Name: パーキンソン病のショウ ジョウバエ モデルにおける便秘の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 20 s
Description: 学ぶパーキンソン病のショウジョウバエモデルにおける便秘測定法。アルファシヌクレイン発現による神経変性と消化管通過時間の関連を評価し、非運動症状の病態理解と治療開発に貢献する簡便なアッセイを解説します。

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ブリガム・アンド・ウィメンズ病院とハーバード大学医学部のメル・フィーニー博士には、ショウ ジョウバエ 系統を発現する対照とα-シヌクレインの親切な贈り物に感謝します。オルセン博士への助成金は、NINDS K08、米国パーキンソン病協会ジョージ・C・コッツィアス・フェローシップ、国防総省パーキンソン病早期研究者賞です。

このアッセイで使用したハエ:コントロール:nSyb-QF2、nSyb-Gal4/+;α-シヌクレインは飛ぶ:nSyb-QF2、nSyb-Gal4、QUAS-α-シヌクレイン/+;閉鎖後1日および10日。オスとメス(交尾と非交尾)のハエ( 材料表を参照)。
1.染めたハエの餌を準備する
<ol><li>青色のソフトジェルペースト食品着色料( 材料表を参照)と蒸留水を1:1の比率(v / v)で混合します。 注:一部の青色染料には神経保護効果があることが示されているため、非吸収性染料のみを含む市販の食品着色料を使用してください21。</li>
	<li>標準的なコーンミール寒天( 材料表を参照)からなるハエの餌のバイアルを、餌が液体またはスラリーに溶けるまで10〜15秒間隔で電子レンジで加熱します。食べ物を沸騰させないでください。</li>
	<li>食品の各バイアルに染料混合物を添加して、バイアル間で均一な着色を得ます。食品が均一に青くなるまで色素混合物を混合します(図1)。食品の色が飽和し、バイアル間で色のばらつきがないように、青色染料混合物の量を追加します。 注意: 食品はすぐに固まるため、この手順は電子レンジの直後に実行する必要があります。食品が固まった場合は、バイアルを再度電子レンジで加熱します。</li>
	<li>染色食品のバイアルが固まるまで自然乾燥させます。乾燥中にバイアルの開口部に薄いペーパータオルを置き、迷子のハエがバイアルに着地するのを防ぎます。.</li>
	<li>食品が冷えて固まったら、検査に使用するハエを青い食品に移します。 注:幅の狭いバイアル(25 mm)の場合、各バイアルに9〜14匹のハエを追加することをお勧めします。幅広のバイアル(28.5 mm)の場合、各バイアルに10〜20匹のハエを追加することをお勧めします。ハエは性別や交尾経験によって分離されておらず、交尾した雌と交尾していない雌の両方を含む、雄と雌の混合個体群が含まれます。</li>
	<li>バイアルをハエと一緒にインキュベーターで25°Cで一晩インキュベートします。</li>
</ol>2. ハエの撮影
メモ:この手順はオプションです(図2)。
<ol><li>翌朝(時刻0)、代表的なハエに二酸化炭素を60秒間麻酔します。腹側が上を向くようにフライを置きます。</li>
	<li>カメラ( 材料表を参照)を使用して、毎時のハエの画像を撮影し、消化器系に残っている青い餌の量を視覚化します。 注:これらのハエは、麻酔が結果に影響を与える可能性があるため、アッセイの定量的な部分(ステップ3)には使用しないでください。</li>
	<li>毎時間、麻酔をかけ、新しいハエを画像化します。</li>
</ol>3. 便秘検査の実施
<ol><li>残りの(麻酔されていない)ハエを標準的な ショウジョウバエ の餌と一緒にバイアルに移します。各バイアルに番号を付けます。</li>
	<li>ハエをインキュベーターに25°Cで60分間放置します。</li>
	<li>60分後、ハエを標準的な ショウジョウバエ の餌を入れた新しいバイアルに移します。最初のバイアルセットからデータ記録を開始します。</li>
	<li>バイアルの長さに点線を引き、カウントを開始するポイントをマークします。</li>
	<li>各バイアルの壁にある小さな丸い点の数を手動で数えます。食品やバイアルのプラグにあるドットを数えないでください。</li>
	<li>各バイアルの壁にある青い点の数を数えることから始めます。</li>
	<li>各バイアルの壁にある不透明で無色のドットの数を数えます。 注:各ドットはハエの排泄物であり、尿と糞便22の組み合わせです。時折、ハエが排泄物の上を歩いて痕跡を残すことがありますが、その場合は、痕跡の個々のマークではなく、元の点のみを数えます。</li>
	<li>各バイアルのドットの総数に対する青いドットの比率を記録します。 注:ドットの総数は、バイアルの壁にある青い点の数に、同じバイアルの壁にある無色の点の数を加算したものです。これは、時間あたりの青色の糞便の割合を計算するために使用されます。</li>
	<li>手順 3.2 から 3.8 をさらに 7 回繰り返し、合計 8 時間にわたって 1 時間ごとにデータを収集します。</li>
</ol>4. データ分析
<ol><li>各条件の 1 時間あたりの青色の糞便の割合をグラフ化します。</li>
	<li>条件間のデータを比較します。 注:統計的有意性は、条件間の個々の時点を比較する、時間の経過に伴う線の傾きを測定する、または曲線下の面積を比較することにより、3つの方法で決定できます。</li>
</ol>

