Name: 緑膿菌からのシデロフォア産生の定性的および定量的分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: 学ぼう、緑膿菌のシデロフォア産生を定性的・定量的に分析する方法。分光光度法を用いてピオベルジンとピオケリンを測定し、細菌の鉄獲得と病原性メカニズムを解明する。

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著者は、DBT(バイオテクノロジー教育プログラム)、DBT(BUILDERプログラム)、およびFISTからの資金提供を認めています。SHODHから受けたフェローシップに感謝します。CSIRから受けたフェローシップに感謝します。

緑膿菌のすべての分離細菌は、インドのバドーダラとジャイプールの医療微生物学研究所から入手しました。選択されたすべての臨床分離株はバイオセーフティキャビネット(BSL2)で取り扱われ、実験中の細菌分離株の取り扱いには細心の注意が払われました。すべての試薬/溶液の商品詳細は、材料表に記載されています。
1. クロムアズロールスルホン酸(CAS)色素および寒天培地の調製
<ol><li>CAS色素(100 mL)を以下の組成で調製します。<ol><li>60mgのCASを50mLの蒸留水に溶解する(溶液1)。</li>
		<li>2.7mgのFeCl3・6H2Oを10mLの10mM HCl(溶液2)に溶解する。</li>
		<li>73mgの臭化セトリモニウム(HDTMA)を40mLの蒸留水(溶液3)に溶解します。</li>
		<li>溶液1、溶液2、溶液3を慎重に混ぜます。ガラス瓶に保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>以下の手順に従ってCAS寒天を調製します。<ol><li>750mLの蒸留水に100mLのMM9塩溶液を加えます。</li>
		<li>32.24gのピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)遊離酸を溶解します。</li>
		<li>寒天15gを加える。オートクレーブして冷まします。</li>
		<li>30 mLの滅菌カサミノ酸溶液と10 mLの滅菌20%グルコース溶液を混合物に加えます。</li>
		<li>100 mLのCAS色素を加えて混合し、無菌状態で注いでいます。 注:MM9培地、カサミノ酸溶液、および8-ヒドロキシキノリンの調製は、 補足ファイル1に記載されています。PIPES緩衝液はpHに敏感です。pH 5.6に達するまで溶解しません。PIPESが水に溶け始めると、pHがさらに下がるため、pHを常に監視してください。クロロホルムに溶解した同量の3%8-ヒドロキシキノリンでカサミノ酸を抽出します。混ざり合わない溶液を4°Cで約20分間放置し、下相を乱さずに溶液の上相を慎重に回収します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. シデロフォア産生の定性分析
<ol><li>OD600 nmを0.2に設定し、 緑膿菌を24時間培養します。</li>
	<li>滅菌ワイヤーループを使用して、CAS寒天プレート上で細菌培養物をストリークします。</li>
	<li>30°Cで24時間インキュベートします。 注:ペプトン水培地または0.8%生理食塩水を使用して、細菌培養を希釈できます。24時間で細菌の増殖が観察されない場合は、CASプレートを48〜72時間インキュベートします。</li>
</ol>3. 全シデロフォアの定量的推定
<ol><li>緑 膿菌 の24時間培養培養物を、OD600 nmを0.25に調整した後、ペプトン水培地に再接種し、30°Cで48時間インキュベートします。</li>
	<li>48時間後、細菌培養物を4650 x g で室温で10分間遠心分離します。</li>
	<li>遠心分離後、100 μLの無細胞上清を96ウェルマイクロタイタープレートに添加し、100 μLのCAS色素を添加します。</li>
	<li>プレートをアルミホイルで覆い、室温で20分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、630 nmで分光光度測定値を取得します。</li>
	<li>全シデロフォアの定量化で得られた結果をパーセントシデロフォアユニット(PSU)として計算します。 注:PSUは次のように計算できます:[(Ar - As)/A r] x 100 ここで、Ar = 630 nmにおける基準の吸光度、As = 試料の無細胞上清の吸光度。参考までに、CAS色素を未接種のペプトン水培地に添加する必要があります。試験管、フラスコなどのすべてのガラス器具を6 M HClで2時間満たし、蒸留水で2回すすぎ、微量の鉄分を取り除きます。</li>
</ol>4. ピオベルジンの定量的推定
<ol><li>緑 膿菌 の24時間培養培養物を、OD600 nmを0.25に調整した後、ペプトン水培地に再接種し、30°Cで48時間インキュベートします。</li>
	<li>48時間後、さらに先に進む前に、細菌増殖のOD600 nmを測定します。</li>
	<li>細菌培養物を4650 x g で室温で10分間遠心分離します。</li>
	<li>遠心分離後、100 μL の無細胞上清を 96 ウェルマイクロタイタープレートに添加し、100 μL の 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)を添加します。</li>
	<li>OD405 nmで分光光度測定値を取得します。</li>
</ol>5. ピョーシュリン抽出と分光光度法
<ol><li>緑膿菌の24時間培養培養物をKing's B培地(補足ファイル1)に再接種し、OD600 nmを0.25に調整した後、30°Cで24時間インキュベートします。</li>
	<li>24時間後、100 mLの培養液を採取し、室温で4650 x g で10分間遠心分離します。</li>
	<li>遠心分離後、上清に1 Mクエン酸5 mLを加えます。50 mLの酢酸エチルで2回抽出します。</li>
	<li>硫酸マグネシウムで有機相をシリンジフィルターでろ過します。ろ過した有機相を-20°Cで保存します。</li>
	<li>320nmで分光光度法を読み取ります。 注:ピオケリンは室温で非常に不安定な化合物であるため、氷上で抽出プロセスを行ってください。フィルター分離には50 mLの滅菌シリンジを使用してください。シリンジの先端に綿を置き、その上に1グラムの硫酸マグネシウムを加えます。シリンジの先端に滅菌シリンジフィルターを固定し、濾液を滅菌チューブに集めます。</li>
</ol>

