Name: くも膜下出血後の脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: 学ぶくも膜下出血後の脳周皮細胞のバイタルおよび非バイタルイメージング法。ラット脳切片を用いた蛍光標識プロトコルで、細胞生存率と収縮性を評価し、神経血管損傷のメカニズム解明に貢献します。

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この研究は、中国国家自然科学基金会(81960226,81760223)からの助成金によって支援されました。雲南省自然科学財団(202001AS070045,202301AY070001-011)

実験プロトコルは、昆明医科大学の動物倫理および使用委員会(kmmu20220945)によって承認されました。本研究では、雌雄300〜350gのSprague-Dawley(SD)ラットを使用しました。
1. SAHモデルの誘導
<ol><li>2%イソフルランと100%酸素を使用してラットを麻酔します。イソフルラン(1%〜3%)を連続吸入麻酔に供給することにより、麻酔を維持します。.脳定位固定装置を使用してラットの頭を固定します( 材料表を参照)。</li>
	<li>以下の手順に従って SAH モデルを作成します。<ol><li>マイクロインジェクションニードルを上槽に挿入します。次に、シリンジポンプを使用して、ラットの尾動脈(抗凝固剤なし)から自家血液を上槽槽に注入します( 材料表を参照)。</li>
		<li>上記の座標を使用して、右外側脳室にマイクロ注射針を埋め込みます:ブレグマ、-0.8 mm;横方向、1.4 mm;奥行き、4 mm9。SAH群の場合、0.2 mLのラット尾動脈血を注入します。偽グループの場合、同じ量の等張生理食塩水を投与します(図1A)。</li>
	</ol></li>
</ol>2.脳スライスの準備と安定化
<ol><li>2%イソフルラン吸入を使用してラットに深く麻酔をかけます。.斬首後、脳全体を摘出し、氷冷した人工脳脊髄液(ACSF)に浸します。 注:134 mM NaCl、2.8 mM KCl、29 mM NaHCO3、1.1 mM NaH 2 PO 4、1.5 mM MgSO4、2.5 mM CaCl2、10.11 mM D-グルコースの組成で新たに調製したACSF溶液を使用してください(材料表を参照)。pHを7.3〜7.4に維持します。</li>
	<li>ビブラトーム(材料表参照)を使用して、5%CO2および95%O2で曝気した氷冷ACSF中のSDラットから厚さ200μmの急性脳スライスを調製します(図2)。</li>
	<li>厚さ200μmの急性脳スライスを、ACSFに浸したナイロンメッシュの保存チャンバーに入れます。ACSF溶液を95%O2 および5%CO2で平衡化し、35〜37°Cの温度範囲を維持します。 脳スライスを2時間安定させ、調整する時間を与えます(図3)。</li>
</ol>3. TO-PRO-3による急性脳切片の周皮細胞の標識
注:急性脳切片由来の周皮細胞は、トレーサーTO-PRO-310を用いて蛍光標識した。
<ol><li>蛍光色素TO-PRO-3をACSFに添加し、最終濃度1 μMにします。 急性期の脳スライスを室温で、TO-PRO-3を含むACSFとともに暗所で20分間インキュベートします。 注意: 保護のため、TO-PRO-3を取り扱うときは、ラテックス手袋を着用することを忘れないでください。</li>
	<li>脳スライスを運ぶナイロンメッシュストレーナーをローディングチャンバーから6ウェルプレートリンスチャンバーに移します( 材料表を参照)。脳スライスをすすぎチャンバーに10分間留置します(図4D)。 注:このすすぎステップは、染色プロセスを終了し、バックグラウンド標識を減らし、非特異的染色を防ぎます。</li>
	<li>5% CO 2 と 95% O2 の混合物で平衡化した ACSF 溶液を使用して、調製物を合計 15 分間すすぎます。このすすぎステップにより、色素の取り込みが停止され、バックグラウンド標識が最小限に抑えられます(図4C)。</li>
</ol>4. 急性脳切片における脳微小循環の非生命周皮細胞の染色
<ol><li>TO-PRO-3をプレロードした脳スライスを、イソレクチンB4をAlexa Fluor 488(FITC-ISOB4;5 μg/mL、 材料表参照)に結合させた状態で37°Cで暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、脳スライスをACSFで15分間すすぎます(図4E)。</li>
	<li>通常どおり、5%CO2および95%O2でガス化したACSFで脳スライスをインキュベートします。37°Cで両方の溶液に37μMの濃度のヨウ化プロピジウム(PI)を加えます。 これにより、非重要な脳周皮細胞がラベル付けされます。このACSF溶液中で調製物を暗所で60分間インキュベートします(図4F)。</li>
	<li>次に、調製物をACSF溶液で15分間すすぎ、色素の取り込みを停止し、バックグラウンド標識を最小限に抑えます。</li>
</ol>5. 急性期脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞のイメージング
<ol><li>プラスチック製のパスツールピペットを使用して、脳のスライスをガラス底の共焦点皿(材料表を参照)に静かに移します。5%CO2および95%O2で事前に平衡化したACSF溶液を皿に充填します。鉄のメッシュを使用して、ラットの脳スライスを所定の位置に固定します。</li>
	<li>ガラス底の共焦点ディッシュを共焦点顕微鏡のステージに移します。急性脳スライスを皿の底に配置し、共焦点顕微鏡イメージング中に95%O2と5%CO2の混合物で平衡化したACSF溶液で9を灌流します(図5Aおよび図5Ab')。</li>
	<li>大脳皮質微小血管系の壁細胞を40倍の対物レンズで可視化します。互換性のあるソフトウェアを使用して画像スタックをキャプチャします( 材料表を参照)。IB4(励起/発光 460 nm/520 nm)、PI(励起/発光 545 nm/595 nm)、TO-PRO-3(励起/発光 606 nm/666 nm)に適したフィルターを使用します(図5D)。 注:40× DIC N1対物レンズ、3×12ビット:512×512ピクセル(0.22 × 0.22 mm)、キャリブレーション:0.42 μm / px。</li>
	<li>脳微小血管系と周皮細胞を、そのネットワークと形態に基づいて同定します。各脳スライス上の脳微小血管系ネットワークを含む特定の領域を特定し、画像をキャプチャします。</li>
	<li>その後のキャプチャで一貫性を確保するために、イメージング位置を注意深くメモします(図5B、C)。さらなる処理と分析には、画像解析ソフトウェア(ImageJ)と写真編集ソフトウェア( 材料表を参照)を使用します。</li>
</ol>

