Name: マウス一次水晶体上皮細胞培養の最適化:トリプシン処理の包括的ガイド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 3 min 47 s
Description: 学ぶマウス一次水晶体上皮細胞のトリプシン処理による培養法。抗酸化酵素の治療標的としての可能性を探索し、白内障や後嚢混濁の予防・治療に貢献する再現性の高いプロトコルを提供します。

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この作業は、NEI R21EY033941 (to Hongli Wu) の支援を受けました。国防総省W81XWH2010896(Hongli Wuへ);R15GM123463-02 (へ Kayla Green and Hongli Wu)

すべての動物実験は、Association for Research in Vision and Ophthalmology(眼科および眼科研究における動物の使用に関するガイドライン)に従って実施されました。手続き上の承認は、ノーステキサス大学健康科学センターの動物ケアおよび使用委員会(プロトコル番号:IACUC-2022-0008)によって付与されました。これらの研究では、通常2週齢未満の若いC57BL/6Jマウスを使用しました。
1. 培地の調製と水晶体解剖
<ol><li>450 mLのDMEMに50 mLのウシ胎児血清(FBS)と0.1 mLの50 mg/mLゲンタマイシンを添加して培地を調製します。</li>
	<li>生後2週間未満のC57BL/6Jマウスを人道的に安楽死させる。 注:CO2吸入法を用いて安楽死させた。CO2安楽死システムの最適な流量は、チャンバーまたはケージの容積/分の30%から70%を変位させる必要があります。</li>
	<li>手術用ハサミを使用してまぶたをそっと取り除き、眼窩の反対側に湾曲したピンセットで微妙な圧力をかけ、目を外側に突き出させます。白内障ナイフを使用して角膜を慎重に切開し、湾曲したピンセットを使用して水晶体を慎重に引き抜き、水晶体またはそのカプセルに損傷を与えないようにします。 注意: レンズカプセルの完全性を維持するために、これらの手順を実行するときは注意してください。レンズはデリケートな性質を持っているため、レンズの損傷のリスクを最小限に抑えるために、先端が湾曲した鈍い解剖ツールを使用することが重要です。</li>
	<li>先端が鈍い湾曲したピンセットを使用して、10 μg/mLのゲンタマイシンを含む5 mLの予熱滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)溶液で満たされた60 mmのプラスチック組織培養皿にレンズを移します。</li>
	<li>10 μg/mLのゲンタマイシンを含むDPBS溶液でレンズを静かにすすぎ、潜在的な破片や汚染物質を取り除き、さらなる処理のためにレンズを準備し、無菌培養環境を維持します。</li>
	<li>十分な数の LEC を得るには、24 ウェル培養プレートには 4 枚のレンズをプールし、6 ウェル培養プレートには 6 枚のレンズをプールします。</li>
</ol>2. LECの分離
<ol><li>すすぎプロセスが完了したら、レンズをろ紙の上に置き、乾かします。</li>
	<li>レンズが十分に乾いたら、レンズカプセルの取り外しの準備として、ペトリ皿のカバーに慎重に移します。</li>
	<li>レンズを上向きに回転させ、前眼部が上を向いていることを確認します。ピンセットを使用して前嚢を保持しながら、利き手の嚢嚢ヘキシス鉗子を使用して、嚢に小さな裂け目を作ります。2つのツールを反対方向にそっと引いてカプセルを取り出し、すべてのレンズの解剖が完了するまでDPBSに入れます。 注:不一致を避けるために、研究者は各水晶体上皮カプセルを速やかに解剖し、DPBSに一時的に保存する必要があります。すべての解剖が完了した後にのみ、カプセルは37°Cに維持されたトリプシンにまとめて移され、同期された均一な曝露が保証されます。</li>
	<li>レンズカプセルを慎重に6ウェルプレートに移します。1 mLの0.05%トリプシン溶液を各ウェルに添加し、酵素消化プロセスを開始します。</li>
	<li>トリプシン溶液を静かに攪拌し、均一に浸透するようにします。プレートを細胞培養インキュベーターに入れ、カプセルを37°Cで8〜10分間消化します。 注:このステップは、水晶体カプセル組織の破壊とその後の個々の上皮細胞の放出を容易にします。</li>
	<li>インキュベーション後、消化した水晶体カプセルを解剖ハサミを使用して慎重に細かく刻み、残っている組織塊を分解し、細胞分離を促進します。 注:消化された水晶体カプセルからの効率的な細胞放出を確実にするために、組織ミンチの徹底性が強調されています。</li>