ショウジョウバエの便秘アッセイ

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).</li>
<li>Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the environment.</a> Front Neurol. 10, 218(2019).</li>
<li>Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+challenge+test+for+early+detection+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116(2021).</li>
<li>Ueki, A., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+style+risks+of+Parkinson%27s+disease%3A+association+between+decreased+water+intake+and+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation.</a> J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).</li>
<li>Houser, M. C., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis%3A+is+intestinal+inflammation+a+silent+driver+of+Parkinson%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis.</a> NPJ Parkinsons Dis. 3, 3(2017).</li>
<li>Pfeiffer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motor+symptoms+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-motor symptoms in Parkinson's disease.</a> Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).</li>
<li>Klann, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut-brain+axis+and+its+relation+to+parkinson%27s+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review.</a> Front Aging Neurosci. 13, 782082(2021).</li>
<li>Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gut dysfunction in Parkinson's disease.</a> World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).</li>
<li>Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+gut%3A+symptoms%2C+nutrition%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).</li>
<li>Chen, S. J., Lin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microenvironmental+changes+as+a+potential+trigger+in+Parkinson%27s+disease+through+the+gut-brain+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis.</a> J Biomed Sci. 29 (1), 54(2022).</li>
<li>Hawrysh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRKN%2Fparkin-mediated+mitophagy+is+induced+by+the+probiotics+Saccharomyces+boulardii+and+Lactococcus+lactis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis.</a> Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).</li>
<li>Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestine-derived+%CE%B1-synuclein+initiates+and+aggravates+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila.</a> Transl Neurodegener. 11 (1), 44(2022).</li>
<li>Rota, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constipation%2C+deficit+in+colon+contractions+and+alpha-synuclein+inclusions+within+the+colon+precede+motor+abnormalities+and+neurodegeneration+in+the+central+nervous+system+in+a+mouse+model+of+alpha-synucleinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy.</a> Transl Neurodegener. 8, 5(2019).</li>
<li>Diwakarla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATH434+reverses+colorectal+dysfunction+in+the+A53T+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).</li>
<li>Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+Induces+mitochondrial+dysfunction+through+spectrin+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton.</a> Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).</li>
<li>Olsen, A. L., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+%CE%B1-synuclein+promotes+neurodegeneration+characterized+by+a+distinct+transcriptional+program+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo.</a> Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).</li>
<li>Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+and+systemic+signals+couple+nutritional+and+reproductive+status+with+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis.</a> Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).</li>
<li>Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interplay+in+Drosophila+melanogaster%3A+chronic+nutritional+deprivation+in+larval+life+affects+adult+fecal+output%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output.</a> J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).</li>
<li>Popovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+dPerk+in+the+intestine+suppresses+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Cell Death Dis. 14 (3), 206(2023).</li>
<li>Poteet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+actions+of+methylene+blue+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives.</a> PLoS One. 7 (10), e48279(2012).</li>
<li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li>
<li>Schlichting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+network+underlying+circadian+entrainment+and+photoperiodic+adjustment+of+sleep+and+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila.</a> J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