くも膜下出血後の脳周皮細胞収縮性の可視化

<ol><li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+properties+of+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li>
<li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li>
<li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+pericyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li>
<li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li>
<li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+%CE%B12+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li>
<li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li>
<li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%3A+The+Journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222(2021).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li>
<li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propidium+iodide+staining%3A+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Micron+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li>
<li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels%3A+An+electron+microscopic+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。

重要な脳周皮細胞、非重要な脳周皮細胞、および脳スライスの微小血管系を視覚化するための高解像度共焦点イメージング技術を開発しました。急性ラットの脳切片では、このプロセスでは、TO-PRO-311による周皮細胞の最初の標識、続いてIB412による微小血管内皮細胞の標識が伴います。その後、PIを用いて死亡した周皮細胞の同定を行います。このプロトコールは、簡単で再現性が高く、機能研究に非常に適用できます。
神経系内の脳周皮細胞を特異的に追跡するために、遠赤色蛍光色素TO-PRO-3が用いられます。TO-PRO-3は、主に固定組織の核を染色するが13、生理食塩水に適用した場合、ex vivoで生体内の生きた周皮細胞に選択的に取り込まれる14。以前の研究では、TO-PRO-3を使用したマウスの脳周皮細胞の明確な同定が確認されています15。この蛍光色素は、重要...

