Name: 背側外側膝状核ニューロンにおける内因性ニューロン興奮性の長期可塑性を誘導する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: 学ぶパッチクランプ電気生理学を用いた視床外側膝状体ニューロンの内因性興奮性長期可塑性の誘導法。ラット脳切片で高頻度刺激により活動電位を増加させ、視覚情報処理の神経可塑性メカニズムを解明する。

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INSERM、CNRS(DDへ)、AMU(MRへ)、FRM(DVS20131228768からDDへ、DEQ20180839583からDD)、NeuroSchool(A*Midex(Initiative d'Excellence d'Aix-Marseille Université, AMX-19-IET-004)およびANR資金(ANR-17-EURE-0029からAWへ)、ANR(LoGiK、ANR-17-CE16-0022からDD、Plastinex、ANR-21-CE16-013からDDによる)によってサポートされています。A Venture & K Miltonの優れたアニマルケアに感謝します。

すべての実験は、ヨーロッパおよび機関のガイドライン(理事会指令86/609/EECおよびフランス国立研究評議会)に従って実施され、地元の保健当局(マルセイユのBouches-du-Rhôneの獣医サービス)によって承認されました。
1. 動物
<ol>
	<li>雌雄の19〜25日齢のロングエバンスラット(体重50〜90 g)を使用して実験を行います。</li>
	<li>動物を従来のプラスチック製のケージに、母親と同腹仔と一緒に収容します。12時間の明暗サイクルで温度を一定に保ち、水と食物に自由にアクセスできます。</li>
</ol>
2. ラットdLGNの急性スライス
<ol>
	<li>切断/回収および細胞外記録溶液を準備します。
	<ol>
		<li>切断/回収溶液を調製するには、92 mM n-メチル-D-グルタミン、30 mM NaHCO3、25 mM D-グルコース、10 mM MgCl2、2.5 mM KCl、0.5 mM CaCl2、1.2 mM NaH2PO4、20 mM Hepes、5 mM アスコルビン酸ナトリウム、3 mM ピルビン酸ナトリウムを混合し、95% O2-5% CO2 (pH 7.4) で泡立てます。スライス作業中は、切削液を冷たく保ってください。</li>
		<li>125 mM NaCl、26 mM NaHCO3、2 mM CaCl2、2.5 mM KCl、2 mM MgCl2、0.8 mM NaH2PO4、および10 mM D-グルコースを混合して記録溶液(人工脳脊髄液、ACSF)を調製し、95%O2-5%CO2で恒久的に平衡化します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖ツールと2つの氷プラットフォームを準備します(図1A)。</li>
	<li>外側のタンクに氷を入れ、ビブラートームのスライスチャンバーを氷冷した切断液で満たします(図1B)。</li>
	<li>若いロングエバンスラット(年齢:P19-P25)をイソフルラン(5%)で深く麻酔します。.動物が深く麻酔をかけられていることを確認した後(反応なしに足をしっかりとつまむことにより)、ハサミまたはギロチン(動物の年齢/サイズによって異なります)で斬首することにより、髄質のレベルで動物を安楽死させます。ヘッドを最初の氷結プラットフォームに置き、酸素化氷冷スライス溶液で分離された組織に10秒ごとに水をまきます. 
	注:麻酔と安楽死の手順は、動物施設の別の部屋で行う必要があります。</li>
	<li>頭皮を尾側に切り、小さなハサミを使って頭蓋骨を左右に切ります。鈍い鉗子を使用して頭蓋骨を開き、へらで頭蓋骨から脳をすばやく抽出し、2番目の氷のプラットフォームに置きます 
	注:斬首から脳の抽出までの時間は2分を超えてはなりません。</li>
	<li>脳の前頭面に脳全体にわたって2つの切り込みを入れます。最初の切り込みは、皮質の前部と嗅球(図1Cを参照)を取り除き、2つ目は下丘のレベルで皮質と小脳の後部を取り除きます。</li>
	<li>吻側を上にして、ビブラトームのプレートに脳ブロックを接着します(図1D,E)を参照)。脳がビブラトームのスライスチャンバーに沈むまで、全手順中に定期的に(10秒ごとに)脳に水をやります。.</li>
	<li>ビブラトームでdLGNを含む350μmの薄切りを作成します(図1G)。中脳の皮質と海馬を鉛筆でそっと引っ張って取り除きます。</li>
	<li>壊れたパスツールピペットを柔軟なゴム製の吸盤につないでスライスを熱望します(図1H)。</li>
	<li>リカバリソリューションでスライスを20〜30分間回復させます（図1I)。</li>
</ol>
3. 全細胞パッチクランプ電気生理学
注:dLGNリレーニューロンからの全細胞パッチクランプ記録には、特定のパッチクランプアンプを使用してください。
<ol>
	<li>リグのポンプをオンにして、細胞外記録生理食塩水(ステップ2.1の組成を参照)が記録チャンバー内を循環するようにします。</li>
	<li>120 mM K-グルコン酸、20 mM KCl、10 mM Hepes、0.5 mM EGTA、2 mM MgCl2、2 mM Na2ATP、および0.3 mM NaGTP(pH 7.4)を混合して細胞内溶液を調製します><
	注:細胞内溶液は事前に調製し、-80°Cで凍結しておくことができます。凍結しない場合、溶液は4°Cに保たれます。</li>
	<li>GABAAチャネル遮断薬であるピクロトキシン(最終濃度100 μM)とイオノトロピックグルタミン酸受容体拮抗薬であるキヌレネート(最終濃度2 mM)を細胞外生理食塩水に加えます。</li>
	<li>スライスを直立顕微鏡に取り付けられた水中チャンバーに移します。チャンバーは30°Cで温度制御され、平衡化aCSFで連続的に灌流されます。</li>
	<li>U字型のプラチナ線をスライス上に置き、dLGNを視覚化するようにスライスを配置します(図2A)。</li>
	<li>プーラーで引っ張ったホウケイ酸ガラス管からパッチピペットを準備します。パッチピペットに細胞内溶液を充填したときに5〜10MΩの抵抗があることを確認してください。</li>
	<li>高倍率(40倍または60倍)でdLGNを可視化し、微分干渉コントラスト赤外ビデオ顕微鏡(図2B)を使用してパッチクランプ記録用のニューロンを選択します。ニューロンは、その健康な外観(すなわち、わずかに腫れ、鋭い膜の輪郭)に基づいて選択します。</li>
	<li>マイクロマニピュレーターを使用して、選択したニューロンにパッチピペットを一定の正圧で配置します。
	<ol>
		<li>アンプをVCモードに設定し、5mVの電圧ステップを注入します。電圧を -65 mV に設定します。次に、正圧を解放して高抵抗のシールを取得します(電圧ステップに応じた電流の減少に対応)。ピペットを通してわずかに熱望して、明確な過渡現象を取得します。</li>
		<li>アンプをCCモードに設定し、ブリッジのバランスを取ってアクセス抵抗を補償し、ニューロンを-65mVに保持します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. データ取得
