ヒト膣からの初代線維芽細胞の組織プロセシングと単離
November 22nd, 2024
このプロトコルは、閉経前または閉経後のヒト膣組織から一次線維芽細胞を単離するための信頼性と効果的な技術を示しています。膣線維芽細胞単離の既存のプロトコルでは、老化組織からの細胞単離の課題は考慮されていません。膣組織は、骨盤臓器脱手術後の女性から採取されました。
主に女性の性別の人々に影響を与える障害に関する研究は、研究が不十分で、資金も不足しています。骨盤臓器脱は、女性の性別に強く関連する障害です。これは、筋肉や靭帯が弱くなり、骨盤内臓器が骨盤内で下がり、膣内に膨らみが生じるときに発生します。
この病態生理学の文脈における細胞相互作用についてはほとんど知られていません、また、組織レベルの要因が外科的介入の成功にどのように影響するかについても。ヒトの膣からの初代線維芽細胞の単離は、骨盤臓器脱の根底にある生物学的メカニズムの研究に役立つ可能性があります。骨盤臓器脱は、一般的に高齢者または閉経後の個人に影響を及ぼします。
初代線維芽細胞の単離と増殖 この状態の研究は、細胞集団の減少と高齢のドナーのクローン形成能力のために困難です。ヒトの膣サンプルを使用するほとんどの論文は、骨盤臓器脱の閉経前の個人の組織を利用しています。閉経前と閉経後の両方の個人からのサンプルの使用を報告した論文はいくつかありましたが、高齢または閉経後のドナーから線維芽細胞を成功裏に分離するために使用されたプロトコルについて十分に詳細に説明されていませんでした。
閉経後の組織からの線維芽細胞を用いた単離および疾患モデリングは、骨盤臓器脱の細胞病態生理学を理解するために不可欠であり得る。この状態は閉経後の10年間で個人において最も高い有病率を有するため、我々は、機械的および酵素的解離の組み合わせを使用して、ヒト膣組織からの線維芽細胞が豊富な単一細胞懸濁液の単離および培養の方法を説明する。この記事では、閉経後または老化したヒト膣線維芽細胞を取得する方法に関する信頼性の高いプロトコルについて説明します。採取した組織を組織学的に分析し、プロトコールを検証しました。
組織を測定し、約1センチメートル四方のサイズにカットします。生検サイズを正確に測定します。1人のドナーからそれぞれ1cm四方を測定する2〜3回の膣生検を追加で準備し、生検を脇に置きます。
膣生検を細胞培養ペトリ皿に入れた後、2つの滅菌メスを使用して、膣組織を小さな断片に刻みます。ブレードの先端が組織の表面に対して垂直になっていることを確認します。2つのメスを使用して、組織表面に均等で安定した圧力をかけます。
交互に引っ張る動作を実行して、組織を非常に小さな断片に切断します。2つのメスを使用して、サンプルが1〜2ミリメートルのピースで均一な一貫性になるまで、このミンチ技術を繰り返します。2〜3ミリリットルの無血清細胞培養培地をプレートに加え、ミンチ組織を懸濁します。
組織片を含む溶液を上下にピペットで動かし、塊をバラバラにします。組織片を含む溶液を15ミリリットルの円錐管に移します。総容量が10ミリリットルになるまで、無血清細胞培養培地を追加します。
リベラーゼは230マイクロリットルのアリコートで保管して使用してください。チューブに230マイクロリットルのリベラーチェを追加します。サンプルミキサーを使用して、チューブを摂氏37度で3時間インキュベートし、絶えず激しく攪拌します。
一定の攪拌を維持します。インキュベーション中に30分間隔でチューブをボルテックスします。3000 Gで5分間サンプルを遠心分離し、上清を取り除き、廃棄します。
ペレットを10%ウシ胎児血清を含む1〜2ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁して、リベラーゼを希釈します。ペレットが完全に再懸濁されるまで、激しくピペットで動かします。組織酵素懸濁液を細胞ストレーナー上で静かにピペッティングして、組織酵素懸濁液を濾します。
同じドナーの複数の組織生検から細胞懸濁液を一緒に引き出します。滅菌済みの5ミリリットルシリンジのプランジャーで、組織酵素懸濁液をストレーナーに押し込みます。残りの組織片が完全に押し込まれているように見えるまで、この手順を繰り返します。
プレートは、単一のペトリ皿上で同じドナーからの複数の膣生検から細胞懸濁液を引き出しました。摂氏37度で一晩インキュベートした後、位相差顕微鏡で細胞を観察します。プレートの底に顕微鏡の焦点が合っていることを確認します。
底部には少数の線維芽細胞が付着します。以下は、プロトコルを図式化したもので、主要なステップが強調されています。図2は、0日目の懸濁細胞の位相コントラスト画像を示しています。
図3は、1cm四方の組織生検3回の引っ張られた懸濁液からの100倍の倍率での培養14日目の膣初代線維芽細胞の位相コントラスト画像です。表 1 は、この現在の研究で膣線維芽細胞の分離を試みるために他のプロトコルを使用した結果を示しています。線維芽細胞は、マントンの陽性染色によって同定されました。
免疫蛍光分析は、ここに示す閉経前および閉経後の膣組織に対して行いました。画像は200倍の倍率で撮影しました。単離された線維芽細胞は、閉経前および閉経後の組織サンプルでアルファ平滑筋アクチンおよびFアクチンでも染色されました。
私たちは、高齢のドナーの膣粘膜から一次線維芽細胞を単離するための最適化された信頼性の高いプロトコルを開発しました。初代細胞の解離のための動物およびヒト組織に対する以前に発表されたプロトコルの使用は、この研究ではヒト膣サンプルから線維芽細胞を抽出することができませんでした。私たちは、ヒトの膣組織からの細胞解離の課題について、2つの考えられる理由を仮定しています。
粘膜の真皮の厚さは、高齢のドナーで大きく、非粘膜組織のそれと比較すると、線維芽細胞の密度は高齢者で著しく減少する可能性があります。いくつかの重要な手順は変更しないでください。非常に厳密な機械的消化の実施、2つのメス技術を使用し、単一のドナーの3〜4つの全層生検の細胞懸濁液をまとめます。
私たちのプロトコルには明確な利点があります。機械的および酵素的分解により、閉経後組織の収量が向上しますが、閉経前のサンプルに悪影響を与えることはありません。私たちは、私たちのプロトコルにいくつかの制限があることを認めています。
膣脱手術が行われていない状況では、ヒトの膣組織へのアクセスが困難になる可能性があり、複数の組織生検サンプルの細胞懸濁液を吸引する必要性も制限となる可能性があります。ヒト膣線維芽細胞を必要とするこのプロトコルは、骨盤底障害、特に閉経後の個人の将来の調査に役立つツールであり、女性の健康研究への重要な追加となるでしょう。
概要
この研究は、人間の膣組織から一次線維芽細胞を分離するための信頼できるプロトコルを提示し、特に加齢と閉経に関連する課題に対処しています。この方法は、閉経前および閉経後のドナーから線維芽細胞の収率を向上させるために機械的および酵素的解離を組み合わせています。
主要な研究構成要素
研究分野
- 一次線維芽細胞の分離
- 女性の骨盤臓器脱の研究
- 加齢における細胞間相互作用
背景
- 骨盤臓器脱は主に閉経後の女性に影響を与えます。
- この状態における細胞間相互作用は十分に理解されていません。
- 線維芽細胞分離のための既存のプロトコルは、老化した組織からの課題に十分に対応していません。
使用された方法
- 機械的および酵素的消化技術
- 閉経前および閉経後のドナーから得られたヒト膣組織
- プロトコルの検証のための組織学的分析
主な結果
- 両タイプのドナーから線維芽細胞を分離するための信頼できる方法が開発されました。