脳周皮細胞は、細い隆起と突出した細胞体によって区別され、微小循環を取り囲んでいます1,2。脳血流増強は主に毛細血管拡張によって引き起こされるが、細い動脈は拡張速度が遅い3。ペリサイトの収縮性は、毛細血管径とペリサイトの形態に影響を与え、血管動態に影響を与えます4。脳周皮細胞の収縮は毛細血管収縮につながり、病理学的シナリオでは、過度の収縮が赤血球の流れを妨げる可能性があります5。座骨髄から放出されるノルエピネフリンを含むさまざまな要因が、毛細血管内の脳周皮細胞の収縮を誘発する可能性があります6。ペリサイトは、脳血流の調節に関与し、20-HETE合成を示し、高酸素症の際に酸素センサーとして機能します7。酸化的・硝化的ストレスによる脳周皮細胞の収縮は毛細血管に悪影響を及ぼす5.脳周皮細胞の収縮に関するin vivoおよびex vivoの両方の研究にもかかわらず8、脳スライス内の生存可能および非生存可能な脳周皮細胞のイメージングに関する限られた知識が残っています。
重要なことに、脳周皮細胞の組織固定後のイメージングは、それらの活力とその後の収縮性評価を損ないます。さらに、神経疾患(くも膜下出血など-SAH)などのシナリオでは、脳周皮細胞のトランスジェニック標識は、生存可能な周皮細胞と生存不可能な周皮細胞を区別できないことが、予備的なSAH誘発性脳周皮細胞死研究によって確認されています9。 
これらの課題を克服するために、TO-PRO-3を使用して生きた周皮細胞を標識し、死亡したペリサイトはヨウ化プロピジウム(PI)で染色しました。高解像度の共焦点イメージング技術を使用して、イメージング中にスライス活性を維持しながら、脳スライス内の生存可能な脳周皮細胞と生存不可能な脳周皮細胞を視覚化しました。本稿は、SAH後の脳微小循環に対する脳周皮細胞の影響を調査するための貴重なツールとして役立つ、脳スライス中の生存可能および非生存の脳周皮細胞をイメージングするための再現性のある方法を提示することを目的としています。

<table><tbody><tr><td>6ウェルプレート</td><td>ABC 生化学</td><td>ABC703006</td><td>RT</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Illustrator CS6 16.0.0</td><td>RT</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>MIAOJIE</td><td>225 mm x 273 mm</td><td>RT</td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>RT</td></tr><tr><td>共焦点イメージングソフトウェア</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements 4.10.00</td><td>RT</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>N-SIM/C2si</td><td>RT</td></tr><tr><td>ガスタンク (5% CO2, 95% O2)</td><td>PENGYIDA</td><td>40L</td><td>RT</td></tr><tr><td>ガラス底共焦点皿</td><td>Beyotime</td><td>FCFC020-10pcs</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glue</td><td>EVOBOND</td><td>KH-502</td><td>RT</td></tr><tr><td>製氷機</td><td>XUEKE</td><td>IMS-20</td><td>RT</td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>国立衛生研究所</td><td>画像 J</td><td>RT</td></tr><tr><td>吸入麻酔システム</td><td>SCIENCE</td><td>QAF700</td><td>RT</td></tr><tr><td>イソレクチン B 4-フィット</td>シ<td>グマ</td><td>L2895&ndash;2MG</td><td>ストアアリコート&ndash;20度;C</td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>7447&ndash;40&ndash;7</td><td>RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>RT</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647&ndash;14&ndash;5</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10049&ndash;21&ndash;5</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>RT</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>NESTバイオテクノロジー</td><td>318314</td><td>RT</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Scientific Industries Inc</td>モデル<td>203</td><td>RT</td></tr><tr><td>プロピジウム(ヨウ化物)</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-D0815/CS-7538</td><td>アリコートを&ndashで保存します。20度;C</td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>SCIENCE</td><td>QA</td><td>RT</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Harvard PUMP</td><td>11 ELITE Nanomite</td><td>RT</td></tr><tr><td>サーモスタットウォーターバス</td><td>OLABO</td><td>HH-2</td><td>RT</td></tr><tr><td>振動ミクロトーム</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