<ol>
	<li>20 KHzで信号を集録して、高速活動電位をより適切に検出します。電圧信号と電流信号のローパス・フィルタを 10kHz に設定します。</li>
	<li>0.1 Hz の周波数で制御条件で 3-5 の活動電位を誘発するのに十分な正の電流パルス (通常は 500 ミリ秒で 80-250 pA) を注入することにより、約 10 分間の制御期間中のニューロンの興奮性を監視します。</li>
	<li>実験全体を通して、ニューロンの入力抵抗を短時間の負の電流パルス(通常は100ミリ秒で-20pA)で監視します。LTP-IEの誘導前後で電流パルスの振幅を一定に保ちます。</li>
</ol>
5. LTP-IEの導入
<ol>
	<li>制御期間の後、40 Hz で 10 分間供給される 15 の短いステップ (2-5 ms) の脱分極電流によって誘発される 15 のスパイクの列を誘発することにより、LTP-IE を誘導します。</li>
	<li>電流パルスの振幅を選択して、毎回1つの活動電位を引き出します(つまり、列車ごとに15の活動電位)。 
	注:15個のスパイクの各トレインは、0.1Hzの周波数(つまり、60トレインと900スパイク)で引き出されます。</li>
</ol>
6. データ分析
注:分析手順は、LTP-IE誘導前(制御条件)と後で同じです。
<ol>
	<li>記録された各トレースについて、電流のテストステップ(Rin = Vステップ/Iステップ)の前に注入された小さな負の電流パルスに対する電圧応答から入力抵抗(Rin)を計算します。制御期間中に入力抵抗のランアップまたはランダウン(10%以上)が発生した場合は、実験を破棄してください。</li>
	<li>電流注入前の膜電位に基づいて記録された微量を選択します。-67〜-63 mVの静止膜電位を持つ微量のみを保持します。</li>
	<li>各電流パルスによって誘発されるAPの数を測定し、データ解析ソフトウェアの自作ルーチンを使用して各分を平均することにより、導入後期間の開始後10分、20分後の期間にわたってLTP-IEを定量します(Igor Proルーチンについては補足ファイル1を参照)。電圧信号が0mVを横切るときのスパイクを検出します 
	注:LTP-IEは、誘導プロトコル後の電流パルス注入によって誘発される活動電位の数を、導入前(%)と比較したものとして表されます。分析は、ベースラインが -10-0 分、テストが +20/+30 分で行われました。</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここでは、記録されたニューロンを刺激して40Hzの周波数で10分間活動電位を誘発することにより、急性脳スライスで生きたdLGNニューロンにおけるLTP-IEの誘導を報告します。このプロトコルは、最小限の数の機器(スライサー、顕微鏡、1つのアンプ、1つの取得ボード、およびコンピューター)を必要とするため、神経生理学ラボで簡単に実装できます。ただし、貴重なデータを収集するには、いくつかの重要な手順を尊重する必要があります。プロトコル内の最初の重要なステップは、脳組織の質です。健康な視床スライスには、スライスの表面から中央(~150 μm)まで多くのニューロンが含まれています。健康なニューロンはわずかに腫れているように見えますが、死にかけているニューロンは通常しわが寄っています。2番目の重要なステップは、ベースライン中の記録の安定性です。活動電位の数は、ランアップやランダウンがなく安定している必要があります。さらに、過分極電流の短いパルスでテストされた入力抵抗は、10%を超える変化を示してはなりません。最後に、保持電流は+/- 10 pA以内で安定している必要があります。このような誘導プロトコルは、視覚皮質ニューロンでLTP-IEを誘導するために最初に使用されました19,20。ここでは、このプロトコルが視覚系の視床リレーニューロンにおいて内因性増強を誘導できることを示す26。直流注入によるスパイクの誘導は、単一の網膜線維の刺激が通常、dLGN ニューロンの活動電位を誘発できる興奮性シナプス後電位 (EPSP) を誘発するため、通常 dLGN ニューロンを駆動する網膜入力刺激を模倣することになっています27,28。dLGN ニューロンにおける LTP-IE の発現メカニズムは、元の出版物26 で調査されており、LTP-IE の誘導後に Kv1 チャネルがダウンレギュレートされることが明らかになりました。したがって、Kv1チャネルのダウンレギュレーションは、高速スパイクする皮質介在ニューロン16およびdLGNニューロン26のLTP-IEと、CA3領域29,30の恒常性可塑性の両方に関与しています。ただし、プロテインキナーゼA(PKA)がdLGNニューロンに関与しているため、シグナル伝達経路は異なりますが、mTORの主な役割は高速スパイク介在ニューロンで示唆されています。
本プロトコルは、ここで使用した実験条件で再現性のある結果を提供する:3 mM Ca2+、2 mM Mg2+、ピクロトキシン、およびキヌレネート、19〜25日齢のラットにおける40 Hzでの10分間刺激26。実際、平均して、このプロトコルは興奮性を2倍に増加させることができます。増強された興奮性の大きさは、刺激の持続時間、刺激の頻度、または動物の年齢とともに減少します26。目を開ける前に、LTP-IEは観察できません。内因性ニューロンの興奮性の長期にわたる可塑性を誘導するために使用される周波数は、感覚知覚31 の結合周波数であり、視覚系の可塑性を促進することが知られている脳振動のガンマバンドに対応します32。
ただし、より低いカルシウム濃度(すなわち、1.5 mM Ca2+)が使用された場合、シナプス可塑性について以前に示されているように、プロトコルを改訂する必要がある可能性があります33。この場合、刺激の周波数を60〜80Hzに上げる必要があります。LTP-IE の誘導に関する本プロトコルで使用される GABA 受容体遮断薬 (ガバジンのピクロトキシン) の発生率は、直流注射によってスパイクが誘発されるため、限られていると考えられています。それにもかかわらず、網膜刺激によってdLGNニューロンに活動電位が誘発される in vivo 状況では、動員されたGABA作動性入力34 はおそらくスパイク閾値を上昇させるでしょう。したがって、dLGNニューロンでLTP-IEをトリガーするには、より強力な網膜入力が必要になる可能性があります。ただし、オレキシンなどの覚醒中に活性な神経調節システムは、閾値35を低下させる可能性があります。
dLGNリレーニューロンにおける長期にわたる固有の可塑性の誘導は、視覚剥奪、活動電位を誘発するための網膜入力の刺激、または記録されたニューロンへの電流注入による活動電位の誘発によって直接達成することができる26。この最後のプロトコルは、実装が速く、シナプスシミュレーション手順26と同等の結果を提供するため、群を抜いて最も簡単な方法です。
このプロトコルは、視覚皮質錐体ニューロン19 と視床リレーニューロン26の両方でLTP-IEを誘導することが示されている。また、腹側 LGN (vLGN) や上丘 (SC) を含む他の皮質下視覚核におけるニューロンの興奮性の長期にわたる可塑性を誘導するためにもおそらく使用できます。

