷の長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋、前脛骨筋、および腓腹筋全体の特性を利用して、運動単位、繊維の種類、および収縮と弛緩の力と動力学などの動的特性について学びました9,10,11,12,13,14,15、16.しかし、より洗練された細胞生物学研究の出現により、この分野は単一の筋線維の研究へと移行しました。その後、先駆的な研究により、ラットの無傷の指屈筋(FDB)線維を酵素解離によって単離し、その後の特性評価に役立てることが可能になりました17,18,19。FDB繊維は、手作業による解剖20によっても得ることができるが、マウスの筋肉の酵素的解離の容易さと高スループットは、様々な実験的アプローチへの適合性に加えて、後者のモデルを過去20年間に広く使用してきた。
短いFDB繊維は、電気生理学的およびその他の生物物理学的研究、生化学的、代謝的、および薬理学的分析、電子および蛍光顕微鏡実験、細胞生物学アプローチのためのトランスフェクション、または筋形成研究における幹細胞の供給源として適しています5,21,22,23,24,25,26,27,28、29、30、31、32。しかし、筋肉実験でFDB線維のみを使用すると、線維の種類を扱う研究の範囲が狭くなり、一部の方法論的手法や1匹の動物からより多くの情報を得るために利用できる生物学的物質の量が制限されます。これらの制限は、細胞生理学的現象と、異なる全身の無傷の筋肉(EDL、ヒラメ筋、ペロネイなど)で行われた以前の生化学的および動的研究との明確な相関関係を妨げます。
これらの限界を克服し、いくつかのグループは、より長いEDLとヒラメ筋24,33,34,35,36,37,38,39,40を解離することに成功し、他の関連する筋肉にこの方法をさらに拡張するための扉を開きました。しかし、EDLとヒラメ筋繊維の使用はまだ少なく、おそらくそれらを無傷の繊維として得るための方法論的な詳細が不足しているためです。ここでは、6つの筋肉から長さと種類の異なる線維を分離する方法を詳細に説明します:すでに説明した3つの筋肉(FDB、EDL、およびヒラメ筋)と、初めて解離に成功した3つの筋肉(長母腓骨伸筋[EHL]、長腓骨筋[PL]、および指腓骨筋[PDQA])。本研究の結果は、酵素的に解離した線維のモデルが幅広い研究に適しており、以前に発表されたデータとの将来の相関関係があることを裏付けており、したがって、成熟した骨格筋研究のためのモデルの利用可能性を高めます。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aceton Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Gibco BRL</td><td>15512-015</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Panreac</td><td>141138.1610</td><td></td></tr><tr><td>抗ミオシンI抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4276</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>抗ミオシンII抗体</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M8421</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>抗ミオシンIIA抗体</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>SC-71</td><td>一次抗体.HB-277ハイブリドーマ</td></tr><tr><td>から派生 抗ミオシンIIB抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>BF-F3-c&nbsp;</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ビスアクリルアミド</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Thermo Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 試薬</td><td>メルク</td><td>1.10306.0500</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>カルロエルバ</td><td>428658</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カルシウム</td><td>メルク</td><td>102066</td><td></td></tr><tr><td>二塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>メルク</td><td>2389</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 2型</td><td>ワージントン</td><td>CLS-2/LS004176</td><td></td></tr><tr><td>領事マウント</td><td>サーモ サイエンティフィック</td><td>9990440</td><td></td></tr><tr><td>クーマシー ブリリアント ブルー R 250&nbsp;</td><td>メルク</td><td>112553</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>AMRESCO</td><td>0281</td><td></td></tr><tr><td>エデチン酸 (EDTA</td>) <td>AMRESCO</td><td>0322</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>パンレアック&nbsp;</td><td></td><td></td>1423291211</tr><tr><td>グリシン</td><td>Panreac</td><td>151340.1067</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>Thermo Scientific</td><td>6765015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AMRESCO</td><td>0511</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>AMRESCO</td><td>M136</td><td></td></tr><tr><td>イソペンタン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4, AM</td><td>Invitrogen</td><td>M14206</td><td>DMSOでのみ調製。プルロン酸は必須ではなく、繊維の劣化を避けるために使用しないでください。</td></tr><tr><td>メルカプトエタノール</td><td>Applichem</td><td>A11080100</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>プロトキミカ</td><td>MP10043</td><td></td></tr><tr><td>マウス</td><td>数個</td><td></td><td>この原稿では、C57BL/6マウスのみを使用しました。しかし、いくつかの予備的な結果では、このプロトコルが同じ年齢と体重のスイスウェブスターマウスにうまく機能することが示されています。</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td><td>Promega</td><td>V3161</td><td></td></tr><tr><td>N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)</td><td>Tocris</td><td>1870</td><td></td></tr><tr><td>Optimal cutting compound (OCT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11001</td><td>ヤギ抗マウスIgG(H + L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Dodecil SufatePanreac</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>1323631209</tr><tr><td>TRIS 0.5 M、pH 6.8&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>J832</td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>AMRESCO</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AMRESCO</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖室</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チャージスライド</td><td>エリー・サイエンティフィック</td><td>5951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>実験用浴室</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>RC-27NE2</td><td>ナロー・バス・チャンバー 加熱されたプラットフォームでアンサンブル PH-6</td></tr><tr><td>ファイン・フォーセプス</td><td>ワールド・プレシジョン・インス</td>ツルメンツ <td>500338, 500230</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>ワールド・プレシジョン</td>ズ <td>バンナス・ハサミ 501778</td><td></td></tr><tr><td>ガラス パスツール・ピペット</td><td>いくつかの</td><td></td><td>ファイヤーポリッシュチップ</td></tr><tr><td>キャップ付きガラスバイアル</td><td>2-3mL</td>の容量 <td>手術</td><td></td></tr><tr><td>用ハサミ</td><td>ワールド精密機器</td><td>501223-G</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>SL 8R</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>Zeiss</td><td>Erc 5s と Axio 305 Axio</td><td>305 は、Stemi 508 ステレオスコープと組み合わせて解剖中の写真を撮影するために使用され、Erc 5s または Axio 208 は、Axio Observer A1 顕微鏡と組み合わせて、単離されたファイバーと免疫蛍光アッセイの画像を撮影するために使用されました</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>1550A Digidata</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis chamber</td><td>Bio Rad</td><td>蛍光に結合されたミニプロティアンIV</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオオブザーバーA1</td><td>蛍光のための適切な光源、フィルター、対物レンズに結合</td></tr><tr><td>光電子増倍管</td><td>堀場</td><td>製作所 R928 チューブ、浜松、D104光度計、堀場</td><td>製作所 蛍光顕微鏡の横ポートに結合</td></tr><tr>ステレオ<td>スコープ</td><td>ツァイス</td><td>ステミ508</td><td></td></tr><tr><td>スティミュレーター&nbsp;</td><td>グラスインストゥルメント&nbsp;</td><td>S6</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNE-22</td><td></td></tr><tr><td>Xilol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>808691</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気泳動分析用フリーソフト</td><td>University of Kentucky</td><td>GelBandFitter v1.7</td><td>http://www.gelbandfitter.org</td></tr><tr><td>画像解析と形態計測用のフリーソフト</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ v1.54</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Ca2+ 信号取得・解析ライセンスソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>pCLAMP v10.05</td><td>https://www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>統計解析・グラフ化ライセンスソフトウェア</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2019</td><td>https://www.originlab.com/</td></tr></tbody></table>

