Name: トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぼう、ウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製方法。Transwellモノレイヤーによる免疫細胞共培養と上皮バリア機能評価を用いて、組織病原体相互作用を解析する革新的なモデルです。

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私たちは、ミッドウェスタン大学の細胞分子コア施設の使用を認めます。

3Dウシ回腸エンテロイド培養からの2D単分子膜の確立

<ol><li>Gerdts, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li>
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<li>Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+use+of+animal+models+to+advance+scientific+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Innovative use of animal models to advance scientific research.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).</li>
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<li>Ribitsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering%3A+To+do+or+not+to+do%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972(2020).</li>
<li>Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+model+systems+and+tools+for+basic+and+translational+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology.</a> Genome Medicine. 10 (1), 73(2018).</li>
<li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models%3A+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li>
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<li>Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+bovine+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the bovine immune response.</a> Infection and Immunity. 7 (6), 981-991 (1973).</li>
<li>Potter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., Öhman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immune+system+of+the+gastrointestinal+tract%3A+maintaining+balance+between+the+good+and+the+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).</li>
<li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+Study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).</li>
<li>Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D-+and+3D-based+intestinal+stem+cell+cultures+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine.</a> Cells. 7 (12), 225(2018).</li>
<li>Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+-+New+models+for+host-helminth+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Organoids - New models for host-helminth interactions.</a> Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).</li>
<li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 43(2021).</li>
<li>Hamilton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vitro+enteroids+derived+from+bovine+small+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts.</a> Veterinary Research. 49 (1), 54(2018).</li>
<li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).</li>
<li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+three-dimensional+%283D%29+expansion+of+bovine+intestinal+organoids%3A+An+in+vitro+model+as+a+potential+alternative+to+an+in+vivo+system%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2115(2021).</li>
<li>Töpfer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+colon+organoids%3A+From+3D+bioprinting+to+cryopreserved+multi-well+screening+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms.</a> Toxicology in Vitro. 61, 104606(2019).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li>
<li>Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical%2C+biomolecular+and+biochemical+characterization+of+bovine+epithelial+intestinal+primocultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures.</a> BMC Cell Biology. 6, 42(2005).</li>
<li>Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-vitro+model+for+studying+the+interaction+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+other+enteropathogens+with+bovine+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).</li>
<li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15(2022).</li>
<li>Barrila, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+host-pathogen+interactions+in+the+context+of+the+microenvironment%3A+Three-dimensional+cell+culture+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).</li>
<li>Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cattle+breed+and+basal+diet+on+digestibility%2C+rumen+bacterial+communities%2C+and+eating+and+rumination+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity.</a> Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114(2020).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroid+monolayers+reveal+an+autonomous+WNT+and+BMP+circuit+controlling+intestinal+epithelial+growth+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization.</a> Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).</li>
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著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。