この手法論文の全体的な目標は、パッチクランプ技術の標準的な電流クランプモードを使用して、ラットの視覚視床ニューロンにおけるニューロン興奮性の長期にわたる可塑性を誘導する簡単な方法を提供することです1,2.この手法の開発の背後にある理論的根拠は、その単純さと再現性です。シナプス入力の刺激が、与えられたタイミングで送達されるシナプス後活動電位と対になるかどうかの刺激など、代替技術よりも優れている点は、その信頼性です。
視覚系の可塑性は伝統的に皮質レベルでのみ発現すると考えられてきましたが、視床レベルでの網膜入力の主要なレシピエント構造である背側外側膝状核(dLGN)は、伝統的に視覚情報の単なる中継物であると考えられています3。しかし、この最初の結論は、この単純な見方が長くは成り立たないことを示す最近の研究によって挑戦されています4,5,6.たとえば、視覚反応の機能障害は、LGN7の段階で弱視患者ですでに観察されています。さらに、特定の単眼領域内のdLGNリレーニューロンの大部分は、各眼から入力を受け取っており、dLGNニューロンの大部分が両眼視の可能性を示しています8,9,10。さらに、単眼の剥奪は、dLGNニューロンの眼の優位性に大きな変化をもたらします5,11,12。
眼優位シフトで起こりうる機能的可塑性のメカニズムの中で、内因性ニューロン興奮性の可塑性が潜在的な候補です。実際、視覚野を含む多くの脳領域は、さまざまな行動課題の後に内在的な可塑性を表現します13,14.求心性グルタミン酸入力の刺激後、中枢ニューロンで長期的な内因性可塑性が報告されています15,16,17,18、スパイク活動19,20、感覚刺激21、または活動後または感覚遮断20、22,23.ここでは、40 Hzの周波数でのスパイク活動に続いて、dLGNリレーニューロンにおける内因性興奮性の長期増強(LTP-IE)の誘導を可能にするプロトコルについて説明します。40Hzの発火周波数は、視覚刺激時にin vivoのほとんどのdLGNニューロンで観察される周波数に対応します24,25。

