タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視
2006年11月8日
さて、今日は、直立顕微鏡でイメージングするための融合チャンバーであるフローチャンバーの作り方をお見せしたいと思います。その後、フィルムを使って2つの空間を作ります。だから、パラフィルムを小さなストリップにカットします。
次に、これは基本的に壁のチャネルを形成し、傾いた空気でそれらを乾燥させます。パラの上にカバースリップを乗せて、出来上がったのがこちらです。次に、ヒートブロックで加熱してパラメータを溶かし、基本的にシールを作成します。
これが何であるかというと、ここのカバーガラスで、カバーガラスの上には、ここにあるようにフィムが2層になっています。そして、これに加えて、再び、22×2の2ミルメートルのカバースリップがあります。これはまさにここにあり、シールを落とすためにパラメータを押し付けました。
さて、液体はここで一方向に入り、ここの濾紙でこの方向に吸い出すことができます。そして、その方法を少しお見せします。ですから、私が好きなのは、加湿されたチャンバーに入れるのが好きで、これは非常に簡単です。
2種類の高架ストリップを取り、その下に紙のフィルターがあります。そして、それをうるさくしないように、フローチャンバーにカバー、カバースリップを付けます。さて、チャンバーに解決策を導入する方法は、ピペットの先端をチャンバーの入り口に置くだけで、分割するだけです。
今、私がしていることは、蓋を閉めた状態でチャンバーを10分間インキュベートすることです。私が通常、反対側から液体を吸い出すために行うことは、それを使用して、ろ紙を手に入れ、このように細いストリップにカットすることです。そして、この細いストリップの1つを取り、同時に溶液を入り口に塗布すると同時に、出口に濾紙を置いて交換液である溶液を吸い込みます。
そのため、溶液を液体が流れているのがわかります。そして、ミッドクローズまで5分待ちます。今、私がやるべきことは、アクチンとアクチンを実際に置くことです、私は実際に重合する必要があります、私はフローチャンバー内で重合します、そしてそれは以前とまったく同じ手順です。
このように、作用が重合するようになったので、大量のジャストバッファーを使用して、余分な未重合作用をすべて洗い流します。ここには約100マイクロリットルがあり、反応チャンバーの容量が数個分のバッファーです。ただ、濾紙が飽和状態になると、方向を変えなければなりません。大丈夫です。
そして、これでイメージングを行う準備が整いました。つまり、アクチンが付着した灌流チャンバーです。次に、スライドを顕微鏡の下に取り付け、オイル対物レンズでイメージングしているので、カバーの上面に浸漬オイルを塗り、草に触れるようにして、溶液やタンパク質など、内部で作用するものを評価します。
だから、私がやっているのは、タイムラプスイメージングをしながら、実際にソリューション側を交換することができるということです。そのように。
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概要
この記事は、直立式顕微鏡でのイメージング用にフローチャンバーとフュージョンチャンバーの構築を示しています。このプロセスには、パラフィルムを使用してチャンネルを作成し、熱で密封することが含まれます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
背景
- フローチャンバーは様々なイメージング技術に不可欠です。
- フュージョンチャンバーの構築により、強化されたイメージング機能が可能になります。
- パラフィルムは実験室でシールを作成するために一般的に使用されています。
- 構築プロセスの理解は、この分野の研究者にとって重要です。
研究目的
- フローチャンバーの構築に関するステップバイステップのガイドを提供すること。
- イメージングチャンバーの作成におけるパラフィルムの使用を示すこと。
- 研究者のためのイメージング技術のアクセシビリティを向上させること。
使用した方法
- パラフィルムを細い帯に切り、チャンネルを形成すること。
- 傾けた空気で帯を乾燥させること。
- パラフィルムの上にカバースリップを置くこと。
- ヒートブロック上で組立物を加熱し、シールを作成すること。
主な結果
- 機能的なフローチャンバーが正常に構築されました。
- シールプロセスはイメージングのための安定した環境を作り出すのに効果的でした。
- 示された方法は実験室での使用に再現可能です。
- 研究者は様々なイメージング用途にこの技術を利用できます。
結論
- フローおよびフュージョンチャンバーの構築は簡単です。
- この方法は高度なイメージング研究を促進できます。
- このような技術へのアクセスは研究成果を向上させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