緑膿菌分離株からのシデロフォア産生の評価

<ol><li>Wang, J., Pontopolous, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+cellulatar+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron cellulatar metabolism.</a> Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).</li>
<li>Schalk, I., Perraud, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+its+multiple+strategies+to+access+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron.</a> Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).</li>
<li>Ghssein, G., Ezzeddine, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+Pseudomonas+aeruginosa+metallophores%3A+Pyoverdine%2C+pyochelin+and+pseudopaline%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline.</a> Biology. 11 (12), 1711(2022).</li>
<li>Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+iron+homeostasis+in+pseudomonas+aeruginosa+and+emerging+therapeutics+directed+to+disrupt+this+vital+process%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process.</a> Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).</li>
<li>Dingemans, P., Cornelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+adapts+its+iron+uptake+strategies+in+function+of+the+type+of+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).</li>
<li>Lin, J., Cheng, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudomonas+quinolone+signal+%28pqs%29%3A+Not+just+for+quorum+sensing+anymore%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).</li>
<li>Sass, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermicrobial+interaction%3A+Aspergillus+fumigatus+siderophores+protect+against+competition+by+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).</li>
<li>Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+production+by+pseudomonas+aeruginosa+exposed+to+metals+or+an+oxidative+stress+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Applications%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent.</a> Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+From+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+the+nonribosomal+peptide+synthetase+pvdd+from+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).</li>
<li>Geum-Jae-Jeong,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+virulence+attenuation+by+inhibiting+siderophore+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).</li>
<li>Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+between+apparently+redundant+iron-uptake+mechanisms+benefits+bacteria+in+changeable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments.</a> Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).</li>
<li>Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isochorismate+synthase+%28pcha%29%2C+the+first+and+rate-limiting+enzyme+in+salicylate+biosynthesis+of+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).</li>
<li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+blue+agar+cas+assay+for+siderophore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%26+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of blue agar cas assay for siderophore detection.</a> Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
<li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).</li>
<li>Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+microplate+method+%28biolog+mt2%29+for+detection+of+fusarium+fungicides+resistance%2Fsensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).</li>
<li>Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+pyoverdines%2C+pseudomonas+primary+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).</li>
<li>Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+metal+specificity+of+the+pseudomonas+aeruginosa+pyoverdine-iron+uptake+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway.</a> Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).</li>
<li>Brandel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+siderophore+of+pseudomonas+aeruginosa%3A+Physicochemical+characterization+of+the+iron%28iii%29%2C+copper+%28ii%29+and+zinc+%28ii%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes.</a> Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).</li>
<li>Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).</li>
<li>Cunrath, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogen+pseudomonas+aeruginosa+optimizes+the+production+of+the+siderophore+pyochelin+upon+environmental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges.</a> Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).</li>
<li>Ji, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+sensitive+LC%2FMS%2FMS+method+for+quantification+of+pyochelin+in+human+sputum+samples+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients.</a> Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).</li>
<li>Visaggio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+luminescent+biosensor+for+the+microvolumetric+detection+of+the+pseudomonas+aeruginosa+siderophore+pyochelin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).</li>
<li>Miethke, M., Marahiel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-bases+iron+acquisition+and+pathogen+control%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).</li>
<li>Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+and+syntheses+of+siderophores%2C+microbial+iron+chelators%2C+and+analogs+as+potential+drug+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents.</a> Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