	<li>10% FBSを含む培地0.5 mLを添加し、トリプシンをクエンチします。組織サンプルを遠心分離チューブに移し、1,000 × g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>細胞ペレットを乱すことなく、上清を慎重に除去します。1 mLの培地を使用して細胞を再懸濁し、細胞を24ウェルプレートに播種します。</li>
	<li>培地は2〜3日ごとに交換してください。</li>
</ol>3. LECのサブカルチャー
<ol><li>細胞が合流したら、培地を培養皿から取り出します。1 mLのDPBSで細胞を2回洗浄します。</li>
	<li>200 μLのトリプシン-EDTA溶液を加え、細胞をインキュベーターに5分間入れます。</li>
	<li>インキュベーション後、細胞をインキュベーターから取り出し、顕微鏡で検査して、培養皿から分離して浮遊し始めたことを確認します。</li>
	<li>1 mLの培地を加え、細胞を3〜5回静かにピペットで移し、すべての細胞を剥離します。</li>
	<li>細胞を遠心チューブに移し、1,000 × g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を慎重に除去し、細胞を完全な増殖培地に再懸濁します。</li>
	<li>必要に応じて、血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。</li>
	<li>細胞懸濁液を1:2または1:3の比率で細分化します。</li>
	<li>培養が再び合流したら、前述の手順を繰り返します。 注:LECは高密度培養条件で繁殖します。細胞を過度に希釈すると、細胞の成長を妨げる可能性があるため、避けてください。</li>
</ol>4.保管と出荷
注: 保管に理想的なセル番号は ~1 × 106 です。
<ol><li>細胞を1 mLのDPBSで3回完全に洗浄します。洗浄後、1 mLのトリプシン-EDTA溶液を加え、細胞をインキュベーターに5分間入れます。</li>
	<li>2 mLの完全培養培地を加え、細胞懸濁液を遠心チューブに移し、1,000 × g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を捨て、細胞を90%FBSと10%DMSOからなる凍結培地に再懸濁し、×細胞密度が1〜106 細胞/mLになるようにします。細胞懸濁液をクライオバイアルに移します。</li>
	<li>直ちに細胞を-20°Cの環境に1時間移動させ、続いて-80°Cで一晩泳がせてから、液体窒素中で永久保存します。 注:液体窒素が利用できない場合は、-20°Cで最初の1時間後に-80°Cで保存できます。</li>
	<li>輸送が必要な場合は、クライオバイアル内の細胞をドライアイス入りのパッケージに入れて翌日配送で輸送します。</li>
	<li>細胞を受け取ったら、迅速に回収し、細胞を継代培養に入れます。即時培養が不可能な場合は、細胞を液体窒素に移して長期間保存してください。 注:細胞を輸送する場合は、温度変動による損傷を防ぐために、サンプルがドライアイスに深く埋まっていることを確認してください。</li>
</ol>5. LECのバリデーション
<ol><li>LECをカバーガラスで35 mmの培養皿に播種し、約48時間培養します。</li>
	<li>細胞をPBSで2回洗浄し、-20°Cで10分間、冷たいメタノールで細胞を固定します。</li>
	<li>固定細胞をPBSで3 x 5分間洗浄し、固定細胞をブロッキングバッファーで室温で1時間インキュベートして、非特異的結合を防ぎます。</li>
	<li>ブロッキング後、希釈液バッファー中で1:50の比率で個別に希釈した一次抗体(αA-クリスタリン、γ-クリスタリン、およびPROX1抗体)とともに、細胞を4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>細胞をPBSで3 x 5分間洗浄し、希釈液バッファー中で1:100に希釈した二次抗体で細胞を1時間インキュベートします。</li>
	<li>細胞をPBSで3 x 5分間洗浄し、5 μg/mLのHoechst 33342 in PBSで室温で10分間細胞を染色して、核を可視化します。</li>
	<li>細胞をPBSで2 x 5分間洗浄して余分な染色液を除去し、核にはDAPIチャネル、αA、γ-クリスタリン、およびPROX1にはFITCチャネルを使用して蛍光顕微鏡を使用して細胞の蛍光画像を撮影します。</li>
</ol>