ここで紹介するプロトコルは、腸の生理学と腸疾患を調査するための生理学的に関連するモデルを説明しています。いくつかの研究グループは、2D単層16、19、20、21、22、23、24を含むウシエントロイド培養の生成について報告しています。単層の生成は技術的にそれほど難しいものではありませんが、成功する培養を一貫して発展させるためには、数分のステップが重要です。そのため、公表された文献で簡潔に説明されている方法を用いた2D単分子膜の再現性は、オルガノイド分野の初心者の研究者にとって困難な場合があります。本明細書に記載のプロトコールは、これらのプロトコールおよび他の種で公表されたプロトコールから採用されたものであり、再現性の高いトランズウェルインサート上の単分子膜生成のステップバイステップガイドを提供する。
本明細書で概説するプロトコールは、実験デザインまたは試薬の入手可能性の特定の目標に適合するように容易に変更することができる。実際、このプロトコルに従えば、他の出版物24に記載されているように、より低い細胞密度(例えば、2.5 x 104)で、またはFBSの非存在下で単層を播種することによって、成功した培養を達成することができる。ただし、これらのパラメータを変更すると、コンフルエント単分子膜を確立するために培養を増やす必要がある場合があります。そのため、免疫細胞との共培養など、研究デザインに不可欠な他の要因によって実験の特定の時間経過が決まる場合は、必要に応じて播種密度を変更することができます。3Dエンテロイドおよび2D単層を生成するためにこのプロトコルで使用されているものの代わりに、他の基底膜製剤を代用することができますが、これらには、最適な基底膜と媒体の比率を決定するためにいくつかの最適化が必要です。
上記の方法論におけるトランズウェルインサートの適用は、従来のプラスチック製品や3Dエンテロイド培養での単層成長よりも多くの利点があります。標準的な組織培養プレートと比較して、単層培養にトランズウェルを使用すると、腸陰窩に似た方法で細胞の分化と組織化が促進されます14,25。腸管上皮バリアは、毒素や微生物の体内への移動を防ぐと同時に、栄養素の吸収を促進するために不可欠です。そのため、腸のバリア完全性が健康な状態でどのように機能し、腸の障害中または化合物に反応して変化するかを理解することが重要です。3Dエンテロイド培養とは異なり、本明細書14,25で実証されているように、トランズウェル上の単層を結合し、TEERを測定すると、腸管バリアの完全性の客観的な評価が可能です。トランズウェル上に2D単分子膜を生成することで、免疫細胞や間質細胞などの適切な細胞タイプとの二重培養も可能になります。これにより、腸管細胞と組織微小環境の細胞との間の非常に重要なクロストークを特徴付けることができますが、これは3D培養では達成できません。単分子膜の頂端表面の曝露は、病原体や化合物への実験的曝露や管腔生成物の収集を可能にするだけでなく、腸内細菌叢や分子吸収または輸送生理学の調査など、腸の生理学や疾患の他の側面の研究も可能にします13。頂端と基底の腸表面を独立して制御できることは、3D腸内モデルに対する明確な利点です。
いくつかの試行錯誤を通じて、プロトコルの成功に貢献した重要なステップを特定しました。全腸組織サンプルは一晩冷蔵して翌日処理することができますが、組織解離と陰窩断片の分離ステップは、単離された陰窩画分の崩壊を防ぐために迅速に実行する必要があります。PBS洗浄が完了したら、洗浄培地でクリプトを遠心分離することで、ステップ2.3.10で詳述されているように、クリプトの故障を防ぐことができます。エンテロイドを継代したり、単層形成のために採取したりする場合は、エンテロイドをBMEドームから分離することが不可欠です。洗浄培地は、BMEの溶解を助けるために氷のように冷たくなければなりません。対照的に、予め温めたTrypLEを使用し、細胞懸濁液を2回ろ過することで、単層生成に必要な単一細胞を形成することができます。最後に、プレートを8の形に手動で操作すると、トランズウェルインサート上に単一セルを均一に分散させることができます。
このプロトコルの重要な制限は、2D単層が成熟したホルスタイン去勢牛(>2歳)から生成された腸内ストックから製造されたことです。子牛の成熟した消化管は、最適な結果を得るために、説明されているプロトコルにわずかな変更を必要とする場合があります。.牛の品種の腸生理機能における品種固有の違いは、文献26に記載されている。これらの違いがエンテロイドとその後の単層生成に影響を与えるかどうかは不明ですが、どのような違いがあったとしても、プロトコルにわずかな変更しかもたらさないと思われます。さらに、2D 培養モデルには固有の欠点がいくつかあります。3Dエンテロイドモデルと比較して、2D培養は腸組織構造と細胞の多様性のいくつかの側面を欠いている可能性があり、2D培養の伝播に関連する制限と課題を生み出す可能性があります13。それでも、研究は、いくつかの単層が予想される陰窩組織を模倣できることを示しており27、これらの制限のいくつかは、気液界面を持つ2D培養を確立することによって克服される可能性さえあります。それにもかかわらず、このモデルの限界を十分に考慮して、その適用が尋ねられている実験的問題に適しているかどうかを判断する必要があります。
このプロトコルはtranswellの挿入物の単層を形作るために牛のような回腸から得られるenteroidsを使用して牛のような胃腸管を模倣する最大限に活用された培養システムを記述する。このハイスループット培養システムは、感染症研究から創薬、再生医療まで幅広い用途があり、動物と人間の健康に相互に有益な予防・治療戦略の前例のない開発につながる可能性があります。