このプロトコルにより、研究者は、細菌の無細胞上清から緑膿菌の総シデロフォアと2つの異なるシデロフォア、すなわちピオベルジンとピオケリンを定量化することができます。CAS寒天プレートアッセイでは、CAS色素とFe3+イオンが複合体を形成します。バクテリアがシデロフォアを生成すると、CAS-Fe3+複合体からFe3+イオンを消光し、バクテリアの増殖周囲に色の変化をもたらします。この変化により、細菌の増殖の周囲に透明なオレンジ色のハローが生じます14,15。バクテリアはCAS寒天プレートに直接ストリークすることができますが、全体的な結果に影響を与える可能性があります。多数のバクテリア細胞を縞模様にすると、バクテリアの成長の周囲に広いオレンジ色のハローが作成され、使用するバクテリアセルの数が少ないと、クリアゾーンが狭くなる可能性があります。これに対処するために、OD600を調整して均一な数の細菌細胞を縞模様にしました。潔癖な細菌は24時間で結果を示すことがありますが、成長の遅い細菌はシデロフォアの産生を示すのに72時間以上かかる場合があります。
全シデロフォアの定量的測定には、当初は古典分光法が採用されていましたが、シデロフォアの検出には大量の上清が必要であり、実用的ではありませんでした。現在、総シデロフォアの定量は、修飾されたCASアッセイを備えた96ウェルプレートを使用して実施されています。このアプローチにより、従来の分光法と比較して、試薬、細菌上清、時間が削減され、精度が向上しました16。他の研究でも、時間を節約し、より効率的な方法としてマイクロタイタープレートの使用が報告されています17。マイクロタイタープレートを用いた全シデロフォアの定量化は、効率的なアプローチであることが証明されています。この研究では、鉄を含まない培地で培養した48時間経過した細菌培養物を検査用に選択しました。また、ルリアブロス、ルリアブロス(3%8-ヒドロキシキノリンで抽出)、King's B培地(3%8-ヒドロキシキノリンで抽出)、ペプトン水培地(3%8-ヒドロキシキノリンで抽出)など、さまざまな増殖培地におけるシデロフォア産生を評価するための比較研究も実施しました。ペプトン水培地はシデロフォアの産生量が最も多いことが観察されたため、さらなる実験のために選択されました。異なる増殖培地におけるシデロフォア産生を示すグラフを補足図1に示します。
ピオベルジンは、分光蛍光測定値を使用して検出および定量できますが、蛍光を示すことが知られているのはピオベルジンのみです。Fe3+イオンとの錯体中のピオベルジンは蛍光を示さない18,19。ピオベルジンの検出と定量のために、48時間経過した細菌培養物を研究用に選択しました。緑膿菌は、初期の鉄飢餓条件下でピオケリンを産生することが知られており、重度の鉄ストレス条件にさらされるとピオベルジン産生に切り替わります。ピオベルジンは、アルミニウム、ガリウム、マンガン、クロムなどの他の金属陽イオンをキレート化できることが実証されているが、細胞膜にうまく輸送されるのは鉄だけである19。
総シデロフォアやピオベルジンと同様に、ピオケリンは無細胞上清から直接定量することはできず、ジクロロメタン20を使用して抽出する必要があります。ジクロロメタンは無細胞上清と混ざり合わず、底部に別の層を形成します。この研究では、ルリアブロス、ペプトン水、カサミノ酸培地など、さまざまな栄養培地をテストしましたが、かなりの量のピケリンがKing's B培地から得られました。HoogyらはプロトコルでCAA培地を使用していましたが、CAA培地は細菌の増殖をサポートしていないため、King's B培地で変更しました21。この方法は、8-ヒドロキシキノリンを含む栄養培地を抽出して培地から鉄残渣を除去し、鉄欠乏培地を作成することによってさらに変更されました。さらに、インキュベーション時間はピオケリン産生に有意な影響を与えることがわかった。Dumasらは、 緑膿菌 が厳しい鉄制限条件下でピオケリンからピオベルジン産生に切り替わることを実証した12。この研究では、48時間培養ではピオケリンが検出されなかったため、24時間経過した細菌培養からピオケリンの抽出と検出を行いました。上清の量もピケリンの検出に影響するため、抽出には 100 mL の無細胞上清を使用しました。さらに、MR1、TL7、およびJ3分離株では、おそらく強力な鉄キレート剤を持っているにもかかわらずピオベルジンを産生できない細菌株が原因で、ピオケリン産生が有意に高かった22。
Ji らは、ピオシュリン定量のための斬新で高感度なアプローチを導入し、LC/MS/MS を用いて検証しました。ただし、この方法は、嚢胞性線維症患者の喀痰から分離された 緑膿菌 にのみ適用されました。LC/MS/MSはコストのかかるセットアップであるため、ほとんどのラボでは手頃な価格ではない可能性があります23。Visggioらは、迅速で高感度なシングルステップのピオケリン定量を可能にする生物発光性全細胞ベースのバイオセンサーを開発しました。それにもかかわらず、この方法では、総シデロフォアとピオベルジン24の定量化はできない。
シデロフォア鉄取り込みシステムは、細菌の生存と病原性に重要な役割を果たすため、多剤耐性菌の薬物送達に抗菌薬として応用できる可能性があります。このアプローチは、多剤耐性菌と戦うための新しい方法を提供する可能性があります25。細菌の細胞膜を貫通できない薬物をシデロフォアに連結させることができ、得られたFe−シデロフォア複合体を細菌膜26の内部に輸送することができる。