水晶体上皮細胞の培養と特性評価

<ol><li>Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).</li>
<li>Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallins+and+their+synthesis+in+human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).</li>
<li>Lee, C. M., Afshari, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+state+of+cataract+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The global state of cataract blindness.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).</li>
<li>Khairallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+of+people+blind+or+visually+impaired+by+cataract+worldwide+and+in+world+regions%2C+1990+to+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).</li>
<li>Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+and+the+prevention+of+age-related+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts.</a> Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).</li>
<li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Redox regulation in the lens.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).</li>
<li>Charakidas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+apoptosis+and+cell+proliferation+in+human+age-related+cortical+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract.</a> European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).</li>
<li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+and+glutaredoxin+in+redox+regulation+and+cell+signaling+of+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens.</a> Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973(2022).</li>
<li>Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+proliferation+of+lens+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture.</a> Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+concerning+a+novel+intraocular+lens+for+the+prevention+of+posterior+capsular+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification.</a> Pharmaceutics. 14 (7), 1343(2022).</li>
<li>Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsule+opacification%3A+A+review+of+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Posterior capsule opacification: A review of experimental studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847(2021).</li>
<li>Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsule+opacification%3A+A+review+of+the+aetiopathogenesis%2C+experimental+and+clinical+studies+and+factors+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention.</a> Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+lens+epithelial+cells+suppress+proliferation+and+epithelial-mesenchymal+transition-relevance+for+posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification.</a> Cells. 11 (13), 2001(2022).</li>
<li>Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture--iv.+Some+characteristics+of+the+process%2C+including+possible+in+vitro+models+for+pathogenic+processes+in+cataractogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis.</a> Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).</li>
<li>Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.+%28i%29+effects+of+cell+density%2C+medium+and+embryonic+age+of+initial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture.</a> Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).</li>
<li>Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+human+lens+epithelial+cells+from+senile+cataract+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).</li>
<li>Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+lens+epithelial+cells+from+cataract+patients+-+association+with+possible+risk+factors+for+posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+Ophthalmology+Journal%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification.</a> The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).</li>
<li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).</li>
<li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+proliferative+studies+on+ex+vivo+cultured+human+anterior+lens+epithelial+cells+-+relevance+to+capsular+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).</li>
<li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+establishing+adherent+ex+vivo+explant+cultures+from+human+eye+pathologies+for+use+in+subsequent+calcium+imaging+and+inflammatory+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 232659(2014).</li>
<li>Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+immortalization+of+human+lens+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).</li>
<li>Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+proliferative+cells+exists+in+mouse+lens+epithelium%3A+Implications+for+lens+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).</li>
<li>Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+shock.+Synthesis+of+heat-shock-like+proteins+in+fresh+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).</li>
<li>Haykin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioimage+analysis+of+cell+physiology+of+primary+lens+epithelial+cells+from+diabetic+and+non-diabetic+cataract+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Biotechnological+Equipment%22%5BJournal%5D)">Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients.</a> Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).</li>
<li>Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+embryo+lens+cultures+mimic+differentiation+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens.</a> Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).</li>
<li>Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+culture+of+rat+lens+epithelial+explants+for+studying+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1591(2009).</li>
</ol>