このプロトコルには、アッセイを成功裏に完了させるのに役立ついくつかのステップがあります。まず、各バイアルの各ラウンド間の時間間隔が実験全体を通して一貫していることを確認することが重要です。バイアルに番号をラベル付けすると、長い遺伝子型の説明が不要になり、時間を節約できます。さらに、糞便22 を数える方法は、実験全体を通して一貫していることが重要です。食品やバイアルのプラグには青い糞便が見えますが、無色の糞便は見えません。したがって、食品またはバイアルプラグの青い点を数えないでください。
行動アッセイでは、ハエの行動の変動やアッセイに影響を与える未知の変数により、結果に一貫性がなくなる可能性が常にあります。すべての実験に、同じショウ ジョウバエ 培地、同じ食用色素、同じブランドのバイアルを使用することをお勧めします。興味深いことに、いくつかの試験では、ハエの概日リズムが原因で、ハエは午後の早い時間に排便する頻度が低くなる傾向があることが観察されました23。しかし、この行動は対照のハエとα-シヌクレインを発現するハエの両方で一貫しているため、懸念はありません。
アッセイの開始時にハエが青色の糞便を排泄しない場合は、使用されている染料が十分に色素化されていない可能性があります。この場合、それに応じて蒸留水に対する染料の比率を増やすことができます。また、ハエの消化管に青い餌が少量しか残っていない場合、糞便が淡い青色か無色かを判断するのが難しい場合もあります。これが発生した場合は、バイアルの後ろに白い紙を置くと、糞便ドットの色を決定するのに役立ちます。糞便が非常に水色であっても、無色の糞便ではなく青色の糞便として記録するのが最善です。
このアッセイの限界の1つは、糞便の斑点を手作業で数える必要があることです。ハイスループットスクリーニングの可能性を高めるために、このプロトコルは将来、マルチウェルプレート内の個々のハエによって生成される青色の糞便スポットの自動定量を可能にするように変更される可能性があります。もう一つの限界は、α-シヌクレインモデルがPDの前駆体モデルに発展する可能性を秘めているが、神経変性を伴わずに便秘が存在する最適な時点がまだ特定されていないことである。
要約すると、この方法は、PDの ショウジョウバエ モデルで、研究が進んでいない非運動性PD症状である便秘をモデル化するためのシンプルで簡単なアプローチを提供します。

パーキンソン病(PD)は進行性の神経変性疾患であり、運動緩慢、硬直、振戦などの運動症状の存在を臨床的に特徴とし、重大な罹患率をもたらします1。病理学的には、PDは黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失およびα-シヌクレインのミスフォールディングによって定義され、レビー小体およびレビー神経突起の形成につながる。パーキンソン病の病因は未だによくわかっておらず、遺伝的要因と環境的要因の複雑な相互作用に起因している可能性が高い2,3。現在、疾患修飾療法は利用できませんが、これはおそらく診断時に存在する病理学の進行した段階が一因です。研究によると、黒質のドーパミン作動性ニューロンの60%以上が運動症状の発症によってすでに失われており、疾患の早期発見のための潜在的なバイオマーカーを探る必要性が強調されています4。そのような臨床バイオマーカーの1つが便秘であり、これはPD患者によく見られ5,6、運動症状の発症に数年または数十年先行する可能性があります。
運動症状に基づくPDの臨床的定義にもかかわらず、便秘はいくつかの非運動症状の1つであり、対症療法の治療がより困難であり、患者の生活の質に重大な障害を引き起こします7。脳と腸神経系の間の双方向のコミュニケーションを表す腸脳軸の変化は、PDの病因に関与しています。α-シヌクレイン凝集体はPD患者の消化管からの組織サンプル中に見出されており8、動物モデルでは、腸神経系のα-シヌクレイン凝集体がプリオン様に中枢神経系に広がることが示唆されている9。さらに、PD患者は腸内細菌叢に異常を示し10、過度の腸内炎症を経験する可能性がある11。PDの便秘は十分に研究されておらず、ハエ12,13またはげっ歯類14,15におけるパーキンソン病関連便秘のモデルはほとんど報告されていません。
このアッセイは、ハエが汎ニューロンドライバーであるn-シナプトブレビンの制御下でヒトα-シヌクレイン遺伝子を発現するPDのショウジョウバエモデルを採用しています。これらのハエは、α-シヌクレイン凝集、運動機能障害、加齢に伴う神経変性など、PDのすべての特徴的な特徴を示し、ドーパミン作動性ニューロンの喪失をもたらします16,17。以前の研究では、腸機能障害を評価するためにハエの糞便量を測定し、ハエの糞便を定量化し、さまざまな遺伝子系統の排泄物量を比較して、消化器系の機能的な違いを明らかにしました18,19,20。ここでは、ヒトα-シヌクレインを発現するハエを用いた便秘アッセイを実証します。このシンプルでありながら貴重なツールは、PDの重要な非運動症状の研究を可能にします。