- 最適な収率で線維芽細胞培養が成功裏に達成されました。
- プロトコルの改良により、従来の技術を大きく上回る結果が得られました。
結論
- この研究は、加齢した組織からの線維芽細胞分離のためのカスタマイズされた方法の重要性を強調しています。
- この研究は、骨盤臓器脱の病態生理学のより良い理解を促進し、この分野での今後の研究を支援します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reliable isolation of primary human vaginal fibroblasts from both premenopausal and postmenopausal donors addresses a critical gap in disease-relevant model development for pelvic organ prolapse research. This protocol enables standardized cellular studies across age groups, supporting mechanistic de-risking and translational continuity in women's health R&D. The method enhances predictive confidence for downstream assay development and target validation in tissue remodeling and host-microbiome interaction studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular mechanisms underlying pelvic organ prolapse using age-relevant human fibroblasts.
- Supports functional target validation by providing consistent primary cell sources from diverse donor backgrounds.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling disease-relevant tissue environments.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible fibroblast preparations for quantitative assay development.
- Improves assay reliability by ensuring consistent cell yields from both premenopausal and postmenopausal tissues.
- Enables scalable preparation of primary cells for compound screening and functional studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with the clinical demographic most affected by pelvic organ prolapse.
- Supports translational biomarker discovery by enabling studies in primary cells from older donors.
- Reduces biological risk in preclinical validation by using disease-relevant human tissue sources.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a robust method for generating primary fibroblast cultures from clinically relevant human tissue.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on tissue remodeling and cellular interactions in pelvic organ prolapse.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell-based assay platforms for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of fibroblast yield and phenotype across donor ages.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies with age-matched primary cell models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for primary fibroblast isolation applicable to multiple research programs in women's health.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in disease modeling.
- Operational Value: Standardizes fibroblast isolation across donor ages, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for target and biomarker programs in pelvic floor disorders.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of women's health research initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, mechanical and enzymatic dissociation, and primary cell culture.
- Needs access to surgical human vaginal tissue, particularly from postmenopausal donors.
- Demands standardized instrumentation for tissue processing and cell culture analytics.
- May require adaptation for use with limited tissue availability or alternative biopsy sources.
- Pooling of multiple biopsies per donor is necessary for optimal cell yield, as supported by the protocol.
