Name: ヒト膣からの初代線維芽細胞の組織プロセシングと単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶ ヒト膣組織からの初代線維芽細胞単離法。閉経後組織からの収率向上を実現した機械的・酵素的解離プロトコルを解説。骨盤臓器脱の病態生理学研究に有用です。

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<ol><li>Mirin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+disparity+in+the+funding+of+diseases+by+the+U.S%5BTitle%5D)+AND+%22J+Womens+Health%22%5BJournal%5D)">Gender disparity in the funding of diseases by the U.S.</a> J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).</li>
<li>MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+pelvic+floor+disorders+and+their+relationship+to+gender%2C+age%2C+parity%2C+and+mode+of+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery.</a> BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+show+differential+mechanoresponses+depending+on+surface+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Urogynecol+J+Pelvic+Floor+Dysfunct%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates.</a> Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Rorteau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+chronological+aging+features+in+culture+of+normal+human+dermal+fibroblasts+from+old+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors.</a> Cells. 11 (5), 858(2022).</li>
<li>Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+murine+vaginal+fibroblast+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines.</a> MethodsX. 7, 101100(2020).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((comparative+characterization+of+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+and+without+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+fibroblastic+cells+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+produce+matrices+with+increased+stiffness+and+collagen+content%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content.</a> Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).</li>
<li>Khan, M., Gasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+fibroblast+cultures+from+mouse+ear+and+tail+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues.</a> J Vis Exp. (107), e53565(2016).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+mechanical+loading+influences+the+expression+of+extracellular+matrix+and+cell+adhesion+proteins+in+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).</li>
<li>Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+primary+vaginal+fibroblasts+to+absorbable+and+nonabsorbable+implant+materials+coated+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Female+Pelvic+Med+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma.</a> Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).</li>
<li>Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+risk+factors%2C+and+predictors+of+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse.</a> Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).</li>
<li>Waise, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+isolate+human+fibroblasts+from+tissue+for+ex+vivo+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis.</a> Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).</li>
<li>Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+primary+foreskin+fibroblasts+to+study+cellular+damage+and+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction.</a> Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).</li>
<li>Da Silva Lara, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menopause+Leading+to+Increased+Vaginal+Wall+Thickness+in+Women+with+Genital+Prolapse%3A+Impact+on+Sexual+Response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sex+Med%22%5BJournal%5D)">Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response.</a> J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).</li>
<li>Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oral+epithelial+thickness+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography.</a> Diagnostics. 9 (3), 90(2019).</li>
<li>Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+the+fibroblastic+differon+of+the+dermis%3A+role+in+skin+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>アムホテリシン B</td><td>バイオテクネ</td><td>B23192</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー (100 &mu;m)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>コニカル遠心チューブ(15 mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>フェザー ディスポーザブルメス No. 15</td><td>ソコレックス</td><td>FB.15</td><td></td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>NC1983075</td><td></td></tr><tr><td>高透明度円錐形遠心チューブ (50 mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer サンプルミキサー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibronectin DuoSet ELISA</td><td>R&Dシステム</td><td>DY1918-05</td><td></td></tr><tr><td>ヒトプロコラーゲン I α 1 DuoSet ELISA</td><td>R&D Systems</td><td>DY6220-05</td><td></td></tr><tr><td>リベラーゼ研究用グレード</td><td>Σ</td><td>Aldrich 05 401 119 001</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (5000U/ml)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ、ポリスチレン (100 mm x 20 mm)</td><td>ミリポア</td><td>Σ P5606</td><td></td></tr><tr><td>血清学的ピペット (10 mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジ(5mL)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-458</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト膣からの初代線維芽細胞の組織プロセシングと単離