<table><tbody><tr><td>1400 g スクロー</td><td>ス MP バイオメディカル</td><td>904713</td><td></td></tr><tr><td>1800 g デキストロース</td><td>MP バイオメディカル</td><td>901521</td><td></td></tr><tr><td>2884 g 酵母</td><td>MP バイオメディカル</td><td>903312</td><td></td></tr><tr><td>428 g 寒天</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>10253156</td><td></td></tr><tr><td>4600 mL 糖蜜</td><td>おばあちゃんの糖蜜</td><td>7971942</td><td></td></tr><tr><td>68 L 水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>680 mL テゴセプトミックス (1200 g テゴセプト 6 L エタノール)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6864 g</td><td>コーンミール パールミリング</td><td>125045</td><td></td></tr><tr><td>800 mL 酸ミックス (83 mL リン酸 1 L 水 + 836 mL プロピオン酸 1 L 水)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens 標準ソフトウェア</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Pharmco-Aper</td><td>111ACS200</td><td></td></tr><tr><td>幅広プラスチックバイアル用フラッグ</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>49-101</td><td></td></tr><tr><td>フライスタッフ ワイド・ショウジョウバエ・バイアル、ポリスチレン</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>グラフパッド プリズム</td><td>グラフパッド</td><td>N/A</td><td>バージョン9.5.1</td></tr><tr><td>オリンパス DP23カメラ</td><td>オリンパス</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス SZX12 実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>リン酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>S25470A</td><td></td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A258 - 500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ソフトジェルペースト食品着色料、ロイヤルブルー</td><td>アメリカラー</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Apex</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSyb-QF2、nSyb-Gal4</td><td>Dr. Mel Feany</td><td>N/A</td> Linesが提供するすべてのライン<td>は、Dr. Feany&nbspから直接入手可能です。</td></tr><tr><td>nSyb-QF2、nSyb-Gal4、QUAS-αシヌクレイン</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

パーキンソン病のショウ ジョウバエ モデルにおける便秘の測定

Measuring Constipation in a Drosophila Model of Parkinson's Disease

パーキンソン病(PD)の非運動症状は一般的で、治療が困難であり、生活の質を著しく損ないます。一般的な非運動症状の1つは便秘であり、PDの診断に数年または数十年先行することがあります。便秘はPDの動物モデルでは十分に調査されておらず、特定の治療法がありません。このアッセイは、ヒトα-シヌクレインが汎ニューロンドライバーの下で発現するPDの ショウジョウバエ モデルを利用しています。α-シヌクレインを発現するハエは、ドーパミン作動性ニューロンの喪失、運動障害、α-シヌクレイン封入体など、PDの特徴を発現します。
このプロトコルはこれらのはえの便秘を調査するための方法を概説する。ハエは、青色の着色料を添加したハエの餌に一晩置き、翌日に標準食に移します。その後、標準的なハエの餌が入った新しいバイアルに8時間毎時移されます。各移送の前に、バイアル壁の糞便斑点の合計に対する青色の糞便斑点の割合が計算されます。α-シヌクレインを欠損した対照ハエは、α-シヌクレインを発現するハエの数時間前にすべての青色色素を排出します。さらに、腸からの青い色の食べ物の通過は、簡単な写真で監視できます。このアッセイの簡便さは、 ショウジョウバエの便秘の修飾因子を特定するための前方遺伝学的または化学的スクリーニングでの使用を可能にします。