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

この論文で紹介するプロトコールは、一次LECの単離、培養、および継代培養を成功させるための包括的なステップバイステップガイドを提供し、付属のビデオドキュメントを完備しています。詳細なビジュアルガイドと書面による指示により、プロトコルの明確さとアクセス性が向上し、この分野の研究者の間での使用と再現性が促進されます。最終的な目的は、白内障形成とPCO、白内障手術後の一般的な合併症におけるLECの役割を取り巻く知識の拡大に貢献することです。
初代LECをHLE-B3やSRA01/04などの水晶体上皮細胞株と比較すると、研究の文脈においてそれぞれ独自の利点と課題があります。HLE-B3細胞株は、SRA01/04とともに、取り扱いが簡単で耐久性がある一方で、連続的な複製と長期の培養条件により、遺伝的および表現型の変化を示すことが多い細胞株のカテゴリーです。これにより、元のLECの機能と大きな違いが生じ、応答の信憑性が低下する可能性があります。逆に、患者や研究動物の生体組織から直接単離された一次LECは、 in vivoで自然な細胞環境と水晶体の固有の応答をより正確に反映します。抽出と培養の複雑さが増すにもかかわらず、より正確で信頼性の高い結果が得られるため、高い生理学的関連性が要求される研究で好まれることがよくあります。
このプロトコルに従う際には、いくつかの重要なポイントを考慮する必要があります。これらの研究では、通常2週齢未満の若いC57BL/6Jマウスを使用しました。これらの若いマウスから採取したLECは、生後2ヶ月以上のマウスのLECと比較して、より活発な成長を示すことが観察されました。これは、マウスの年齢と細胞増殖の間に負の相関があることを示しています。
マウスの目から水晶体を解剖することはデリケートな作業であり、水晶体とそのカプセルの完全性を維持するために解剖ツールを慎重に使用する必要があります。プロトコルセクション1で概説されている手順により、レンズが最小限の損傷で正常に引き抜かれます。レンズカプセルの健全性と完全性を維持することは困難ですが、損傷は分離されたLECの質と量に影響を与える可能性があるため、その重要性を過小評価することはできません。細胞分裂の大部分は、通常、水晶体の赤道領域近くの発芽領域、つまり培養には容易にアクセスできない領域で発生することは注目に値します。Zetterbergらによると、水晶体上皮の中央部は通常の状況下では最小限の有糸分裂活性を示しますが、トリチウム化チミジン(3H-Tdr)標識を利用した実験により、これらの中央に位置する水晶体上皮細胞が潜在的な幹細胞としてマークされています17,22。幹細胞は、標準的な条件下では増殖速度が低いにもかかわらず、無限の増殖能力を示すなど、明確な特徴を示します。そのため、水晶体上皮の中央部は、発芽帯よりもLECの増殖能をよりよく表している可能性があります。
プロトコルセクション2で詳述されているように、LECの単離は、この実験手順における極めて重要なステップを構成します。水晶体嚢の除去、酵素消化、組織断片化などの統合作用は、個々の上皮細胞をカプセルから分離するために慎重に行われます。このプロセスにおける重要な要素の1つは、トリプシン消化の期間です。消化期間は8〜10分に設定することをお勧めします。この期間を5分未満に短縮すると、細胞分離が不完全になる可能性があります。逆に、この時間枠を過度に延長すると、細胞の生存率が著しく損なわれる可能性があります。トリプシン-EDTAを細胞解離試薬として採用し、20%FBSおよび10 μg/mLのゲンタマイシンを添加したDMEM培地と併用することで、潜在的な汚染リスクを軽減しながら、細胞の放出とその後の増殖を最適化することができます。
抗生物質は、初代LEC培養中の細菌汚染を防ぐために頻繁に使用されます。ただし、抗生物質の選択は慎重に行う必要があります。ペニシリンやストレプトマイシンなどの一般的に使用される抗生物質、および抗真菌剤は、LECの生存率に影響を与える可能性があります。別の方法として、最適なLEC増殖のために、10 μg/mLの濃度のゲンタマイシン溶液を使用することが推奨されます。
さらに、高い細胞密度を維持することも、初代LEC培養を成功させるための重要な要素です。確立された細胞株とは異なり、初代LECは最適な増殖のためにより高い細胞密度を必要とします。これは主に、直接接触またはパラクリンシグナル伝達によって促進される効果的な細胞間コミュニケーションに依存しているためであり、分化状態と機能を維持するのに役立ちます。また、細胞密度が高いと、初代細胞が単離され、in vivoの起源と著しく異なるin vitro環境に置かれたときに経験する状態である「カルチャーショック」の悪影響も軽減されます23。より生体内のような環境を模倣することにより、細胞密度が高いと生存率が向上します。さらに、この密度は、細胞の成長と機能をサポートする成長因子とサイトカインの濃度勾配を確立するのに役立ちます。多くの初代細胞が足場に依存し、増殖のために表面接着を必要とすることを考えると、細胞密度が高いと、接着のための十分な数の隣接する細胞が提供され、健全な成長が促進されます。したがって、細胞密度の調節は、細胞の伝達、生存、および増殖に大きな影響を与えるため、初代細胞の培養において重要な考慮事項です。LECにとって理想的な環境を作るために、24ウェルプレートや6ウェルプレートなどの小さな培養皿を選択することをお勧めします。このプロトコルに従うと、通常、LECは培養後10~14日で合流状態に達します。実験で最も自然な挙動を得るために、LECを少数の継代(理想的にはP0とP6の間)で利用することをお勧めします。7〜10継代を超えると、LECは成長が減少し、下位継代の細胞と同じように実験条件に反応しない可能性があります。