生物は、電子輸送やDNA複製など、さまざまな重要な機能を果たすために鉄を必要とします1。 緑膿菌はグラム陰性日和見病原体であり、宿主に感染を確立する様々な病原性因子を有することが知られており、そのメカニズムの1つがシデロフォア形成である2。鉄が枯渇すると、 緑膿菌 はシデロフォアと呼ばれる特殊な分子を放出し、周囲の環境から鉄を消光します。シデロフォアは細胞外に鉄をキレート化し、得られた鉄−シデロフォア複合体は細胞3に積極的に輸送される。
緑膿菌は、ピオベルジンとピオケリンの2つのシデロフォアを産生することが知られています。ピオベルジンは鉄キレート親和性が高い(1:1)のに対し、ピオケリンは鉄キレート親和性が低い(2:1)ことが知られています4。ピョーシュリンは、鉄キレート親和性が低いため、二次シデロフォアとも呼ばれます5。シデロフォアの産生と調節は、緑膿菌6のクォーラムセンシング(QS)システムによって能動的に制御されています。
鉄の消光に加えて、シデロフォアは病原性因子の調節にも関与し、バイオフィルム形成に積極的な役割を果たします7。シデロフォアは、細胞シグナル伝達への関与、酸化ストレスに対する防御、微生物群集間の相互作用の促進など、さらに重要な役割を果たします8。シデロフォアは、通常、鉄をキレート化する特定の官能基に基づいて分類されます。この分類における3つの主要な二座配位子は、カテコール酸、ヒドロキサメート、およびα-ヒドロキシカルボン酸3です。ピオベルジンは、緑膿菌や蛍光蛍光菌などの蛍光シュードモナス種の特徴です5。それらは、6〜12個のアミノ酸を含むオリゴペプチドに結合した混合緑色蛍光発色団で構成されています。いくつかの非リボソームペプチド合成酵素(NRP)がそれらの合成に関与している9。ピオベルジンの産生と調節に関与する4つの遺伝子は、pvdL、pvdI、pvdJ、およびpvdD10です。ピオベルジンは、哺乳類の感染と病原性にも関与しています11。緑膿菌は中程度の鉄制限条件下でピオケリンを産生することが知られており、ピオベルジンは厳しい鉄制限環境で産生される12。ピケリン産生に関与する2つのオペロンは、pchDCBAとpchEFGHI13です。ピオシアニンの存在下では、ピオケリン(カテコール酸)が酸化的損傷および炎症を誘発し、宿主組織に有害なヒドロキシルラジカルを生成することが注目される11。
クロムアズロールスルホン酸(CAS)アッセイは、感度はあるものの特異性が高すぎる可能性のある微生物学的アッセイと比較して、その包括性、高感度、および利便性のために広く採用されています14。CASアッセイは、寒天表面または溶液中で実施できます。これは、第二鉄イオンが強い青色の錯体からオレンジ色に遷移するときに発生する色の変化に依存しています。CAS比色アッセイは、Fe-CAS界面活性剤の三元錯体からの鉄の枯渇を定量化します。金属、有機染料、界面活性剤からなるこの特定の錯体は青色をしており、630 nmで吸収ピークを示します。
本報告では、寒天プレート上のシデロフォアの産生を検出できるシデロフォア産生の定性検出法について紹介する。また、緑 膿菌由来の2つのシデロフォア(ピオベルジンおよびピオケリン)の検出および定量分析を行うマイクロタイタープレートにおける総シデロフォア産生量の定量的推定方法も提供される。