ショウジョウバエの腹部は透明であるため、麻酔をかけた生きたハエの腸内を青い餌で視覚化することができます。腸内輸送の質的な違いは、さまざまな時点でハエの画像を撮影することで評価できます。対照のハエでは、青い餌はすぐに排出されますが、α-シヌクレインハエでは、青い餌は8時間も腸内に残ります(図2)。
α-シヌクレインハエは加齢に伴う神経変性を示し、エクロジョン後10日までに頑健な表現型が発達する10。この時点において、対照ハエと比較した場合の腸内通過時間の違いは、条件間の個々の時点を比較したり、時間の経過に伴う線の傾きを測定したり、曲線下の面積を比較したりすることによって見られます(図3)。運動機能障害や神経変性もまだ見られない早期の時点(閉鎖後1日目)では、対照群とα-シヌクレインハエの腸内輸送に差は見られませんでした(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2.jpg"> 図1:青色の食品バイアルと糞便の斑点。 (A)すべてのバイアルには青色の食品が含まれています。この時点では、ハエが青い餌に導入されたばかりで、青い糞便は見えません。(B)w1118ハエが生鮮食品に1時間移された後のバイアルは、その後取り出されます。(C)では左のインセットが拡大され、(D)では右インセットが拡大されます。(C)ハエの餌が存在するために分析から除外された領域。(D)糞便の斑点を拡大し、青色(黒矢印)と非青色斑点(黄色矢印)を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig02.jpg"> 図2:染色食品の腸内移動の経時的な可視化。 対照のハエとニューロンにヒトα-シヌクレインを発現するハエを青色に染めた餌に一晩放置し、翌日標準培地に移した。ハエは、1時間ごとに新しい標準的なハエの餌に連続して移されました。転写後0時間、2時間、4時間、6時間、8時間後の代表的な画像を示す。対照群とα-シヌクレインハエは、時間ゼロ時に腸内に同様の青い餌の斑点を示します。その後の時点では、対照のハエはα-シヌクレインのハエよりも青色の餌が少なく、対照のハエの8時間時点ですべての青い餌がなくなります。各ハエ系統の遺伝子型は次のとおりです:コントロール(nSyb-QF2、nSyb-Gal4 / +);α-シヌクレイン(nSyb-QF2、nSyb-Gal4、QUAS-α-シヌクレイン/+)が飛ぶ。雌のハエは、サイズが大きいため腹部を視覚化しやすいため、イメージングに使用されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2.jpg"> 図3:閉鎖後10日目の便秘アッセイ。 対照のハエとニューロンにヒトα-シヌクレインを発現するハエを青色に染めた餌に一晩放置し、翌日には標準的なハエの餌に移した。ハエは1時間ごとに新しい標準培地に連続して移されました。(A)時間あたりの青色糞便の割合。エラーバーは標準偏差を表します。N = 遺伝子型あたり6バイアル。各バイアルには9〜14匹のハエが含まれていました。すべての統計解析は、Graphpad Prismで行いました( 材料表を参照)。各時点における統計的有意性は、二元配置分散分析を用いて計算した。ラインの傾きと傾斜角間の差は、線形回帰分析を使用して計算されました。(B)各遺伝子型の曲線下面積を計算した。エラーバーは標準偏差を表します。各ハエ系統の遺伝子型は次のとおりです:コントロール(nSyb-QF2、nSyb-Gal4 / +);α-シヌクレイン(nSyb-QF2、nSyb-Gal4、QUAS-α-シヌクレイン/+)が飛ぶ。オスとメスの両方のハエがほぼ同じ数に含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2.jpg"> 図4:閉鎖後1日目の便秘アッセイ。 対照のハエとニューロンにヒトα-シヌクレインを発現するハエを青色に染めた餌に一晩放置し、翌日標準培地に移した。ハエは、1時間ごとに新しい標準的なハエの餌に連続して移されました。(A)時間あたりの青色糞便の割合。エラーバーは標準偏差を表します。N = 遺伝子型ごとに最低 5 バイアル。各バイアルには9〜14匹のハエが含まれていました。すべての統計分析はGraphpad Prismで行いました。各時点における統計的有意性は、二元配置分散分析を用いて計算した。ラインの傾きと傾斜角間の差は、線形回帰分析を使用して計算されました。(B)各遺伝子型の曲線下面積を計算した。エラーバーは標準偏差を表します。各ハエ系統の遺伝子型は次のとおりです:コントロール(nSyb-QF2、nSyb-Gal4 / +);α-シヌクレイン(nSyb-QF2、nSyb-Gal4、QUAS-α-シヌクレイン/+)が飛ぶ。オスとメスの両方のハエがほぼ同じ数に含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルはパーキンソン病のアルファ シヌクレインによって基づくショウ ジョウバエ モデルの模倣の便秘のための試金を示す。