血清濃度は細胞増殖速度に直接関係しています。FBSのレベルが低いと、成長が遅くなる可能性が高く、中心上皮の特徴に似ています。対照的に、FBSレベルが高いほど、増殖帯の状態を模倣します。高齢動物や遺伝子改変動物からLECを単離する必要がある場合など、細胞増殖が遅い場合は、FBSを20%に増やすか、EpiCGS-a(5 mL、 材料表を参照)などの増殖サプリメントを培地に添加することが有益です。この血清とサプリメントの濃縮は、細胞増殖を促進し、上皮細胞の最適な増殖を促進することができます。
保管および出荷プロトコル(プロトコルセクション5)は、生細胞の保存と輸送に関連する課題を考慮しています。凍結培地の選択は、保管および輸送中のLECの生存にとって重要です。70%の完全培地+ 20%のFBS + 10%のDMSOを含むさまざまな凍結培地で実験しました。90%FBS + 10%DMSO;DMSOおよび無血清凍結培地。私たちの実験からの証拠は、10%のDMSOと90%のFBSを含む溶液が細胞生存率の維持において優れた性能を示すことを示唆しています。この特定の製剤を利用して、一次LECを-80°Cで10年以上保存することに成功し、このアプローチの頑健性と保存後の細胞再生を促進する能力を実証しました。
αA-クリスタリンおよびγ-クリスタリンをLECのマーカーとして使用しました。PROX1は、レンズファイバーセルのマーカーとして利用されました。PAX6、FOXE3、E-カドヘリンなどの追加マーカーも、LEC表現型を特徴付けるために用いられることがあります。研究者がEMTの調査に関心がある場合は、αSMAをマーカーとして使用する必要があります。インキュベーション時間と希釈倍率は、実験の特定の要件と、使用するそれぞれの抗体に用意されている推奨事項に従って調整することが不可欠です。
この研究は、一次LECを培養するための堅牢な方法論を提示していますが、その限界を認識することが重要です。最初に単離された細胞は一次LECですが、継代培養、トリプシン化、および蘇生の手順により、その状態が変化します。私たちが設計したプロトコルは、主にマウスレンズをLECのソースとして使用します。ただし、LECは、白内障患者のサンプル、アイバンクの目、または緑内障や糖尿病性網膜症などのさまざまな眼疾患の患者など、他のリソースから培養することもできます17,24。高齢者や特定の眼疾患を持つ人から採取されたLECは、若くて健康な細胞ほど効果的にプロトコルに準拠していない可能性があります。高齢または遺伝子組み換えの個体または動物からLECを培養するには、FBSを20%に増やすか、追加の成長因子を組み込むことで、培地を最適化する必要がある場合があります。さらに、初代胚性ニワトリ水晶体上皮細胞培養で実施されたMenkoらによる以前の研究では、培養2日目以降に自然分化が起こることが実証されました25。したがって、研究者は、特に差別化の研究が主な研究目標である場合、注意を払い、方法論の違いを考慮する必要があります。
初代LECの培養には、様々な方法を利用することができます。例えば、Ibarakiら、Sundelinら、Andjelicらによって開発された方法では、白内障手術中に採取された水晶体嚢の前部を使用して、ペトリ皿上で一次LECを直接培養する16,17,19,20。このアプローチは、自然な細胞間接触と細胞外マトリックスを維持し、PCOなどの疾患に不可欠な高い生理学的関連性を提供します。あるいは、Zelenkaらによって概説されたような水晶体外植法は、天然の組織構造を保持し、より生理学的に関連性のある研究を可能にし、特にLECの最終分化、細胞相互作用、およびレンズ開発プロセスの探索に有益であり、分化中の連続的な細胞および分子イベントの詳細な理解を可能にします26。
対照的に、このプロトコルで記述されているトリプシン化方法は細胞の生存率および拡散の試金、薬剤のスクリーニングおよび細胞シグナリング細道の分析のようなある特定の実験のために有利である均一な播種および精密なセルカウントを簡単にする均一単一細胞懸濁液を作り出す。ただし、この方法は細胞集団が均一であるため、制御された正確な研究が容易になりますが、酵素処理により細胞の挙動が変化し、外植片および直接培養法に見られる生理学的関連性が損なわれる可能性があることを認識することが重要です。上皮細胞の研究を専門とする研究者にとって、この方法は適用性が高く、便利であり、上皮細胞の特徴や挙動に関する信頼できる洞察を提供します。しかし、科学的探究が細胞分化にまで及ぶ人にとっては、外植片技術などの代替方法を検討したり、これらの側面を網羅するように現在の方法を適応および最適化したりすることが不可欠になります。
全体として、このプロトコルは、LECの特定のニーズと要件を慎重に検討して設計されています。解剖から検証までのすべてのステップは、細胞の生存率と機能を維持するために慎重に作成されています。その結果、LECと眼の生理学および病理学におけるLECの役割を研究する研究者にとって貴重なガイドとなる可能性があります。今後の研究では、このプロトコルを適応および修正して、LEC生物学のさまざまな側面を探求し、水晶体関連疾患の理解をさらに進歩させ、白内障およびPCO予防のための新しい治療戦略を開発するためのプラットフォームを提供することができます。