<table><tbody><tr><td>自動振動ブレードミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>VT-1200S</td><td>ビブラトーム/スライサー</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス管</td><td>Phymep</td><td>B-15086-10</td><td></td></tr><tr><td>コントローラー Typ V</td><td>Luigs&Neumann</td><td>Typ V</td><td>温度調節器</td></tr><tr><td>Igor ソフトウェア</td><td>波流解析</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>赤外線ビデオ顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>XM-10 カメラ</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenate</td><td>Merk/Sigma</td><td>K3375</td><td>AMPA/NMDA 受容体ブロッカー</td></tr><tr><td>低ノイズデータ収集システム</td><td>Axon - 分子デバイス</td><td>Digidata 1440A</td><td>アナログ/デジタルインターフェース</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Luigs&Neumann</td><td>LN Mini25</td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 200B</td><td>Axon - Molecular devices</td><td>N/A</td><td>パッチクランプアンプ</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Axon - Molecular devices</td><td>N/A</td><td>パッチクランプアンプ</td></tr><tr><td>PC-100 プーラー</td><td>成重</td><td>PC-100</td><td>マイクロピペットプーラー</td></tr><tr><td>PClamp10</td><td>Axon - Molecular devices</td><td>N/A</td><td>パッチクランプ録音ソフトウェア</td></tr><tr><td>ピクロトキシン</td><td>AbCam</td><td>ab120315</td><td>GABAA 受容体遮断薬</td></tr><tr><td>スライス ミニ チャンバー&nbsp;</td><td>ルイグス&Neumann</td><td>LN Chambre Slice mini I-II</td><td>サブマージチャンバー</td></tr><tr><td>直立顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>BX51 WI</td><td></td></tr></tbody></table>

