腫瘍スフェロイドモデルにおける抗体依存性細胞傷害性の定量化:創薬への応用

最も効果的ながん標的療法の1つは、抗HER2抗体トラスツズマブなどの抗体に基づくものです。トラスツズマブの抗がん作用には、ナチュラルキラーまたはNK細胞による抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)が含まれます。抗成長因子受容体抗体療法に対するがん細胞の感受性を調節するメカニズムを、特にADCCの観点から理解することは、より効率的な新しい治療法の開発に不可欠である可能性があります。

がん細胞スフェロイドなどの3Dモデルは、さまざまな抗がん療法に対する腫瘍の免疫応答を予測するのに優れていることが証明されました。そこで、NK92ナチュラルキラー細胞株、GFP発現JIMT-1乳がん細胞、トラスツズマブを用いたADCCスフェロイドモデルを構築しました。抗HER2陽性のJIMT-1乳がん細胞を誘導し、スフェロイドと呼ばれる3次元クラスターを形成することで、ADCCアッセイシステムを構築しました。

実験に用いたJIMT-1細胞株は、緑色蛍光タンパク質を安定的に発現します。スフェロイド形成用の96ウェルプレートを準備することから実験を開始します。U字型で撥細胞性のある底部を作るには、96ウェルプレートを0.5%アガロースPBS溶液でコーティングします。

プレートを室温で約30〜45分間インキュベートします。その間、トリプシン処理を行い、細胞播種のためにJIMT-1細胞をカウントします。細胞を2ミリリットルの滅菌PBSで洗浄します。

フラスコに2ミリリットルのトリプシン-EDTAを加え、フラスコをCO2インキュベーターに10分間戻します。インキュベーション後、フラスコをタップして、JIMT-1細胞が剥離したかどうかを確認します。2ミリリットルのJIMT-1培地で消化を停止し、細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに回収します。

Burkerチャンバーでトリパンブルーで細胞をカウントし、細胞数を20, 000細胞/mlに調整します。スフェロイド形成のために、100マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルにピペッティングして、細胞を96ウェルプレートに播種します。CO2インキュベーターで37度の3日間のインキュベーション時間中に細胞を凝集させます。

倒立顕微鏡で回転楕円体のサイズと形状を定期的にチェックしてください。スフェロイド誘導後 3 日目に、96 ウェルハイコンテントスクリーニングプレートを DMSO 中の Pluronic F-127 溶液でコーティングします。コーティングは、JIMT-1 EGFPスフェロイドがガラス表面やプレートに付着するのを防ぐために重要です。

室温で45分間のインキュベーション期間の後、コーティング液を吸引し、DMEM F12無血清培地でウェルを2回洗浄します。スフェロイドを 1 ミリリットルのピペットを使用して、96 ウェルのハイコンテントスクリーニングプレートに 3 回に分けて移します。スニチニブを1ウェルあたり10マイクロリットルの濃度40マイクロモルでウェルに添加し、新鮮なJIMT-1培地をコントロールウェルにピペットで移して容量を上げます。

プレートをCO2インキュベーターで37度で1時間インキュベートします。前処理したスフェロイドのインキュベーションが進行中に、フラスコからNK92細胞を15ミリリットルのチューブに回収します。Burkerチャンバーでトリパンブルーで細胞をカウントし、エフェクターとターゲットの比率が20対1になるように細胞数を調整します。

NK細胞をCellTracker Blueの10マイクロモル溶液で染色し、CO2インキュベーターに37度で1時間入れます。余分な色素を洗浄するには、NK細胞を室温で150RCFで3分間2回遠心分離します。その後、細胞を新しいJIMT-1培地に再懸濁します。

染色したNK細胞を、抗HER2抗体トラスツズマブとともに55マイクロリットル/ウェルでピペッティングすることにより、標的のJIMT-1 EGFPスフェロイドに加えます。トラスツズマブをJIMT-1培地で希釈して、1mlあたり10マイクログラムの濃度にします。110マイクロリットルの新鮮なJIMT-1培地をコントロールウェルに加え、37度のCO2インキュベーターでプレートを24時間インキュベートします。