目の水晶体は、入射光を網膜に合わせることにより、視力において重要な役割を果たします。これは、特殊な細胞で構成される透明で無血管構造で構成されており、その中で水晶体上皮細胞(LEC)が重要な役割を担っています。LECは水晶体の前面に位置し、水晶体の透明性を維持し、水分バランスを調節し、水晶体の成長と発達に関与する役割を担っています1,2。LECは、水晶体の前部に位置するユニークなタイプの細胞であり、生涯を通じて水晶体線維を連続的に産生することにより、水晶体の透明度と機能を維持する上で重要な役割を果たします。
白内障は、水晶体の曇りが進行し、光の歪みや散乱を引き起こし、視力の低下につながります3,4。白内障形成の根底にある正確なメカニズムは複雑で多因子的であり、紫外線、酸化損傷、糖化などのさまざまな細胞および分子プロセスが関与しています5,6。LECは白内障の発症に大きく寄与することがわかっており、研究の重要な焦点となっています1,2,7,8,9。
さらに、今日の眼科における最も差し迫った問題の1つは、二次性白内障としても知られる後嚢混濁(PCO)の発生率が比較的高いことです。PCOは白内障手術後も最も一般的な合併症であり、手術後5年以内に成人患者の最大20〜40%、小児の100%が罹患します10。PCOは主に、白内障摘出後に莢膜バッグに残る残留LECによって引き起こされます。これらの細胞は、上皮から間葉への移行(EMT)だけでなく、LECから水晶体線維への分化を含む多面的な病態生理学的形質転換を受け、LEC、線維、筋線維芽細胞の混合物である細胞集団をもたらします11,12,13。形質転換された細胞は増殖し、後部水晶体嚢を横切って移動し、視力障害を引き起こします。培養モデルにおけるLECの挙動と制御メカニズムを理解することは、PCOの予防と管理に関する貴重な洞察を提供することができます。したがって、LECを培養するこのプロトコルは、この一般的な術後合併症を研究し、理解し、最終的に戦うことを目指す眼科研究者にとって重要なツールを提供します。
LEC生物学の複雑さと、白内障形成およびPCOにおけるLECの役割を解明するには、頑健で再現性の高い in vitro 初代細胞培養システムを確立することが不可欠です。初代LEC培養は、LECの機能、シグナル伝達、および分子特性を研究するための制御された環境を研究者に提供します。さらに、細胞プロセスやさまざまな実験条件の影響を調べることができ、水晶体の生理学や病理学に関する貴重な洞察を得ることができます。
以前の研究により、LEC培養技術の理解が深まりました14、15、16、17、18、19、20。これらの研究はさまざまな方法論を採用し、LECの行動と特性に関する重要な発見をもたらしましたが、LECを培養するための包括的でアクセス可能なビデオ録画プロトコルは現在の文献にはありません。この制限は、初心者の研究者が技術を正確に再現する能力を妨げ、実験結果の不整合やばらつきにつながる可能性があります。この研究論文は、ビデオ録画プロトコルを提供することにより、このギャップを埋め、LEC培養の分野で再現性を高め、知識の伝達を促進することができる標準化されたリソースを提供することを目的としています。

