Name: タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 学ぶ フローチャンバーの作り方とパラフィルムを用いたシーリング技術。直立型顕微鏡でのタイムラプスイメージングのための実験室手法を習得し、分解アクチンの動態観察に応用する方法を理解する。

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<ol><li>ビデオに示すように、フローチャンバーを構築します。パラフィルムでシールがタイトであることを確認して、洗浄カバースリップを使用してください。 </li><li> 50〜10&#39;のチャンバー内でインキュベートするアクチン結合剤。 </li><li>ブロッキング蛋白質のガラスカバースリップ上の非特異的結合部位をブロックする。 </li><li>バッファを重合でG -アクチンに流れることによりチャンバー内のアクチンを重合する。 </li><li>過剰なバッファに流れることによってウォッシュ未重合のアクチン。 </li></ol>

タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

本日は、正立顕微鏡でのイメージングに使用するフローチャンバー（融合チャンバー）の作製方法について説明します。まず、フィルムを用いて2つの空間を作成します。具体的には、パラフィルムを小さな帯状に切り出して使用します。次に、壁となるチャネルを形成します。傾斜させたエアダスターで乾燥させ、パラフィルムの上にカバーガラスを載せます。これで完成です。その後、ヒートブロックで加熱してパラフィルムを溶かし、密封します。こちらにあるのがカバーガラスで、その上に、ご覧の通り2層のフィルムが載っています。そしてさらにその上に、22 × 22 mmのカバーガラスが載っています。こちらにあるこのガラスをフィルムに押し当てて、封止を行いました。まず、液体はこちらの一方向から注入し、こちらの方向にあるフィルターペーパーで吸引して取り出します。その方法は後ほど説明します。私は通常、非常にシンプルな加湿チャンバーに入れる方法を推奨しています。2種類の嵩上げストリップを用意し、その下にフィルターペーパーを敷きます。また、ノイズを防ぐため、フローチャンバーにカバーガラスを被せます。チャンバーに溶液を導入する方法は、ピペットチップをチャンバーの入口に当て、そのまま分注することです。次に、蓋を閉めた状態でチャンバーを10分間インキュベートします。反対側から液体を吸い出すために通常行う方法は、フィルターペーパーをこのように細い帯状に切ることです。この細い帯状のペーパーを1本用意し、入口から溶液を注入しながら、同時に出口にフィルターペーパーを当てることで、溶液の交換（吸引）を行います。溶液が流れているのがわかります。その後、密閉されるまで5分間待ちます。次に、アクチンを導入します。アクチンは実際に重合させる必要がありますが、フローチャンバー内で重合させます。手順は先ほどと同じです。このようにしてアクチンが重合したため、ここからは大量のバッファーを用いて、未重合の過剰なアクチンをすべて洗い流します。ここでは約100 µLのバッファーを使用しており、これは反応チャンバー数回分の量に相当します。フィルターペーパーが飽和状態になったら、流す方向を変える必要があります。よろしいでしょうか。これでイメージングの準備が整いました。アクチンが固定された灌流チャンバーです。次にスライドを顕微鏡下にセットします。オイル浸漬対物レンズを使用してイメージングを行うため、カバーガラスの上面に浸漬オイルを滴下し、内部のアクチンに溶液やタンパク質などを添加できるようにします。したがって、タイムラプスイメージングの実施中に、溶液側を実際に交換することができます。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

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