研究における動物モデルは、疾患の病態生理学と感染中の宿主免疫応答の動態の理解を深める上で重要な役割を果たし、新しい予防および治療戦略の開発をサポートします1,2,3,4。これらのモデルは、動物の研究の発見と進歩を支え、人間の健康研究の進歩の鍵となります。何十年にもわたって、げっ歯類モデルは、ヒト疾患の免疫メカニズムと基礎生物学研究の進歩を支えてきました3,5,6,7。げっ歯類モデルはスクリーニングと初期開発研究において重要ですが、大型動物モデルは、治療効果と安全性試験を含む、早期発見と後期開発研究の両方でヒトの疾患を研究する上でより適切な比較を提供します1,3,4,5。家畜はげっ歯類モデルと比較して、クリプトスポリジウム症、サルモネラ症、結核、呼吸器合胞体ウイルス、ブルセラ症などの一部の疾患のヒト応用において、より効率的な翻訳を行うという明確な利点があります1,7,8。実際、これらの病気やその他の病気は、ヒトといくつかの類似した病気の病因と免疫プロセスを共有する牛で自然に発症し、近親交配集団として、牛は人間の免疫応答に影響を与える遺伝的および環境的不均一性を模倣します5,8,9,10.感染症研究におけるウシモデルの利点は、まず高度な培養システムを採用し、次にin vivo研究を段階的に実施することで最大限に活用できます。非常に複雑なウシ由来の培養システムを最初に使用することで、トランスレーショナル研究や応用研究の成功の可能性を高めながら、生きた動物実験の数を大幅に減らすことができます。培養モデルは、最適な予測妥当性を得るために臓器レベルで疾患プロセスを再現し、天然組織の微小環境を空間的および機能的に保持する必要があります。
粘膜免疫応答は、消化管腸細胞と粘膜表面下に位置する免疫細胞の多様な集団によって形成される高効率のバリアで構成される多面的なシステムである11。この非常に複雑なシステムは、感染時に消化管の恒常性を維持し、腸内病原体に対する免疫防御を開始する上で重要です11。腸細胞と根底にある自然免疫細胞との間のコミュニケーションは、病原性微生物に対する防御免疫応答の発達を開始します。そのため、宿主と腸内病原体の相互作用を最適に調査するためには、複雑さのレベルが比較的高い培養システムが必要であり、腸内生理学と創薬および開発を理解する上で非常に効果的です12,13。オルガノイドは、起源組織の構造と機能に似た堅牢な培養システムです14,15。これらのモデルの多細胞性は、多様な細胞集団の役割と、腸管の健康と疾患に関与する細胞相互作用の研究を可能にします12,14。しかし、ヒト由来のオルガノイドモデルは、ヒト腸上皮細胞の十分な量と一貫した品質を得ることが困難であり、培養における細胞生存率が限られているため、現在のところ限界があります。不死化細胞株は、これらのモデルで相同培養を一貫して高収量にするために使用できます。しかし、形質転換細胞は本質的に、形質転換されていない上皮細胞の多様性と機能的複雑さを欠いています16,17。消化器疾患や生理学を調査するためのモデルとしてウシ組織由来の培養物を使用する利点には、健康なドナーから組織サンプルを一貫して入手することが容易であること、細胞生存率の向上、および不死化されていない組織でのみ達成可能な細胞の多様性の向上が含まれます。腸管オルガノイドの比較組織トランスクリプトミクスと特性評価により、ヒトとウシの間で保存されたオルソロゴス遺伝子と細胞電位の類似性が明らかになりました18。したがって、ウシオルガノイド由来の培養系は、ヒトの腸疾患の調査に有利であり、その結果はヒトの医学に容易に変換できる可能性があります。 
本明細書に記載のプロトコルは、ウシ腸内細菌由来の2D初代細胞培養システムを用いて、腸内病原体または化合物および腸生理学に対する宿主の応答を評価するための効果的なプラットフォームを詳述する。3Dオルガノイドとは異なり、トランズウェルインサートで生成された2D培養システムは、腸細胞と免疫細胞または間質細胞の二重培養を可能にし、組織レベルのダイナミクスの研究を可能にします。生物医学研究、医薬品開発、有効性試験への応用により、この生理学的に適切なモデルは、牛と人間の健康と進歩の両方に利益をもたらすことができます。