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>#25300054</td><td>LECs解離用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 二次抗体&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>#715-545-150</td><td>細胞バリデーション用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-605-003</td><td>セルバリデーション用</td></tr><tr><td>抗体希釈バッファー</td><td>Licor</td><td>#927-60001</td><td>細胞バリデーション用</td></tr><tr><td>Beaver 安全ナイフ</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>#3782235</td><td>レンズ解剖用</td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー</td><td>Licor</td><td>#927-60001</td><td>細胞バリデーション用</td></tr><tr><td>Capsulorhexis 鉗子</td><td>Titan Medical Instruments</td><td>TMF-124</td><td>レンズカプセル分離用</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td>LECs培地用</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td> <td>#D2650</td><td>凍結培地を作るため&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td> <td>#J67802</td><td>レンズ解剖用</td></tr><tr><td>デュモンピンセット</td><td>ロボッツ 手術器具</td><td>RS-4976</td><td>レンズカプセル分離用</td></tr><tr><td>EpiCGS-a (オプション)</td> <td>ScienCell</td><td>4182</td><td>LECs用培養液</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>Aldrich F2442</td><td>LECs用培養液</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン (50&nbsp;mg/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>LECs培地用</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>#62249</td><td>細胞バリデーション用</td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ</td><td>Roboz Surgical Instrument&nbsp;</td><td>RS-5983</td><td>レンズ解剖</td></tr>用<tr><td>マイクロ解剖ピンセット</td><td>Roboz Surgical Instrument&nbsp;</td><td>RS5137&nbsp;</td><td>レンズ解剖用</td></tr><tr><td>PROX1抗体</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー11067-2-AP</td><td>細胞検証用</td></tr><tr><td>Vannasマイクロ解剖スプリングハサミ</td><td>Roboz手術器具</td><td>RS-5608</td><td>レンズカプセル分離</td></tr><tr><td>用&α;A-クリスタリン抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-28306</td><td>細胞検証用&nbsp;</td></tr><tr><td>&gamma;-クリスタリン抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365256</td><td>細胞検証用</td></tr></tbody></table>

