2023年12月22日
次のプロトコルはRPA2 immunofluorescent stainingに先行している細胞周期の同期を利用して細胞周期のG1段階のsingle-stranded DNAの焦点の検出を示す。
DNA損傷応答は生命に不可欠です。DNAは常に様々な有害なエンジンにさらされているため、その修復が欠如するとゲノムが不安定になったり、病気になったりします。我々は、RPA2の生物学的特性に基づいて、異なる細胞周期段階におけるDNA修復中の一本鎖DNA路を可視化する方法を開発しました。
一本鎖DNA検出の従来の方法では、BrdU抗体を利用します。このアプローチは、細胞を能動的に複製するために使用できます。さらに、この抗体は他のヌクレオチド類似体と交差反応する傾向があるため、その使用が制限されます。
BRDUとは異なり、このアプローチはS/N比が高いため、すべてのサイクルフェーズで使用できます。さまざまな細胞周期段階におけるさまざまなDNA修復経路の作用と、潜在的に非複製細胞を理解することは非常に重要です。私たちのプロトコルは、BrdUを利用する従来のアプローチが限られている一本鎖DNA病巣を視覚化するための新しいアプローチとツールを提供します。
DNA修復プロセスを包括的に理解することは、がん、老化、神経疾患を治療するための治療標的として役立つ可能性があります。私たちの細胞のほとんどは末端分化しているため、複製や分裂はしません。これらの細胞がさまざまなDNA病変をどのように修復するかをよりよく理解することが重要です。
そこで、本研究室では、主に複製後のDNA修復プロセスに着目し、それらを研究するための新しいツールを開発していきます。
本研究では、細胞周期のG1期における一本鎖DNAフォーカスの検出に取り組み、DNA修復メカニズムの重要性を強調しています。細胞周期の同期化とRPA2免疫蛍光染色を利用することで、さまざまな細胞周期ステージにおけるDNA損傷を可視化するための堅牢な手法を提供します。
G1期細胞における一本鎖DNA(ssDNA)フォーカスの正確な可視化は、複製時以外におけるDNA修復ダイナミクスの理解における重要な欠落を解消します。この機能により、DNA損傷応答経路のターゲットバリデーションにおける予測信頼性が向上し、初期探索およびトランスレーショナルリサーチにおけるリスク調整後の意思決定がサポートされます。本手法の特異性と向上したS/N比により、腫瘍学や加齢性疾患のポートフォリオに関連する非複製細胞および分裂後細胞集団における修復メカニズムの堅牢な評価が可能になります。
この免疫蛍光法に基づくssDNA可視化手法は、標的発見から前臨床研究までのプロセスに統合され、DNA修復標的に対する早期の仮説検証および下流のアッセイ開発を可能にします。