<table><tbody><tr><td>0.2 mLピペットチップ&nbsp;</td><td>ミッドサイ</td><td>PR-200RK-S</td><td></td></tr><tr><td>1 & マイクロ;m PET 24ウェル細胞培養インサート&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353104</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL ピペットチップ&nbsp;</td><td>MidSci</td><td>PR-1250RK-S</td><td></td></tr><tr><td>22 G ニードル</td><td>ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル培養容器&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;mセルストレーナー&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>50 mL遠心分離チューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>サイエン</td>ティフィック 30075307 <td></td></tr><tr><td>5 mL シリンジ</td><td>ベクトン、ディキンソン アンド カンパニー</td><td>309647</td><td></td></tr><tr><td>5 mL チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30119401</td><td></td></tr><tr><td>アンチサイトケラチン -18 (C-04)</td><td>アブカム</td><td>AB668-1001</td><td></td></tr><tr><td>ビタミン A&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12-587-010</td><td></td></tr><tr><td>Belysa ソフトウェア</td><td>Luminex</td><td>40-122</td><td>イムノアッセイ曲線フィッティングソフトウェア&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カスポファンギン</td><td>Selleckchem</td><td>S3073</td><td></td></tr><tr><td>セルリフター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>クロモグラニン-A(E-5)</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td><td>SC-271738</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-540-C</td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>ネプチューンサイエンティフィック</td><td>3471.X</td><td></td></tr><tr><td>カルトレックス アルティマトリックス RGF BME&nbsp;</td><td>R&D Systems</td><td>BME001-05</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT) 溶液</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ F-12 1.1 培地 (L-グルタミンを含む、HEPES なし)</td><td>Cytiva</td><td>SH30271.01</td><td></td></tr><tr><td>E-カドヘリン&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3195</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>MT35070CV</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slide&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-07</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス アレクサフルーア 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス アレクサフルーア 647</td><td>インビトロジェン</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ アレクサフルーア 555&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult オルガノイド 分化培地 (ヒト)</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0214</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult オルガノイド増殖培地 (ヒト)</td><td>StemCell Technologies</td><td>0-6010</td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700&nbsp;</td><td>キーエンス</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299 (ガルニセルチブ)</td><td>Selleckchem</td><td>S2230</td><td></td></tr><tr><td>MAGPIX システム</td><td>Luminex</td><td>Magpix システム</td><td>コンパクトマルチプレックスユニット</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>キーエンス</td><td>BZ-X700&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX ウシサイトカイン/ケモカイン磁気ビーズパネル</td><td>MilliporeSigma</td><td>BCYT1-33K</td><td>ビーズベースのマルチプレックスアッセイ&nbsp;</td></tr><tr><td>Mr.フロスティコンテナ&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>非酵素的細胞解離溶液&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2103</td><td></td></tr><tr><td>NutriFreeze D10凍結保存培地&nbsp;</td><td>生物産業</td><td>05-713-1B</td><td></td></tr><tr><td>軌道振とうプラットフォーム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>88880021</td><td></td></tr><tr><td>Pam3Csk4</td><td>invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム シーリング フィルム</td><td>ドット サイエンティフィック インク</td><td></td><td></td>#HS234526C</tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16% 溶液</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン-FITC&nbsp;</td><td>R&D Systems</td><td>5782/12U</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>プロロングガラス 退色防止</td>剤 <td>Invitrogen</td><td>P36982</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ 抗ヒト リゾザイム (EC3.2.1.17)</td><td>Agilent technologies</td><td>A009902-2</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (FHPI)</td><td>Selleckchem</td><td>S1077</td><td></td></tr><tr><td>振とうウォーターバス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MaxQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>BDH7465-2</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>テクノバ</td><td>S6525</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー染料&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE発現酵素&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr><tr><td>Voltohmmeter&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>ミリセル ERS-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>セレッケム</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