背側外側膝状核ニューロンにおける内因性ニューロン興奮性の長期可塑性を誘導する

Inducing Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability in Neurons of the Dorsal Lateral Geniculate Nucleus

背側外側膝状核(dLGN)は、網膜から皮質領域に移動する視覚情報の基本的な中継器として機能すると長い間考えられてきましたが、最近の発見は、dLGN主細胞の機能的可塑性の大部分が過小評価されていることを示唆しています。しかし、これらの変化を支える細胞メカニズムは十分には解明されていません。ここでは、若いラットの急性脳切片からの背側dLGNリレー細胞における内因性ニューロン興奮性(LTP-IE)の長期増強を誘導するプロトコルを報告します。内因性可塑性は、一般にシナプス可塑性と並行して誘発されます。しかし、dLGNニューロンでは、LTP-IEは40Hzの周波数で10分間のスパイク活性によって確実に誘導されます。結論として、この研究の結果は、dLGNリレー細胞における内因性可塑性の誘導に関する最初の証拠を提供し、したがって、活動依存性の視覚可塑性における視床ニューロンの役割をさらに示しています。

dLGNニューロンをホールセル構成で記録し、イオンチャネル型グルタミン酸受容体およびGABA受容体拮抗剤の存在下で、40 Hzで10分間の活動電位発火によりLTP-IEを誘導した（図3A）。誘導から20～30分後に、活動電位の数が3倍に増加したことが観察された（図3B）入力抵抗 R に変化はなくin (図3C）。このプロトコルにより、dLGNニューロンにおいてLTP-IEが確実に誘導された（図3D)26これらの結果は、本研究で述べたプロトコルが、dLGNニューロンにおけるニューロン興奮性の長期的な可塑性を誘導するのに効率的であることを示しています。 in vitro.
<img alt="顕微鏡観察のための組織標本作成および切片作成；マイクロトームの設定および切片作成の進行状況；実験手順。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65950/65950fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図1"> 
図1dLGNを含む脳切片の作製方法 (A脳の摘出に必要な器具。B) スライサー (C) 脳の前額面における切断 (Dプレート上に接着させる。E) プレート上における脳の配置。 (F）脳をプレート上に固定する。（G）スライシング（H) スライスの採取 (J回復溶液中でのスライス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/65950fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="マウスdLGNおよびvLGNの顕微鏡画像、細胞の詳細。スケールバー：150 µm、10 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65950/65950fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図2"> 
図2dLGNを含む切片の視野および顕微鏡下でのニューロンの可視化。 (AdLGNおよびvLGNを含むスライスを、ナイロン糸で記録チャンバー内に固定した状態での、4倍対物レンズによる全景像。BパネルAの点線で囲まれた領域である、対側dLGNのdLGNニューロンを40倍対物レンズで観察する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/65950fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="AP（活動電位）の変化を示すdLGNにおける電気生理学的結果。ニューロン応答のグラフおよびデータ解析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65950/65950fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図3"> 
図3dLGNニューロンにおけるLTP-IEの誘導。 (A) 記録構成および誘導刺激。LTP-IE誘導に使用した刺激は、各脱分極電流パルスによって活動電位を誘発させるため、約1 nAの15パルスで構成した。 (B) LTP-IEの時間経過。上段は、LTP-IE誘発前（黒）および誘発後（赤）の代表的なトレース。下段は、脱分極パルスあたりの正規化された活動電位数の時間経過。スパイク数が増加し、時間経過に伴う減少が見られないことに注目されたい。 &gt;40分（C) 入力抵抗の安定性。LTP-IE誘導前（黒）および誘導後（赤）における、電流ステップ（負方向）によって誘発された電位の変化。入力抵抗は、固定されたレイテンシ（*で表示）で測定した。 (D) 左：LTP-IEの再現性を示す8個のdLGNニューロンのグループデータ。右：Rの欠如を示す8個のdLGNニューロンのグループデータ。in 変更。パネルBはDuménieuらの許可を得て再利用しています。26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/65950fig03large.jpg" target="_blank">こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1：Igor LTP-IE 解析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/Supplementary%20File%201-Igor%20LTP-IE%20analysis.zip" target="_blank">こちらのリンクから本ファイルをダウンロードしてください。</a>

ここでは、ex vivoの脳切片で維持されている背側外側膝状核からリレーニューロンのニューロン内因性興奮性の長期可塑性を誘導するためのプロトコルについて説明します。

The dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) has long been held to act as a basic relay for visual information traveling from the retina to cortical ...

inducing-long-term-plasticity-intrinsic-neuronal-excitability-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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