<table><tbody><tr><td>寒天、I型</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>8-ヒドロキシキノリン</td><td>ローバケ</td><td>ミー4151</td><td></td></tr><tr><td>カサミノ酸</td><td>SRLケミカルズ</td><td>68806</td><td></td></tr>セ<tr><td>チルトリメチル臭化アンモニウム(CTAB)</td><td>HIMEDIA</td><td>RM4867-100G</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>メルク</td><td>1070242521</td><td></td></tr><tr><td>クロムアズロールスルホン酸</td><td>HIMEDIA</td><td>RM336-10G</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>メルク</td><td>100241</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース 一水和物</td><td>メルク</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>メルク</td><td>107020</td><td></td></tr><tr><td>塩化第二鉄六水和物</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM6353</td><td></td></tr><tr><td>ガラスフラスコ</td><td>ホウロシル</td><td>5100021</td><td></td></tr><tr><td>ガラス試験管</td><td>ボロシル</td><td>9820U05</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>SDFCL</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>キングスミディアムBベース</td><td>HIMEDIA</td><td>M1544-500G</td><td></td></tr><tr><td>M9最小中塩HIMEDIA</td><td></td><td>G013-500G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム&nbsp;</td><td>Qualigens</td><td>10034</td><td></td></tr><tr><td>MultiskanGO UV分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>51119200</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン I型、細菌学</td><td>HIMEDIA</td><td>RM667-500G</td><td></td></tr><tr><td>パイプ 遊離酸</td><td>MP バイオメディカル</td><td>190257</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>メルク</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>プロテオース ペプトン</td><td>HIMEDIA</td><td>RM005-500G</td><td></td></tr><tr><td>島津製作所の紫外可視分光光度計</td><td>島津</td><td>2072310058</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Laborzentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3-18K</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Qualigens</td><td>15915</td><td></td></tr></tbody></table>

緑膿菌からのシデロフォア産生の定性的および定量的分析

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

緑膿菌 (P. aeruginosa)は、宿主に感染を確立するためにさまざまな病原性因子を産生することで知られています。そのようなメカニズムの1つは、シデロフォア生成による鉄の掃気です。 緑膿菌は 、鉄キレート親和性が低いピオケリンと、鉄キレート親和性が高いピオベルジンの2種類のシデロフォアを産生します。この報告は、ピオベルジンは細菌の上清から直接定量できるのに対し、ピオケリンは定量前に上清から抽出する必要があることを示しています。
シデロフォアの産生を定性的に分析するための主要な方法は、クロムアズロールスルホン酸(CAS)寒天プレートアッセイです。このアッセイでは、Fe3+-色素錯体からCAS色素が放出されると、青色からオレンジ色に色が変化し、シデロフォアの生成が示されます。総シデロフォアの定量のために、細菌上清をマイクロタイタープレートでCAS色素と等の割合で混合し、続いて630 nmで分光光度分析を行いました。ピオベルジンは、細菌上清を 50 mM Tris-HCl と等量ずつ混合し、分光光度分析を行うことにより、直接定量しました。380 nmのピークにより、ピオベルジンの存在が確認されました。ピオシュリンについては、細菌の上清から直接定量することができなかったため、最初に抽出する必要がありました。その後の分光光度分析により、313 nmにピークを持つピケリンの存在が明らかになりました。