オルガノイド細胞培養システムは、組織で観察される複雑さを再現できるため、宿主と病原体の相互作用の研究、薬効と毒性の評価、および組織のバイオエンジニアリングに役立ちます。ただし、これらのモデルの 3 次元 (3D) 特性のために、説明された理由でこれらのモデルを適用することは制限される場合があります。例えば、消化器疾患の研究に3D腸内膜培養システムを使用することは、腸管腔とその分泌物質にアクセスできないため、困難です。実際、病原体による3Dオルガノイドの刺激には、管腔マイクロインジェクション、3D構造の機械的破壊、または頂端アウトエンテロイドの生成のいずれかが必要です。さらに、これらのオルガノイドは免疫細胞や間質細胞と共培養することができないため、病態生理学的動態に関する詳細な機構解析は限られています。これを回避するために、ウシ初代細胞の2次元(2D)エンテロイド由来単層培養システムを最適化し、他の関連する細胞タイプとの共培養を可能にしました。健康な成牛から分離された回腸陰窩を培養して3Dオルガノイドを生成し、将来の使用のために凍結保存しました。蘇生した3Dエンテロイドを継代して破壊し、単一細胞を作製し、基底膜抽出物でコーティングしたトランズウェル細胞培養インサートに播種し、それによって頂端表面を露出させました。腸管単層極性、細胞分化、およびバリア機能は、免疫蛍光顕微鏡法および経上皮電気抵抗の測定を用いて特徴付けた。単分子膜の頂端表面を刺激すると、頂端区画と基底区画の両方からのサイトカイン分泌によって実証されたように、単分子膜の期待される機能が明らかになりました。今回紹介した2次元エンテロイド由来単層モデルは、宿主と病原体の相互作用や腸管生理学、創薬、再生医療の研究に大きな期待が寄せられています。

2Dエンテロイド由来単分子膜を作製する最初のステップは、組織解離のために採取した腸組織の切片(図1A)を準備することです。これは、付着した脂肪と腸間膜を組織から除去することによって行われ(図1B)、続いて組織を縦方向に切断して内腔表面を露出させ、スライドガラスを使用して穏やかにこすり落とすことによって腸の粘液層を除去できるようにします。次に、採取された腸切片を徐々に小さな組織切片に切断し(図1C)、解離の容易さを高めます。次に、陰窩は、キレートバッファー(図1D、E)とPBSからなる一連の洗浄を使用して、下にある粘膜下組織から解離されます。次に、単離された腸陰窩(図1F)を基底膜マトリックスドーム(図2A)に埋め込み、数日間培養して3Dエンテロイドを生成します。ウシ回腸の10インチの切片から、約900,000の陰窩を分離し、腸内形成に使用することができます。培養でわずか数時間後、メッキされた陰窩は伸び始め、腸圏に発達します(図2B)。2日後、明確に定義された内腔が観察され(図2C)、培養4日目には早くも出芽構造が認められます(図2D)。7日目までに、成熟したエンテロイドが発達しました(図2E)。7日齢の3Dエンテロイドの免疫蛍光染色により、異なる細胞系統の存在が実証されます。エンテロイドの共焦点顕微鏡検査では、DAPI核染色、接着接合部のE-カドヘリンタンパク質、腸内分泌細胞の存在を示すクロモグラニンA(Chr-A)染色、パネート細胞を示すリゾチーム(LYZ)、腸細胞を表すサイトケラチン-18(CK-18)の局在が図 3に示されています。培養で7〜10日後、エンテロイドを継代して、さらなる増殖を可能にし、過密状態を防ぐ必要があります。エンテロイドが通過する最適な時間は、最初の一次陰窩の分離から7〜10日後であると決定され、最終的には培養中のエンテロイドの健康と成長率に依存します。 図2Eに示されているように、所望の腸内形態および生存率を達成するための最適な播種密度は、ドームあたり400クリプトである。エンテロイドは簡単に凍結保存でき、融解したエンテロイド断片は、融解後2回の継代後に完全に回復して実験用になります。特に、凍結保存の前に、一次陰窩培養の少なくとも2つの継代が推奨されます。
2Dエンテロイド由来の単分子膜を作製するために、3Dエンテロイドを回収し、一連のステップを経て、解離溶液(図4A)の存在下で機械的に粉砕して単一細胞にします。次に、これらの単一細胞を、基底膜マトリックス培養培地溶液でプレコートされたトランズウェルインサートに播種することができます。平均して、4つの3Dエンテロイドドームから4つのトランズウェルを播種することができます。したがって、処理される3Dエンテロイドの数は、実験に必要なトランズウェルの数に依存します。単一細胞を1 x 105<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig5large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig6.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig6large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig7.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig7large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/Table%201.xlsx" target="_blank"></a>

エンテロイドは、組織生理学や病態生理学、医薬品開発、再生医療を研究するための新しいモデルとして浮上しています。ここでは、関連する組織細胞タイプとの共培養を可能にするウシ初代細胞2Dエンテロイド由来培養システムについて説明します。このモデルは、消化器研究のモデリングにトランスレーショナルな利点をもたらします。

