くも膜下出血後の脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞のイメージング
2023年8月18日
予備調査では、くも膜下出血(SAH)が脳周皮細胞の死にを引き起こすことが確認されています。SAH後の周皮細胞の収縮性を評価するには、生存可能な脳周皮細胞と生存不可能な脳周皮細胞を区別する必要があります。そこで、高分解能共焦点顕微鏡を用いた観察を容易にするために、脳切片で生存可能な脳周皮細胞と非生存脳周皮細胞を同時に標識する手順が開発されました。
私たちの研究では、周皮細胞の死亡が有意に増加していることが示されました。したがって、SAH後の病気の馬から開始すると、低生命力寄生虫の数とSAH後の経過時間との間に正の相関関係が示されました。SAHと寄生虫分離技術に従った脳スライス中の重要な脳寄生虫と非重要な脳寄生虫のイメージングは、私の分野の研究を前進させました。
現在、寄生虫の死骸と内皮細胞の死骸を完全に区別することは非常に困難です。私たちの研究では、SAH後の寄生虫の収縮依存性アポトーシスを発見しました。私たちは、脳切片の機能的および非機能的な脳寄生虫の両方を同時に蛍光標識することを可能にする、非常に信頼性の高いプロトコルを開発しました。
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概要
本研究では、くも膜下出血（SAH）が脳周細胞に及ぼす影響を調査し、周細胞の細胞死および収縮性のメカニズムを明らかにしています。生存している周細胞と生存していない周細胞を区別するため、ラット脳切片を用いたモデルを構築しました。この手法により、高解像度イメージングを用いてSAH後の周細胞の生存能を評価することが可能となります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫蛍光顕微鏡法
背景
- くも膜下出血（SAH）は、脳周細胞の死を誘導することが知られています。
- SAH後の周細胞の生存能を理解することは、神経血管損傷を解明する上で極めて重要です。
- 現在の方法では、生存している周細胞と生存していない周細胞を十分に区別することが困難です。
- SAHにおける周細胞の変化を観察するためには、新しいイメージング技術が必要です。
研究目的
- SAH後のペリサイトの収縮能および細胞生存率を評価すること。
- 生存ペリサイトと非生存ペリサイトを同時に標識するための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 脳切片におけるペリサイトの挙動をより詳細に観察するためのイメージング技術を向上させること。
使用した手法
- ペリサイトを研究するためのex vivoモデルとして、ラット脳切片を用いた。
- 麻酔をかけたラットの鞍上槽に自己血を注入し、SAHを誘発させた。
- 免疫蛍光染色法を用いてペリサイトを標識し、生存率を評価した。
- 主要な手順として、蛍光色素によるインキュベーションおよび共焦点顕微鏡によるイメージング解析を行った。
- SAH後、異なる経過時間においてペリサイトの生存率評価を実施した。
主な結果
- SAH（くも膜下出血）の6時間後から、ペリサイトの死滅が有意に増加することが判明した。
- 非生存ペリサイトの数とSAH後の時間の間に正の相関が認められた。
- メカニズムとしては、SAH後のペリサイトにおいて、収縮依存的なアポトーシスが観察された。
- 蛍光標識法を用いて、非生存個体とともに生存ペリサイトが同定された。
結論
- 本研究は、SAH後の生存ペリサイトと非生存ペリサイトを識別するための信頼性の高い方法を提示しています。
- これらの知見は、傷害に対する神経血管反応におけるペリサイトのダイナミクスの理解を深めるものです。
- 本研究の意義は、さまざまな脳病理における神経血管傷害の理解へと及びます。
よくある質問
産業界における重要性
蜘蛛膜下出血（SAH）後の急性脳切片において、生存している脳周細胞と非生存の脳周細胞を確実に分画することは、神経血管ターゲットの検証における重要な課題を解決します。本プロトコルは、周細胞の収縮能および生存能の高解像度かつ定量的な評価を可能にし、創薬の探索段階におけるメカニズム的なリスク低減を支援します。このアプローチにより、中枢神経系（CNS）創薬における初期段階の神経血管ターゲット選定およびポートフォリオの優先順位付けに対する予測信頼性が向上します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 損傷後のペリサイトの生存性を直接的に可視化および定量化でき、堅牢なターゲットバリデーションが可能になります。
- SAH後のペリサイトの収縮性と微小血管の変化を相関させることで、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
- 予測的なトランスレーショナル価値を持つ神経血管ターゲットの同定を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ペリサイトの機能と生存率を再現性高く評価するための、検証済みex vivoシステムを提供します。
- アッセイの標準化およびダウンストリームのスクリーニングワークフローに適した、定量的なイメージング出力を提供します。
- 疾患に関連する組織学的コンテキストにおいて、化合物のペリサイトの収縮性と生存への影響を信頼性高く評価することを可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- ペリサイトの生存能および収縮能の測定を、神経血管損傷のトランスレーショナルバイオマーカーと整合させます。
- CNS血管モデルにおける、発見から前臨床検証までの継続性をサポートします。
- 神経血管治療プログラムにおける、リスク調整後の進展決定に情報を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このプロトコルは、神経血管ターゲットの初期探索から前臨床に至る一連の流れに組み込まれており、メカニズム研究とトランスレーショナルモデルの検証を橋渡しするものです。
- 探索生物学：SAH後のペリサイトを介した微小循環機能不全に関する仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物の選別に向けて、再現性と定量性のあるイメージング出力を提供します。
- 解析：実験条件間におけるペリサイトの生存率と収縮能の統計的な比較をサポートします。
- トランスレーショナルリサーチ：ex vivoでの知見をin vivoの神経血管損傷モデルに結びつけ、バイオマーカーの整合性を図ります。
- エンタープライズ再利用：中枢神経系（CNS）血管研究ポートフォリオに向けた、再利用可能なイメージングおよび標識ワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経血管ターゲットの検証における予測的信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：ペリサイトの生存能評価およびイメージングを標準化し、再現性と拡張性を確保する。
- 戦略的価値：早期の生物学的リスク低減を可能にすることで、Go/No-go判断および資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：堅牢な生存能データに基づき、神経血管プログラムのリスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の留意点
- 共焦点イメージングおよび神経血管組織のハンドリングに関する専門知識が必要です。
- 高度な蛍光顕微鏡および解析ソフトウェアへのアクセスが不可欠です。
- ラベリングおよびイメージングプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 異なる中枢神経系（CNS）疾患モデルや種への適応が必要な場合があります。
- 染料の特異性や内皮細胞ラベリングとの重複により、解釈に制限が生じる可能性があります。
バイオファーマに関するよくあるご質問
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:06
Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging
2:05
Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging
3:40
Confocal Imaging of Vital and Non‐Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices
