Name: 高次元シングルセルマスサイトメトリーによる急性骨格筋損傷時のin vivoにおける筋原性前駆細胞の同定と解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶ高次元シングルセルマスサイトメトリーによる筋原性前駆細胞の解析法。マウス骨格筋損傷モデルで細胞状態遷移を同定し、老化や疾患における筋肉再生メカニズムの理解に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>筋肉再生における筋原性前駆細胞のシングルセルCyTOF解析

<table><tbody><tr><td>15 mL遠心分離管</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>20 G ニードル</td><td>KDM</td><td>KD-fine 900123</td><td></td></tr><tr><td>28 G, 0.5 mL インスリン注射器&nbsp;</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>29 G、0.3 mLインスリンシリンジ</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>3 mLシリンジ</td><td>テルモメディカル</td><td>MDSS03SE</td><td></td></tr><tr><td>40 & マイクロ;m細胞ストレーナー</td><td>Fisher Scientific</td><td>11587522</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポリプロピレンチューブ&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>5 mLポリスチレン試験管、35 & micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringes</td><td>Terumo medical</td><td>SS05LE1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td><td>Merck</td><td>I7125-5g</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD104 FITC (clone: 346-11A)</td><td>Biolegend</td><td>123605</td><td>Stock = 0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101226</td><td>ストック = 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗CD31 APC-Cy7 (クローン:390)</td><td>Biolegend</td><td>102440</td><td>ストック = 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗CD45 APC-Cy7 (クローン:30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td>ストック = 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗CD9 APC (クローン:KMC8)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0091-82</td><td>ストック = 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗 Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (クローン:D7)</td><td>Biolegend</td><td>108126</td><td>ストック= 0.2 mg / mL</td></tr><tr><td>抗-α;7 インテグリン PE (クローン: R2F2))</td><td>UBC AbLab</td><td>67-0010-05</td><td>ストック = 1 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III (4 レーザー) 機器</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>405, 488, 561, and 633 nm レーザー</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン 0.3 mg/mL</td><td>Ceva</td><td>Vnr 054594</td><td></td></tr><tr><td>CD104 (クローン: 346-11A)</td><td>BD Biosciences</td><td>553745</td><td>ダイ162;自社共役</td></tr><tr><td>CD106/VCAM-1(クローン:429 MVCAM.A)</td><td>バイオレジェンド</td><td>105701</td><td>Er170;社内標識</td></tr><tr><td>CD11b(クローン:M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td>Nd148;自社</td></tr>結合<tr><td>CD29/インテグリン&β;1 (クローン:9EG7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553715</td><td>Tm169;社内</td></tr>標識<tr><td>CD31(クローン:MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td>Sm154;自社</td></tr>結合<tr><td>CD34(クローン:RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>551387</td><td>Lu175;自社</td></tr>結合<tr><td>CD44(クローン:IM7)</td><td>BD Biosciences</td><td>550538</td><td>Yb171;自社</td></tr>結合<tr><td>CD45(クローン:MEC 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>550539</td><td>Sm147;社内標識</td></tr><tr><td>CD9(クローン:KMC8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0091-85</td><td>Yb174;自社結合</td></tr><tr><td>CD90.2/Thy1.2(クローン:30-H12)</td><td>BD Biosciences</td><td>553009</td><td>Nd144;自社</td></tr>結合<tr><td>CD98(クローン:H202-141)</td><td>BD Biosciences</td><td>557479</td><td>Pr141;In-house conjugated</td></tr><tr><td>Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer</td><td>Standard Biotools</td><td>201240</td><td></td></tr><tr><td>Cell-ID Intercalator-Iridium</td><td>Standard Biotools</td><td>201192B</td><td>カチオン性核酸インターカレーター</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td>Pt195</td></tr><tr><td>Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride)</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>Clear 1.5 mLチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td> サイエンティフィック <td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、タイプ II</td><td>ワージントン バイオケミカル コーポレーション</td><td></td> LS004177 <td></td></tr><tr><td>計数室</td><td>メルク</td><td>BR718620-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4/SDF1 (クローン: 2B11/CXCR4 )</td><td>BD Biosciences</td><td>551852</td><td>Gd158;社内</td></tr>標識<tr><td>DAPI(1 mg/mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Dark 1.5 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>15386548</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (低グルコース、ピルビン酸含有)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA(エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩)</td><td>メルク</td><td>E5134</td><td>Na2EDTA-2H20</td></tr><tr><td>EQ 4エレメントキャリブレーションビーズ(EQビーズ)</td><td>スタンダードバイオツール</td><td>201078</td><td>キャリブレーションビーズ</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum、認定、ブラジル原産</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5SF</td><td>FineScience Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #7</td><td>Hounisen.com</td><td>1606.3350</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Helios CyTOF system</td><td>Standard Biotools</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-050-088</td><td></td></tr><tr><td>IdU</td><td>Merck</td><td>I7125</td><td>I127</td></tr><tr><td>イリジウムインターカレーター</td><td>スタンダード バイオツール</td><td>201240</td><td>IR191/193</td></tr><tr><td>イソフルラン/アタン獣医</td><td>ScanVet</td><td>Vnr 055226</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>M/3900/17</td><td></td></tr><tr><td>Myf5 (クローン: C-20)</td><td>サンタクルーズ バイオテクノロジー</td><td>Sc-302</td><td>Yb173;社内標識</td></tr><tr><td>MyoD(クローン:5.8A)</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td>Dy164;自社</td></tr>結合<tr><td>型MyoG(クローン:F5D)</td><td>BD Biosciences</td><td>556358</td><td>Gd160;社内結合</td></tr>型 <tr><td>Nalgene Rapid-Flow 滅菌ディスポーザブルボトルトップ 0.20 &mu;M PES フィルター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>595-4520</td><td></td></tr><tr><td>Notexin</td><td>ラトキサン</td><td>L8104</td><td>再懸濁液を 50 & マイクロ;滅菌PBS中のg / ml。在庫を保持します(例:50 & micro;l) -20 >C</td></tr><tr><td>栄養混合物 F-10 (ハム)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31550031</td><td></td></tr><tr><td>pAkt (クローン:D9E)</td><td>Standard Biotools</td><td>3152005A</td><td>Sm152</td></tr><tr><td>Pax7 (クローン:PAX7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-81648</td><td>Eu153;社内標識</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) (Pen/Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PES Filter Units 0.20 &mu;M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15913307</td><td></td></tr><tr><td>PES シリンジ フィルター</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16% EM グレード</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性、&nbsp;無水 (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10573181</td><td></td></tr><tr><td>pRb (クローン: J112-906)</td><td>Standard Biotools</td><td>3166011A</td><td>Er166</td></tr><tr><td>pS6 kinase (クローン: N7-548)</td><td>Standard Biotools</td><td>3172008A</td><td>Yb172</td></tr><tr><td>SCA-1 (クローン: E13-161.7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553333</td><td>Nd142;社内共役</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10553515</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基性、七水和物 (Na2HPO4-6H2O)</td><td>Merck</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水 0.9%</td> <td>フレゼニウス</td><td>B306414/02</td><td></td></tr><tr><td>&アルファ;7インテグリン(クローン:3C12)</td><td>MBL国際</td><td>K0046-3</td><td>Ho165;社内活用形</td></tr></tbody></table>

高次元シングルセルマスサイトメトリーによる急性骨格筋損傷時のin vivoにおける筋原性前駆細胞の同定と解析

Identification and Analysis of Myogenic Progenitors In Vivo During Acute Skeletal Muscle Injury by High-Dimensional Single-Cell Mass Cytometry

ここでは、(i) 骨格筋の幹細胞と前駆細胞の細胞および分子動態を研究するためのノテキシン注射による急性損傷時間経過の高次元 CyTOF 分析 (図 1、上のスキーム) を含む、この組み合わせアプローチを使用するための実験設定の概要を示します。(ii)幹細胞および前駆細胞のFACSは、CD9およびCD104の2つの細胞表面マーカーを使用して、これらの集団を単離し、それらの機能の詳細な研究を実施します(図1、下部のスキーム)。8-10週齢の雌C57BL/6マウスを以下の実験に用いた。
幹細胞と前駆細胞を同定し、急性損傷の過程でそれらの細胞および分子動態を研究するための骨格筋のCyTOF解析 我々は、ノテキシン注射による急性傷害の経過から、以前に公開された一般に入手可能なCyTOFデータセットを再分析し、骨格筋サンプルを21の金属標識CyTOF適合抗体19 のパネル...

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle ...

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

酵素的解離、線維/脂肪細胞とマウス骨格筋からの筋原性前駆細胞のフローサイトメトリーによる表面標識および精製方法。...

骨格筋からの前駆体の精製

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

この原稿は、成体マウスや、解剖などの筋肉のその後の操作、凍結、切断、ルーチン染色、および筋線維断面積の解析における急性骨格筋再生を誘導するための詳細なプロトコルを記述します。...

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。...

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。...

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

骨格筋は、特に核の配置に依存する非常にダイナミックなプロセスです。ここでは、我々...

筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブ イメージングを利用しました。

骨格筋生検組織から得られたヒト原発性筋前駆細胞(hMpAc)を分離、培養、特徴付け、分化する技術を提示する。これらの方法によって得られ、特徴付けられたhMpPCは、その後、ヒトの筋形成および骨格筋再生に関連する研究の質問に対処するために使用することができる。...

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

骨格筋のカルタトキシン媒介損傷と自己送出型siRNAの注射を組み合わせて、衛星細胞における特定の遺伝子の機能的損失を調べるためのインビボ法について述べた。...

カーディオトキシン損傷による骨格筋再生中の衛星細胞機能の解析と生体内での自己送出型siRNAの注射

このプロトコルは、ラット骨格筋から線維-異量体形成前駆体(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)を単離する方法を概説する。筋肉損傷モデルにおけるラットの利用は、分析のための萎縮性筋肉からの組織の可用性の増加と、自由に動く動物の筋力と歩行を評価するための検証された方法のより大きなレパートリーを提供する。...

ラットの骨格筋における線維-刺激性前駆腫(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)の同定、分離、および特徴付け

このプロトコルでは、筋肉幹細胞のインビトロ培養および機能解析方法が記載されており、内因性ニッチとの相互作用のほとんどを維持する。...

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)および筋幹細胞(MuSC)の正確な同定は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的機能を研究するために重要です。このプロトコルは、成体マウスの筋肉からのFAPおよびMuSCの分離、精製、および培養のためのガイドラインを提供します。...

FACSによる無動および損傷マウス骨格筋からの線維脂肪原性前駆細胞および筋幹細胞の単離および培養

学ぶ高次元シングルセルマスサイトメトリーによる筋原性前駆細胞の解析法。マウス骨格筋損傷モデルで細胞状態遷移を同定し、老化や疾患における筋肉再生メカニズムの理解に貢献します。

高次元シングルセルマスサイトメトリーによる急性骨格筋損傷時のin vivoにおける筋原性前駆細胞の同定と解析

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