くも膜下出血後の脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞のイメージング

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

周皮細胞は、脳の微小循環内に位置する重要な壁細胞であり、収縮性の調整を介して脳の血流を積極的に調節する上で極めて重要です。従来、それらの収縮性は、特定の状況下での形態学的変化と近くの毛細血管直径の変化を観察することによって測定されていました。しかし、組織固定後の活力の評価と、それに続く画像化された脳周皮細胞の周皮細胞の収縮性が損なわれます。同様に、脳周皮細胞の遺伝的標識は、特にくも膜下出血(SAH)などの神経学的状態において、生存可能な周皮細胞と生存不可能な周皮細胞を区別するのに不十分であり、予備調査で脳周皮細胞の死が検証されています。これらの制約を克服するために信頼性の高いプロトコルが考案され、脳切片の機能的および非機能的な脳周皮細胞の両方の蛍光タグ付けが可能になりました。この標識法により、高解像度の共焦点顕微鏡による可視化が可能になり、同時に脳スライスの微小血管系をマーキングすることができます。この革新的なプロトコルは、脳周皮細胞の収縮性、毛細血管径への影響、および周皮皮構造を評価する手段を提供します。SAHの文脈の中で脳周皮細胞の収縮性を調べることで、脳微小循環に対するその影響についての洞察に満ちた理解が得られます。

通常の生理学的条件下では、脳周皮細胞は一般に細胞死を経験しません。 図6 はこの現象を示しており、黄色は重要な脳周皮細胞の存在を示しています。脳周皮細胞はPIによる染色を示さず、生存率を示しています。細胞死後も周皮細胞が微小血管系に付着したままであるかどうかをさらに調べるために、SAHラットモデルで方法を採用し、その後のイメージングを実施しました。
SAH後の脳スライス中の重要な脳周皮細胞と非重要な脳周皮細胞の両方をイメージングする方法が開発されています。 図7に示すように、重要な脳周皮細胞(青い矢印)は微小血管系内にあり、非重要な脳周皮細胞は白い矢印で表されています。この同時可視化により、脳スライス内の重要な脳周皮細胞と非重要な脳周皮細胞の両方を同定することができます。さらに、PI標識された非重要な脳周皮細胞が微小血管系全体に付着したままであることが観察されました。
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-to...

予備調査では、くも膜下出血(SAH)が脳周皮細胞の死にを引き起こすことが確認されています。SAH後の周皮細胞の収縮性を評価するには、生存可能な脳周皮細胞と生存不可能な脳周皮細胞を区別する必要があります。そこで、高分解能共焦点顕微鏡を用いた観察を容易にするために、脳切片で生存可能な脳周皮細胞と非生存脳周皮細胞を同時に標識する手順が開発されました。

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

私たちの研究では、周皮細胞の死亡が有意に増加していることが示されました。したがって、SAH後の病気の馬から開始すると、低生命力寄生虫の数とSAH後の経過時間との間に正の相関関係が示されました。SAHと寄生虫分離技術に従った脳スライス中の重要な脳寄生虫と非重要な脳寄生虫のイメージングは、私の分野の研究を前進させました。現在、寄生虫の死骸と内皮細胞の死骸を完全に区別することは非常に困難です。私たちの研究では、SAH後の寄生虫の収縮依存性アポトーシスを発見しました。私たちは、脳切片の機能的および非機能的な脳寄生虫の両方を同時に蛍光標識することを可能にする、非常に信頼性の高いプロトコルを開発しました。

imaging-vital-non-vital-brain-pericytes-brain-slices-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