Non-motor symptoms in Parkinson's disease (PD) are common, difficult to treat, and significantly impair quality of life. One prevalent non-motor symptom ...

パーキンソン病は、運動緩慢、振戦、硬直などの運動症状によって定義されます。しかし、パーキンソン病の患者の多くは、治療が難しく、生活の質に大きな障害を引き起こす非運動症状に苦しんでいます。これらは、この病気の動物モデルでは十分に研究されていないため、新しい治療法を見つける能力が制限されています。このプロトコルはシンプルで安価ですが、再現性のある結果が得られます。習得が簡単で、特別な機器は必要ありません。この簡単なアッセイで、神経変性のあるハエの便秘を評価することができます。将来的には、ハエが神経変性を発症する前に便秘を発症するモデルを開発したいと考えています。これにより、パーキンソン病の病因をよりよく理解することができます。

measuring-constipation-in-a-drosophila-model-of-parkinson-s-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイ...

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

パーキンソン病は、運動欠陥を引き起こす中枢神経系におけるドーパミン作動性ニューロンの変性に起因する神経変性疾患である。ロテノンモデルショウジョウバエのパーキンソン病。本論文では、ロテノンによって引き起こされる自発的かつ驚愕誘発性の両方歩行の欠陥を特徴づける2つのアッセイの概要を説明します。...

のロテノン誘発性のパーキンソン病モデルにおける自発と驚愕誘発性歩行を特徴づけるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em

私たちは、神経変性疾患のモデルとして、Drosophila...

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

この記事では、7点スコアリングシステムを使用して 、C.エレガンスにおけるドーパミン作動性ニューロンデンドライト形態の変化を一貫して定量化する方法を紹介します。このシステムは、神経変性疾患の遺伝的、化学的、および年齢ベースのモデルを利用したドーパミン作動性神経変性アッセイの分析を目的としています。...

カエノハブディティス・エレガンスにおけるドーパミン作動性ニューロン形態変化と変性の定量化

本プロトコルは、若年RAC1/CED-10変異型...

初期パーキンソン病研究のためのツールとしての Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10変異体の消化管運動評価

ここで我々 は説明の幼虫が 3...

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

このプロトコルは当てて神経細胞樹状パターン形成の複雑さ (NDAC)...

ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

本稿の目的は、単量体α-シヌクレインからのフィブリルの生成に必要なステップ、その後の品質管理、およびインビボで予備成形されたフィブリルの使用について概説することである。...

モノマーからのαシヌクレイン予備型フィブリルの生成と生体内での使用

ここでは、ラットのサイズと重量の増加に対応するためにマウスウォーカー装置を再設計することによって構築されたラットウォーカーシステムについて説明します。このシステムは、フラストレーション全反射(FTIR)、高速ビデオキャプチャ、およびオープンアクセス分析ソフトウェアを使用して、歩行パラメータを追跡および定量化します。...

パーキンソン病の遺伝的ラットモデルにおける歩行解析のためのラットウォーカーシステムの適用

ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。...

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

学ぶパーキンソン病のショウジョウバエモデルにおける便秘測定法。アルファシヌクレイン発現による神経変性と消化管通過時間の関連を評価し、非運動症状の病態理解と治療開発に貢献する簡便なアッセイを解説します。

パーキンソン病のショウジョウバエモデルにおける便秘の測定

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