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

当研究室では、宿主と病原体の相互作用や、感染後に起こる免疫細胞の動態を研究しています。頑健な細胞培養モデルを用いることで、in vivoで組織レベルで起きている複雑な相互作用をより忠実に再現できると期待しています。牛の世代間について記述した文献の中には、プロトコルを簡単に再現するために必要な詳細が欠けているものもあり、経験の浅い研究者による適用は困難です。私たちのモデルの利点は、初心者の研究者でもうまく使用できる非常に詳細なプロトコルを提供することです。トランズウェル単分子膜を作製することで、免疫細胞との共培養が可能になり、生体内の組織様組織を維持しながら、組織病原体の相互作用に関する洞察が明らかになります。この汎用性の高いモデルは、単一細胞モデルを超える複雑さを持つ多数の牛の病気を研究するために価値があります。当研究室では、このモデルを用いて、クリプトスポリジウム感染の感受性に影響を与える免疫因子について調べます。これにより、成牛と子牛の比較が容易になり、免疫細胞微小環境における組織構造が維持されます。この研究で得られた知見は、人間の健康に直接影響する可能性を秘めています。

generation-bovine-primary-enteroid-derived-two-dimensional-monolayer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

本プロトコルでは、腸内窩から直接マウスの一次上皮結腸単層を生成する方法を説明する。透過性フィルター上にコンフルエント単層を生成する実験的アプローチ、傷創傷治癒および生化学的研究のためのコンフルエント単層、免疫蛍光分析のためのまばらでコンフルエントな単層を提供する。...

腸管内窩からのネズミ原発結上皮単層の生成

この研究は、オルガノイドからウシ腸の2D単分子膜を生成するためのプロトコルを提示し、宿主と病原体の相互作用を研究するためのアクセスを改善します。これには、膜の完全性と機能性を評価する方法が含まれており、牛の胃腸生理機能を模倣した in vitro...

小腸および大腸単分子膜界面を用いたウシオルガノイド技術の進歩

この研究では、小腸と大腸に由来するブタオルガノイドの2D単層を生成するためのプロトコルを概説しています。これらの単層の成長は、TEER値の増加によって特徴付けられ、堅牢な上皮の完全性を示します。さらに、これらの単分子膜は、フォルスコリンの適用後のUssingチャンバー実験で生理学的分泌応答を示します。...

天然腸の生理学的特性を反映した二次元ブタ腸管オルガノイド

本研究では、ポータブルRRT -...

野鳥の鳥インフルエンザウイルスの迅速な診断：フィールドのポータブルRRT - PCR及び凍結乾燥試薬の使用

プロトコルは、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）の待ち時間と再活性化ヘルペスを研究するための効率的かつ再現可能なモデルシステムを説明しています。アッセイは、均質な交感神経ニューロンの培養を採用し、RNA干渉と組換えタンパク質の発現を含むさまざまなツールを使用してウイルスニューロンの相互作用の分子解剖を可能にします。...

単純ヘルペスウイルスの待ち時間と再活性化の研究の主ニューロン培養システム

我々は、遺伝的に非ウイルスを用いて導入遺伝子を持つプライマリヒトT細胞を変更する方法を説明します...

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

未成熟樹状細胞は、免疫と耐性のバランスを調整するために、寛容性または成熟性樹状細胞に選択的に分化させることができます。この研究は、未熟な単球由来樹状細胞(moDC)、代謝表現型が異なるin...

代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

このプロトコルは、リツキシマブの2つの重要な機能特性、すなわち標的結合および補体依存性細胞傷害（CDC）誘導のin vitro比較を記載する。この方法は、参照リツキシマブとリツキシマブバイオシミラーとの間での左右比較のために用いられた。これらのアッセイは、バイオシミラーの開発中またはその製造における品質管理として使用することができる。...

治療抗体間の標的結合およびCDC誘導を比較するためのインビトロ法：Biosimilarity Analysisにおける応用

ここを確立する、2 次元の単分子膜に 3 D オルガノイドを転送する人間およびマウス由来 3 次元 (3 D) 胃...

再生の研究のための主な胃上皮単層培養のマウスおよびひと由来

ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)...

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

学ぼう、ウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製方法。Transwellモノレイヤーによる免疫細胞共培養と上皮バリア機能評価を用いて、組織病原体相互作用を解析する革新的なモデルです。

トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製

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