その結果、ADCCに添加される処理の総量は110マイクロリットルであり、最終的なスニチニブ濃度は20マイクロモル/リットルである。処理後のアポトーシス細胞死を検出および測定するには、スフェロイドをAnnexin V Alexa Fluor 647コンジュゲートでJIMT-1培地中で1時間染色します。実験ステップが終了したら、プレートをハイコンテント分析装置に移します。

プレートは、標的細胞にNK因子を添加してから24時間後に画像化されます。イメージングには、ハイコンテントアナライザーと画像解析ソフトウェアを使用しています。プレートタイプオプションを使用して、プレートのリストからマイクロプレートのタイプを選択します。

96ウェルハイコンテントスクリーニングプレートを使用してください。オートフォーカスと対物レンズのオプションをそれぞれ使用して、0.3 個の開口数を持つ 10 倍対物レンズのプレートで実施するアッセイとして、2 つのピークオートフォーカスを選択します。OptiModeオプションで共焦点モードを選択し、Biningオプションの使用にBinning 2を適用します。

スフェロイドをイメージングする場合は、チャンネル選択オプションを使用して適切なチャンネルを選択します。EGFP輸血されたJIMT-1細胞を検出するには、積分時間200ミリ秒、レーザー出力50%、スタック高さ2マイクロメートル、励起波長488ナノメートル、発光波長500、550ナノメートルのEGFPを選択します。また、アポトーシス細胞を検出するには、100ミリ秒の積分時間、50%のレーザー出力、10マイクロメートルのスタック高さ、640ナノメートルの励起、650、760ナノメートルの発光波長を持つAlexa 647を使用します。

スフェロイド内のNK細胞を可視化するには、積分時間100ミリ秒、レーザー出力50%、スタック高さ2マイクロメートル、励起波長405ナノメートル、発光波長435、418ナノメートルのDAPIチャンネルを選択します。[レイアウトの選択]オプションでは、スフェロイドの細胞が顕微鏡の異なる焦点面上にある傾向があるため、Zスタックを選択します。10マイクロメートルの距離を持つ10個の平面は、回転楕円体領域全体をカバーするのに十分です。

最初の平面と最後の平面の値をそれぞれ 0 マイクロメートルと 90 マイクロメートルに設定します。測定開始前に、スナップショット機能でサンプル画像を撮影し、正しい設定を確認できます。イメージング用のウェルとフィールドの数は、Defined Layoutオプションを使用して設定します。

Fine Texture Regionオプションを使用して、EGFP蛍光細胞またはJIMT-1細胞でスフェロイドを同定し、サイズでフィルターで除外します。Select Population モジュールを使用して、境界線オブジェクトを削除します。アネキシン陽性細胞は末梢スフェロイドに現れるため、アポトーシス環のアネキシン強度を測定します。

Select Region モジュールで、外側の境界線をマイナス 90 に設定します。アネキシン強度値を平均強度として表します。アネキシンV染色で示されているように、NK細胞とトラスツズマブをJIMT-1細胞に添加すると、腫瘍スフェロイドの細胞死が引き起こされました。

アネキシン陽性アポトーシス細胞は、スフェロイドの末梢領域に出現しました。しかし、トラスツズマブの非存在下では、NK細胞は腫瘍細胞のアポトーシスを誘発しませんでした。トラスツズマブの直接効果とADCC媒介性効果を区別するために、この研究ではFC領域結合能力を欠くトラスツズマブ-Fab2をネガティブコントロールとして使用しました。

このモデルではトラスツズマブ-Fab2は効果がなかったため、腫瘍細胞死はADCCを介して媒介される可能性が高い。さらに、スニチニブによる前処理により、スフェロイドのアネキシンV染色が減少し、スニチニブ誘発性ADCC耐性が確認され、NK細胞およびトラスツズマブと共インキュベートされたJIMT-1スフェロイドのアポトーシス細胞死の防止が明らかになりました。このデータにより、ADCCモデルにおけるスニチニブの細胞保護効果が確認され、ADCCベースの免疫療法とスニチニブの併用の可能性について注意が必要です。

要約すると、当社のHCSアッセイは、ADCCブースティング化合物の同定に適している可能性があります。