臨床分離株からのシデロフォアの定量化の前に、シデロフォア産生の定性スクリーニングを実施して、シデロフォア産生を確実にしました。臨床分離株からのシデロフォアの定性的検出は、CAS寒天プレート上のストリーキング細菌によって観察されました。MR1、TL7、J3、およびPAO1(参照株)の3つの臨床分離株が研究のために選択されました。3つの臨床分離株とPAO1はすべて、シデロフォア産生に肯定的な結果を示し、青色寒天表面の細菌増殖の周りの透明なオレンジ色のハローは、シデロフォア産生が陽性であることを示しました(図1)。CAS寒天培地(図1)上のハロー形成は、臨床分離株によるシデロフォア産生の大まかな推定値を与えました。そこで、CAS試薬と液体培地を用いたシデロフォア産生の定量的推定を行った。
全シデロフォア定量は、無細胞上清から直接行いました。インキュベーション後、黄色がFe錯体からCAS色素が除去されたことを示す色の変化が観察されました。ここでは、未接種の増殖培地を用いるCAS色素をコントロールとして使用し、これをシデロフォアの計算に用いました。単離株MR1およびTL7では総シデロフォア産生に有意差はありませんでしたが、J3ではPAO1と比較して有意な総シデロフォア産生がありました(図2)。
次に、無細胞上清から直接ピオベルジン定量を行った。ピオベルジンは細胞環境で放出されるため、ピオベルジンの定量には無細胞上清を使用しました。分光光度計によるUVレンジスキャンも実施し、380 nmのピークでピオベルジンの存在が確認されました(図3A)。分光光度測定値は 405 nm で取得され、結果は OD405/OD600 nm と解釈されました。すべての分離株でピオベルジン産生が示され、分離株MR1およびJ3はPAO1と比較してピオベルジンが有意に低下しましたが、TL7では有意差は観察されませんでした(図3B)。
ピオシュリンは、無細胞上清から直接定量することはできません。無細胞上清1mLからピオケリンを抽出することができなかったため、無細胞上清100mLから抽出した。1Mクエン酸で酸性化した。ピョケリンは非常に不安定な化合物であるため、抽出工程は氷上で行いました。ピオケリンの検出は、300 nm から 600 nm の範囲で UV レンジスキャンを実行することによって行われ、OD320 nm のピークでピケリンの存在が確認されました(図 4A)。ピオシュランの定量は、OD320 nm で分光光度法による測定値を取得して行いました。OD320/OD600 で割って計算しました。単離株MR1、TL7、およびJ3は、参照単離株PAO1と比較して、ピオケリンの産生量が有意に高いことを示しました(図4B)。
種々の細菌増殖培地における比較シデロフォア産生を行い、種々の増殖培地で産生されるシデロフォアの総量を確認した。4つの異なる培地を選択し、ルリアブロス、キングスB培地、およびペプトン水を3%8-ヒドロキシキノリンで抽出し、未抽出のルリアブロスを研究用に選択しました。抽出ルリアブロス、King's B培地、ペプトン水培地ではシデロフォア産生に有意差は認められませんでしたが、未抽出ルリアブロスではシデロフォア産生に有意差が認められました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2.jpg"> 図1:CAS寒天培地上でのシデロフォアの作製。 24時間培養したCAS寒天プレート上での 緑膿菌 の増殖をCAS寒天プレート上にスポットし、30°Cで24時間インキュベートしました。シデロフォアの存在は、細菌コロニー(PAO1、MR1、TL7、およびJ3)の周囲のオレンジ色のハローによって示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2.jpg"> 図2:シデロフォアの総生産量。 PAO1 および 3 つの臨床分離株 (MR1、TL7、および J3) について、シデロフォアの総産生を評価しました。100 μLの無細胞上清(PAO1、MR1、TL7、およびJ3をペプトン水ブロス中で24時間増殖させたもの)を96ウェルマイクロタイタープレートに添加し、その後100 μLのCAS色素を添加しました。統計的有意性について一元配置分散分析検定を実施しました。エラーバーは±3つの生物学的反復間の標準偏差(SD)を表します。* p &lt; 0.05 に相当します。ns は p &gt; 0.05 に相当します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2.jpg"> 図3:ピオベルジンの生成。緑膿菌PAO1株および臨床分離株(MR1、TL7、およびJ3)のピオベルジン産生を、ペプトン水培地中で24時間増殖させた後に評価しました。細菌培養物を遠心分離し、100 μL の無細胞上清を 96 ウェルマイクロタイタープレートに添加しました。その後、100μLの50mMトリス-HCl(pH 8.0)を添加した。ピオベルジン検出は、350nm〜600nmの範囲のUV分光光度法によって行われました。380 nmのピオベルジン生成(A)での分光分析。ピオベルジン産生の定量化(B)。誤差範囲は、三重実験の平均に対する標準誤差を示します。エラーバーは±3つの生物学的反復間のSDを表します。p&lt;0.0001、**p&lt;0.01、nsはp&gt;0.05に対応します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2.jpg"> 図4:ピオシュランの産生。 酢酸エチルと硫酸マグネシウムによる抽出を用いたPAO1(参照用)および臨床分離株(MR1、TL7、およびJ3)のピオシュラン製造。230 nmから400 nm(A)の範囲の分光光度分析。ピオシュリン(B)の定量。各単離株について3つの独立した実験を実施しました。エラーバーは±3つの生物学的反復間のSDを表します。は、一元配置分散分析検定に基づく p &lt; 0.001 に相当します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足 図1:さまざまな細菌増殖培地におけるシデロフォア産生の比較。King's B培地、ペプトン水培地、およびルリアブロスを3%8-ヒドロキシキノリンで抽出して微量鉄を除去し、ルリアブロス(未抽出)を選択した4つの異なる増殖培地における総シデロフォア産生。3%8-ヒドロキシキノリンによる抽出は、等量量の3%8-ヒドロキシキノリンを培地に添加することによって行った。エラーバーは±3つの生物学的反復間のSDを表します。**一元配置分散分析検定に基づく p &lt; 0.001 に相当し、ns は p &gt; 0.5 に相当します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:本研究に用いた培地レシピ<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">ファイルを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは緑 膿菌からの総siderophores、pyoverdineおよびpyochelinの質的な、量的な分析を提供する。