マウスの6つの後肢筋の酵素的解離によって得られた無傷の短、中、および長の骨格筋線維:指屈筋を超えて

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

マウスの筋肉を酵素解離させて得られた骨格筋線維は、生理学的実験に有用なモデルです。しかし、ほとんどの論文は指屈筋(FDB)の短線維を扱っており、線維の種類を扱う結果の範囲を制限し、利用可能な生物学的物質の量を制限し、細胞の生理学的現象と他の筋肉で得られた以前の生化学的および力学的知識との明確なつながりを妨げています。
この論文では、繊維の種類と長さの異なる6つの筋肉から無傷の繊維を得る方法について説明します。C57BL/6成体マウスを用いて、筋肉解剖と線維分離のプロトコルを示し、Ca2+ 一過性研究とその形態特性評価に対する線維の適合性を実証しました。筋肉の繊維タイプの組成も提示されます。解離すると、すべての筋肉は無傷になり、24時間以上活発に収縮する生きた線維が形成され、FDBは短(<1mm)、指腓骨筋(PDQA)および長腓骨筋(PL)は中間(1-3mm)を与え、長指伸筋(EDL)、長母趾伸筋(EHL)、およびヒラメ筋は長い(3-6mm)線維を放出した。
高速色素Mag-Fluo-4で記録したところ、PDQA、PL、およびEHLファイバーのCa2+ トランジェントは、IIX型およびIIB型ファイバーに対応することが知られている形態タイプII(MT-II)を連想させる高速で狭い速度論を示しました。これは、これらの筋肉がFDB(~80%)やヒラメ筋(~65%)と比較して、II型線維の90%以上を持っているという事実と一致しています。FDBを超えて、1〜6mmの長さの範囲にわたる繊維をレンダリングするいくつかの筋肉の解離を初めて実証しました。これらの線維は生存可能であり、高速のCa2+ トランジェントを与え、MT-IIが筋肉源に関係なくIIXおよびIIB高速線維に一般化できることを示しています。これらの結果により、成熟した骨格筋研究のためのモデルの利用可能性が高まります。