マウス一次水晶体上皮細胞培養の最適化:トリプシン処理の包括的ガイド

Optimizing Mouse Primary Lens Epithelial Cell Culture: A Comprehensive Guide to Trypsinization

水晶体上皮細胞(LEC)は、水晶体の恒常性と正常な機能を維持する上で複数の重要な役割を果たします。LECは、レンズの成長、発育、サイズ、透明度を決定します。逆に、機能不全のLECは、白内障の形成と後嚢混濁(PCO)につながる可能性があります。したがって、堅牢な一次LEC培養システムを確立することは、レンズ開発、生化学、白内障治療、PCO予防に従事する研究者にとって重要です。しかし、一次LECの培養は、入手可能性が限られていること、増殖速度が遅いこと、デリケートな性質のため、長い間課題となっていました。 
この研究は、一次LEC培養の包括的なプロトコルを提示することにより、これらのハードルに対処します。このプロトコルには、最適化された培地の調合、水晶体カプセルの正確な単離、トリプシン処理技術、継代培養手順、収穫プロトコル、保管と出荷のガイドラインなどの重要なステップが含まれています。培養プロセス全体を通して、位相差顕微鏡を用いて細胞形態をモニターしました。 
培養LECの真正性を確認するために、免疫蛍光アッセイを実施して、重要なレンズタンパク質、すなわちαAおよびγ-クリスタリンの存在と細胞内分布を検出しました。この詳細なプロトコールは、原発性LECの培養と特性評価のための貴重なリソースを研究者に提供し、水晶体生物学の理解の進歩と水晶体関連疾患の治療戦略の開発を可能にします。

図2<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65912/65912fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65912/65912fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65912/65912fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65912/65912fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65912/65912fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65912/65912fig03large.jpg" target="_blank"></a>

この原稿では、初代水晶体上皮細胞(LEC)を培養するための詳細なビデオプロトコルの概要を説明し、白内障および後嚢混濁(PCO)の再現性を向上させ、研究を支援することを目的としています。レンズの解剖、LECの分離、バリデーションに関するステップバイステップの説明を提供し、特にこの分野の初心者にとって貴重なガイドとなります。

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, ...

私たちの研究目的は、酸化還元修復酵素の機能に特に重点を置き、白内障の根本的な原因を探ることです。私たちの目的は、この酵素が水晶体保護に果たす重要な役割を特定し、白内障の予防と治療の創薬標的としての可能性を確立することです。数あるエキサイティングな技術の中でも、私たちの研究は水晶体上皮細胞を基盤プラットフォームとして用いています。このアプローチは、白内障形成、後嚢混濁の背後にあるメカニズムの解明、および新しい抗白内障薬の発見に不可欠です。今後は、抗酸化酵素と老化がレンズの機能に与える影響を理解することに焦点を当てます。私たちの目標は、水晶体の老化を遅らせ、白内障を予防し、PCOに効果的な介入を提供できる革新的な抗酸化治療を発見することです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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マウスの卵巣脂肪パッドに移植

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微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

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ケラチノサイト生細胞イメージングのための初代培養物の生成

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マウス角膜からの単細胞懸濁液採取プロトコル

最終分化を研究するための準備とラットの水晶体上皮外植片の培養

学ぶマウス一次水晶体上皮細胞のトリプシン処理による培養法。抗酸化酵素の治療標的としての可能性を探索し、白内障や後嚢混濁の予防・治療に貢献する再現性の高いプロトコルを提供します。

マウス一次水晶体上皮細胞培養の最適化:トリプシン処理の包括的ガイド

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