Tissue Processing and Isolation of Primary Fibroblasts from the Human Vagina

膣組織は、骨盤臓器脱手術を受けた10人の独立したドナーから採取されました。記載されたプロトコルを用いて、細胞をヒト膣組織から単離した。細胞集団は、細長い、平らで、紡錘形の外観を特徴としていました。他の研究と同様に、ドナーの年齢が上がるにつれて、線維芽細胞の細胞倍加能力が有意に遅くなり、クローン形成能力が低下することが観察されました。これらの違いは、高齢者(75〜78歳)から単離された線維芽細胞と若年者(35〜47歳)から単離された線維芽細胞を比較すると顕著でした。中年のドナーからの細胞は、中程度のプロファイル(56〜61歳)を示しました。細胞増殖速度は、最初に、同じ既知の播種密度の位相差顕微鏡を用いた直接可視化によって推定されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig01.jpg"> 図 1: プロトコルの図表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図1は、解離および分離プロトコルの図表を示しています。これらのステップに続いて、このプロトコルは、細胞の継代培養を可能にするのに十分な細胞数で、10人中9人のドナーで一次線維芽細胞の単離の成功率90%をもたらしました。ドナーの年齢の中央値は59歳でした。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>プロトコール(著者、年)</td>
			<td>オリジナルプロトコルのドナー組織</td>
			<td>寄付者数</td>
			<td>ドナーの年齢(年)</td>
			<td>得られた線維芽細胞</td>
			<td>形態学</td>
		</tr><tr><td>Ruiz-Zapata et al., 2013 (英語)</td>
			<td>人間の膣</td>
			<td>3</td>
			<td>56-78</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>該当なし</td>
		</tr><tr><td>Khanら、2016</td>
			<td>マウスの耳と尾</td>
			<td>2</td>
			<td>48-65</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>該当なし</td>
		</tr><tr><td>Waise et al., 2019 (英語)</td>
			<td>ヒト組織</td>
			<td>3</td>
			<td>56-75</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>該当なし</td>
		</tr><tr><td>Nadalutti et al., 2020 (英語)</td>
			<td>人間の包皮</td>
			<td>1</td>
			<td>65</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>該当なし</td>
		</tr><tr><td>現在の</td>
			<td>人間の膣</td>
			<td>10</td>
			<td>35-79</td>
			<td>はい</td>
			<td>スピンドル形状</td>
		</tr></tbody></table>表1:ヒト膣線維芽細胞の単離を成功させるためのプロトコルの比較。異なる既存のプロトコルと私たちのプロトコルとの比較は、形態学的結果によって証明されています。
表1 は、この研究で膣線維芽細胞の分離を試みるために他のプロトコルを使用した結果を示しています。私たちは、膣粘膜および高齢のドナー5から一次線維芽細胞を分離するための標準的なプロトコルを開発しました。
表1にリストされているものを含む、いくつかの確立されたプロトコルをテストしましたが、私たちの研究では、これらのプロトコルを使用した細胞単離の成功は観察されませんでした。その制限について、以下の理由を提案します。
Ruiz et al.3 によって発表されたプロトコルには、筋膜をこすり落とし、組織を細かく切断することが含まれます。私たちの経験では、筋膜を区別することは難しく、掻き取ろうとすると細胞収量が大幅に減少する可能性があります。この方法は単純ですが、重要な詳細が不足しているため、一般化可能性が制限されます。さらに、このプロトコルの機械的消化は、閉経後の組織には不十分であるように思われ、閉経後の組織はより密度が高くなる傾向があります。
Khanら9 およびWaiseら13 によって発表されたプロトコルは、メス技術と比較して大きな多方向のせん断力を導入しない組織ミンチ用のはさみを採用しています。私たちの経験では、ハサミ法も効果的に機能しませんでした。
最後に、外植片法を使用したNadaluttiら14 のプロトコルは、私たちの手に線維芽細胞をうまくもたらしませんでした。この方法は、閉経後組織の性質上、線維芽細胞をうまく解離させるために、より積極的な機械的および酵素的処理が必要になる可能性があるため、効果が低下する可能性があります。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig02.jpg"> 図2:0日目の懸濁細胞の位相コントラスト画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
図2は、私たちのプロトコルを使用した0日目の懸濁細胞を示しています。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig03.jpg"> 図3:3つの1cm2 組織生検のプール細胞懸濁液からの100倍倍拡大での培養14日目の膣初代線維芽細胞の位相コントラスト画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図3 は、1cm²の寸法の3つの組織生検のプール細胞懸濁液からの100倍の拡大で一次線維芽細胞を示しています。
線維芽細胞の同一性は、前述のように免疫蛍光法によってわずかな変更を加えて調査しました。初代膣細胞の細胞起源を確認するために、免疫蛍光染色による線維芽細胞起源の特異的バイオマーカーを使用しました。閉経前および閉経後の組織サンプル(図5)からのビメンチン(図4)、F-アクチン、およびα-SMAの陽性染色に基づいて、細胞を線維芽細胞として同定しました。線維芽細胞は、実験で使用するために、高い生存率(&gt;90%)で増殖するまで培養されました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig04.jpg"> 図4:膣線維芽細胞のビメンチンの陽性染色。 単離された閉経前および閉経後の組織初代線維芽細胞をIF分析にかけ、画像を200倍の倍率で撮影しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig05.jpg"> 図5:膣線維芽細胞のF-アクチンおよびα-SMAの陽性染色。 タンパク質発現の結果をIgGコントロールと比較した結果。画像は200倍の倍率で収集されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Research

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