けいれん中の筋質Ca2+ 濃度 解離した線維のセットにおける生理学的実験の実現可能性を実証し、励起収縮カップリング(ECC)と線維タイプに関する以前の知見を拡張するために、すべての筋肉の線維でCa2+トランジェントを取得しました。まず、FDB(n=5)およびEDL(n=7)は、形態タイプII(MT-II)として知られるCa2+速度論を示した。これらは高速でスパイク状の信号であり、RTは~1ミリ秒続きます。その減衰位相は、最初の成分(A1)が全振幅の30%より大きく、そのピーク[Ca2+]が15〜30μMの間である双指数関数を当てはめることができます33,47(図3B)。それらの結果は表1の第1列にプールされ(n =...

我々は、成体マウスの6つの筋肉から異なる長さとタイプの酵素的に解離した線維を得るためのプロトコルを記述する:そのうちの3つ(屈筋指筋ブレビス、長指伸筋、ヒラメ筋)と3つは初めて正常に解離した(長反母腓骨伸筋、長腓骨筋、指腓骨筋)。

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

本研究では、マウスの6つの後肢の筋肉から長さや種類の異なる線維を単離する方法について述べる。また、励起収縮結合機構の研究を目的とした生理学的実験への適合性を検証した。長年にわたり、長い筋線維を得ることは困難であり、この分野の多くの研究の範囲は限られていました。今回、マウス屈筋、伸筋、および最大6ミリメートルの長さのエバートールで細い繊維を得ることが可能であることを示しています。一例として、6つの異なる筋肉から線維を得ることで、形態II型として知られるカルシウム一過性動態が、筋肉源の位置や機能に関係なく、IIB型およびIIX型に一般化できることを示しました。酵素単離されたファイバーのモデルは、生化学、生理学、生物物理学、細胞生物学、分子生物学の範囲で機構的な疑問に答えることができるさまざまなタイプの技術によるさまざまな実験アプローチに適していると考えています。

intact-short-intermediate-long-skeletal-muscle-fibers-obtained

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隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

このビデオは、採取したマウス伸筋長伸筋(EDL)からの単一筋繊維の分離を示しています。単離された筋線維は、筋線維関連筋幹細胞の活動を研究するために培養することができます。...

筋線維の単離:採取したマウス伸筋長指筋(EDL)から単一の筋線維を取得する技術

マウスの骨格筋を用いて小角X線回折実験を行うための詳細なプロトコルを提示する。ヒト疾患のトランスジェニックマウスモデルの広い可用性により、この実験プラットフォームは、遺伝的筋肉疾患の構造的基盤を解明するための有用な試験ベッドを形成することができます...

筋肉疾患の構造的基礎を研究するためのツールとしての無傷のマウス骨格筋のX線回折

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出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

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呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

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光学系を用いたヒドロゲル包埋無傷マウス筋線維のハイスループット収縮測定(英語)

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骨格筋間質細胞外小胞の酵素的単離

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In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

このプロトコルは、酸化性のヒメスから完全な単一筋繊維を分離し、これらの繊維から得られる高度に精製された筋芽細胞培養を確立することを記述しています。最適化された手法により、マウスあたり約300〜500本の完全な筋線維を確実に取得でき、下流の分子および細胞解析が可能になります。...

酸化的マイオファイバー挙動の評価のための単一線維分離アッセイ

学ぶマウス後肢6筋からの酵素的解離による無傷骨格筋線維の分離法。最大6mmの長さの線維を取得し、興奮収縮結合機構の生理学的研究に応用可能です。

マウスの6つの後肢筋の酵素的解離によって得られた無傷の短、中、および長の骨格筋線維:指屈筋を超えて

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