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

シデロフォアは鉄と複合体を形成し、鉄制限条件下で鉄を細胞内に輸送します。シデロフォアは、宿主の重篤な感染の確立に役立つ強力な病原性因子であり、緑膿菌のクオラムセンシングを調節する役割を果たすことが知られています。本研究では、シュードモナスにおけるシデロフォア産生を定量的に推定することを目的としています。シデロフォアは細胞外分子であるため、ピオベルジンおよびピオケリンとともに、全シデロフォアは無細胞上清を用いて定量されます。ピケリンは少量では検出されないため、大量の無細胞上清から抽出します。最近では、ピケリンを定量するためのLCMSやバイオセンサーが開発されています。LCMSは小規模なラボではコストのかかる装置ですが、バイオセンサーはピオケリンの定量しかできません。このシンプルで図解されたプロトコルは、最小限の実験用試薬と機器を使用し、より短い時間で無細胞上清からのシデロフォアの推定を可能にします。

qualitative-quantitative-analysis-siderophore-production-from

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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生きた細菌におけるタンパク質とタンパク質相互作用のFLIM-FRET測定

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緑膿菌によって産生されるモノラムノリピッドおよびジラムノリピッドの検出と定量

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鉄飢餓および嫌気性増殖後の エルシニア偽結核 III型分泌系活性の定量化

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ラットの歩行の質的分析のための方法としてRotorodの使用

このビデオでは、ホルマリン固定パラフィン包埋材料からのDNA抽出のためのプロトコルを示しています。これは、組織切片をキシレンで脱パラフィンされている複数の日手続き、エタノールで再水和とその後の遺伝子特異的またはゲノムワイドな解析のためにDNAを精製し、分離するプロテイナーゼKで処理です。...

遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

学ぼう、緑膿菌のシデロフォア産生を定性的・定量的に分析する方法。分光光度法を用いてピオベルジンとピオケリンを測定し、細菌の鉄獲得と病原性メカニズムを解明する。

緑膿菌からのシデロフォア産生の定性的および定量的分析

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