血管周囲腔(PVS)は、体液のドレナージに関与する脳血管の周りの体液で満たされた空間です。小血管脳卒中中のPVSの変化を調べるには、患者の脳の大脳基底核領域の磁気共鳴画像法(MRI)を実施します。イメージングプロトコルには、T2強調高速スピンエコーおよび流体減衰反転回復(FLAIR)シーケンスが含まれます。T2強調イメージングは、脳脊髄液(CSF)で満たされたPVSと周囲の組織との間のコントラストを強化します。FLAIRはCSFシグナルを抑制し、PVSと古いラクナ梗塞の鑑別を可能にします。高解像度イメージングのための適切なイメージングパラメータを確保します。PVS を円形、楕円形、または線形構造として識別し、T2 強調画像上の CSF...

小血管脳卒中におけるヒト脳の血管周囲空間の磁気共鳴画像法

脳血流モニタリングは虚血性脳梗塞モデルの精度を向上することが実証されている。技術的な問題は、多くの場合、脳血管研究のためのこの必要不可欠なツールの使用を制限します。このビデオでは、最適化されたシステムは、ラットにおいて腔内中大脳動脈閉塞時の単一またはマルチサイトの血行動態モニタリングを得ることが示されている。...

腔内中大脳動脈閉塞のラット脳卒中モデルにおける脳血流モニタリングのための最適化されたシステム

ウィリス穿孔の管腔内サークルによるくも膜下出血の標準化されたマウスモデルが記載されている。血管穿孔やくも膜下出血は頭蓋内圧監視によって監視されています。さらに、種々の重要なパラメータが記録され、生理学的条件を維持するように制御される。...

くも膜下出血のマウスモデル

ウサギの実験的な頭蓋内圧制御血液シャントくも膜下出血(SAH)モデルは、標準的な手順を組み合わせたものです -...

くも膜下出血の急性および後期後遺症の研究のためのウサギの血液シャントモデル：技術的側面

この記事の目標は、マイクロ コンピューター断層撮影で脳血管攣縮を定量化する使用ことができますすべての船セグメントのボリュームの決定後、マウスの脳血管の木の 3...

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

このプロトコルは、げっ歯類の脳サンプルの同じセット上の虚血性脳損傷の3つの最も重要なパラメータを測定する新しい技術を記述する。1つの脳サンプルのみを使用することは、倫理的および経済的コストの面で非常に有利である。...

げっ歯類の脳サンプルの単一のセットで脳卒中後脳浮腫、梗塞ゾーンおよび血液脳関門破壊を測定する

我々は、このプロトコルにおいて、システルナマグナへの自家全血の二重注入による標準化されたくも膜下出血(SAH)マウスモデルを説明した。二重注入手順の高度な標準化は、死亡率に関する相対的な安全性を有するSAHの中急性モデルを表す。...

くも膜下出血のモデルとしての水槽マグナへの血液の二重直接注射

ここでは、血管内フィラメント穿孔によって誘導された標準化されたSAHマウスモデルを、手術後24時間で磁気共鳴画像法(MRI)と組み合わせて、正しい出血部位を確保し、他の関連する頭蓋内病変を排除する。...

くも膜下出血の血管内穿孔モデルと磁気共鳴画像法(MRI)の組み合わせ

この研究は、虚血性脳卒中の非侵襲的イメージングのためのマルチモーダル超音波ベースのイメージングプラットフォームの使用を示しています。このシステムは、光音響イメージングによる血液酸素化の定量化と、音響血管造影による脳内の灌流障害の定量化を可能にします。...

虚血性脳卒中の非侵襲的全脳イメージングのための統合光音響、超音波、および血管造影断層撮影(PAUSAT)

ここでは、半厚い脳スライスの画像蛍光標識細胞に迅速かつ簡単な方法を説明します。...

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

学ぶくも膜下出血後の脳周皮細胞のバイタルおよび非バイタルイメージング法。ラット脳切片を用いた蛍光標識プロトコルで、細胞生存率と収縮性を評価し、神経血管損傷のメカニズム解明に貢献します。

くも膜下出血後の脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞のイメージング

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