前臨床研究のための結紮誘発性歯周炎マウスモデルの最適化

私たちの研究室では歯周病を調査し、炎症が異なる個人群で歯肉や骨の損傷を引き起こす仕組みを調べています。私たちは、新しい病因や疾患経路を標的にすることで、歯肉炎や歯周炎の抑制を目指しています。簡略結紮誘発性歯周炎マウスモデルは、歯の間に二重結びの単一糸を用い、3Dプリントツール、マウスの歯科ベッド、そして従来のモデルよりも複雑さが少ない結紮ホルダーを利用します。

この方法は麻酔吸入技術を用いており、従来の注射型麻酔モデルでは回復時間が約30分かかるのに対し、マウスの回復は10分未満とより早いです。マウスの歯科ベッドアセンブリを準備するには、すべてのデンタルベッド部品と接着剤を作業台に並べます。次に、接着剤でヘッド安定部品を固定します。

15Cのメス刃柄に番号3の刃を使い、リガチャーホルダーの外側の鋭いエッジを45度の角度で面取りし、ロックや解除時の不快感を軽減します。リガチャーホルダーロックの内部の丸み角は四角い部分をください。3Dプリントの上下の端からフラッシュを取り外し、これらのエッジを45度の面取りで処理します。

軟部組織への外傷を防ぐために、結紮先の先端をそれぞれ45度の角度で切り取ってください。リガチャーホルダーの各先端にはV字型の切り欠きが含まれていることを確認してください。このV字型の切り欠きが見えたら、15Cのメス刃を切り欠きの根元に優しく差し込みます。

次に、刃を慎重に先端の外側に向け、外縁のV字型の切り欠きの基部を細かく整えます。V字型の切り欠きが見えない場合は、15Cのメス刃をリガチャーホルダーの先端の中央に置き、意図的に浅い切り込みでV字型の切り欠きを作ります。リガチャーを溝に通す際は、リガチャーホルダーの前方から見たときに2つの結び目が中心かつ水平であることを確認してください。

デンタルエクスプローラーを使って、優しい力を加えても結び目が滑りずに元の位置に戻るか確認してください。結紮の設置では、麻酔をかけたマウスをマウスの歯床に背中を床につけ、鼻を鼻錐の近くに位置させます。輪ゴムを使ってマウスの頭を安定させ、口を開けます。

右側にリガチャーを置くには、右手にリガチャーホルダー、左手にエクスプローラーを握ります。探検器の先端を口蓋側の第一大臼歯と第二大臼歯の近接部の下に優しく置きます。エクスプローラーチップを使ってまず歯に触れ、その後滑り降りて歯肉に寄りかかり、軟部組織への外傷を防ぎます。

適切な位置に置いたら、エクスプローラーハンドルを水平の角度で休めます。リガチャーの位置を正しく使うようにエクスプローラーチップを使いましょう。探検船を近接接触エリアに掛け、頭部を反動的な力から安定させろ。

結紮ホルダーを使って頬を引っ込め、結紮を第一大臼歯と第二大臼歯の隣接部の上に位置させます。次に、リガチャーホルダーのハンドルを最大45度回転させ、優しく揺らしながらスライドさせながら、リガチャーを接触部に押し込みます。細い針の鉗子を使って、右側の結び目に付いている余分な糸を留めます。

糸を歯の左側に引っ張り、ハサミを糸の中から結び目から約1.5ミリの位置に滑らせてから切ります。マイクロCT解析の場合は、ソフトウェアを開き「ファイル」をクリックし、「画像をインポート」をクリックします。ポップアップメニューで「ブラウズ」をクリックします。

DICOMファイルがあるフォルダに行き、最初のファイルを選択します。「Examine」をクリックすると、同じスキャンサンプルのフォルダ内の他のファイルを見つけて選択できます。そして、OKをクリックします。画像の読み込みが始まったら、「Visualize」と「Isosurface」をクリックしてください。

画像の閾値を5,000に、表面品質率パーセントを55に変更してください。「画像スムージングを有効にする」と「現在のROIでクリップサーフェスを有効にする」と表示されたボックスにチェックを入れ、「更新」をクリックしてください。レベルプロパティを調整するには、下部のウィンドウ/レベルを右クリックし、「ウィンドウ/レベルプロパティの編集」をクリックしてください。

骨密度の値を2,000に設定し、すべての測定で一定に保ちます。飛行機を操作するには、IJKが3つの異なる飛行機を表示・隠すキーボードショートカットを使います。右クリックしてカーソルを動かしてズームイン・ズームアウトします。

Shiftキーを押して左クリックでパンします。次に、スライスをクリックして平面を移動・回転させます。次に、平面の中心をクリックして前方または後方に動かします。

あるいは、カーソルを目的の平面の中央に置き、上下矢印キーを使って平面を1スライスずつ移動させる方法もあります。平面の端をクリックすると、その辺に平行な線を中心で回転します。平面の角をクリックすると、その平面の周りを回転します。

次に、画面上部の青色で表示されているZスライスを配置し、3本の歯の表面が同時に見えるかできるだけ近づくようにします。次に、同じZスライス面をスクロールして、第一大臼歯と第二大臼歯の根が見えるようにし、周囲の解剖学や管がはっきりと見えるようにします。各根管の中心部を通して、x軸を第1臼歯と第2臼歯の頬根に合わせます。

あるいは、第一大臼歯の頬根と第二大臼歯の遠頬根を合わせる方法もあります。次に、Xスライスの向きをYスライスのアライメントの基準として用います。YスライスをXスライスパネルの第一大臼歯の根部に沿って垂直に並べます。

平面を回転させて根を垂直に向き、青い線が根の中央を横切っているのがわかります。Yスライスパネルでは、セメント-エナメル質接合部(CEJ)から歯槽骨稜(ABC)までの距離を測るために、カーソルを溝の最も深い点に置き、1を押してください。次に、カーソルをABCの近い点に置き、2を押してください。

青い矢印は最初の点を示し、2番目の点は緑の矢印で示されます。測定点を示す矢印がすぐに表示されない場合は、矢印を希望の領域にカーソルし、キーボードの数字キーを押してください。CEJの特定が難しい場合は、上下矢印キーを使って隣接するスライスをスクロールして位置を確認してください。

ABCの最も近い点を特定するのが難しい場合は、複数の点を測定して一貫した測定を確保しましょう。プロトコル論文の成功にもかかわらず、新しい研究者たちは3Dプリントツール、マウスの歯科ベッド、リガチャーホルダーの組み立てと利用に依然として困難を感じています。これに対応するため、研究者が組み立てや3Dプリントツールの使い方を段階的に解説し、実験室で使えるようにする動画を作成しました。

私たちの研究チームは、臨床研究と簡略結紮誘発性歯周炎モデルを活用し、インフラマソームと呼ばれるタンパク質群が炎症や歯周炎の発症を止めるためにどのように活用できるかを明らかにしました。