Name: Smart Leginon を使用した複数のグリッドにわたるクライオ電子顕微鏡スクリーニングの自動化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 学ぼう、Smart Leginonを用いたクライオ電子顕微鏡の複数グリッド自動スクリーニング手法。Ptolemyアプリケーションと機械学習を活用し、手動作業時間を大幅に削減して効率的なサンプル条件の最適化を実現する。

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この研究の一部は、サイモンズ財団(SF349247)、NIH(U24 GM129539)、およびニューヨーク州議会の支援を受けて、ニューヨーク構造生物学センターのサイモンズ電子顕微鏡センターで実施されました。

Smart Leginon Autoscreenによる高分子構造解析の加速

<ol><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257(2018).</li>
<li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+grid+optimization+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM grid optimization for membrane proteins.</a> iScience. 24 (3), 102139(2021).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+collection+of+high-resolution+cryo-EM+datasets+using+200+KV+transmission+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. 181, 63519(2022).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+multi-grid+cryoEM+screening+using+Smart+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon.</a> IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).</li>
<li>Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+automate+cryo-electron+microscopy+data+collection+with+Ptolemy%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy.</a> IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).</li>
<li>Bepler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+data+collection+for+CryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Smart data collection for CryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913(2022).</li>
<li>Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+systematic+evaluation+of+cryo-EM+specimens+with+SmartScope%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope.</a> eLife. 11, e80047(2022).</li>
<li>Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+EPU%3A+SPA+Getting+Intelligent%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Smart EPU: SPA Getting Intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).</li>
<li>Fan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoRL%3A+Reinforcement+learning+enables+efficient+cryo-EM+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection.</a> arXiv. , (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+path+planning+surpasses+human+efficiency+in+cryo-EM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging.</a> bioRxiv. Biophysics. , (2022).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+An+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).</li>
<li>Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+seeing+molecules+in+cells%2C+CZ+Imaging+Institute%27s+Hardware+Frontiers+for+CryoET+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22CZ+Imaging+Institute%27s+Hardware+Frontiers+for+CryoET+Workshop%22%5BJournal%5D)">The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop.</a> CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , https://chanzuckerberg.com/science/meetings/hardware-frontiers-cryoet-workshop/ (2023).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopic+grid+preparation+for+time-resolved+studies+using+a+novel+robotic+system%2C+Spotiton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton.</a> Journal of Visualized Experiments. 168, 62271(2021).</li>
<li>Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+a+paradigm+shift+in+CryoEM+sample+preparation+with+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。

このプロトコルでは、Smart Leginon Autoscreenのパイプラインと、収集ソフトウェアを初めて使用する人のための基本的なLeginonの使用法について説明します。単粒子クライオ電子顕微鏡は、2024年末までに最も生産性の高い3次元(3D)タンパク質構造分解技術になる態勢を整えています17。単粒子クライオ電子顕微鏡パイプラインは、データ品質とスループットを向上させるために常に最適化されているいくつかのステップで構成されています。 図 2 は、最も一般的なステップ(サンプル調製、グリッド調製、スクリーニング時間と労力、高分解能収集時間、ライブ処理、完全な後処理)と、改善可能なパイプラインのその他のコンポーネント(スクリーニング顕微鏡へのアクセス、ステージの速度と精度、カメラの速度、高解像度顕微鏡へのアクセス)を示しています。ほとんどのステップの結果は、前のステップへのフィードバックループになり( 図2の青い矢印)、パイプライン全体が高度に相互依存します。 図 2 の各ステップは、他のステップと比較してボトルネックの程度を概算するために色分けされています。Smart Leginon Autoscreenは、12グリッドのスクリーニングにかかるオペレーターの時間と労力を6時間から10分未満に大幅に削減し、ボトルネックを解消し、サンプル/グリッド調製へのフィードバックをより迅速に行うことができます(図3)。
プロトコルには、 図1に示すいくつかの重要なステップがあります。テンプレート・セッションの作成に使用されるグリッドは、スクリーニングされる残りのグリッドを代表するものであることが重要です。重要なのは、Leginonはテンプレートセッションを作成するためのセットアッププロセス全体のすべての設定を記憶しているため( 図1の青いステップ)、繰り返しのテンプレートセッションを毎回より迅速にセットアップできることです。テンプレートセッションを作成する際の最も重要なステップは、すべての倍率でターゲット設定を行い、パラメーターとしきい値がスクリーニング対象のグリッド間で予想される変動を反映するようにすることです。さまざまな「テスト」ボタンにより、このセットアッププロセスを効率化できます。オートスクリーンセッション中は、Appionの最初の数グリッドを監視して、問題を迅速に検出し、Leginon 内でできるだけ早く修正することが重要です。
SEMCの典型的なワークフローは、オートスクリーニングデータをCryoSPARC Live18 に供給し、この追加情報を使用して、サンプル/グリッド調製へのフィードバックループを通知することです。研究者とオペレーターが集中的にクライオ電子顕微鏡を最適化する日には、サンプルとグリッドの状態に関する情報がサンプルとグリッドの調製にフィードバックされますが、Autoscreenはグリッドをスクリーニングしています。これにより、週に数十のグリッドを凍結してスクリーニングすることができます8。
Smart Leginon Autoscreenは、SEMCで観察される穴の開いたグリッドと条件の大部分(80%-90%)で機能します。残りの10%〜20%のグリッドには、穴と基板のコントラスト差が最小のグリッドなど、うまく機能しないグリッドが含まれます。穴や間隔が小さいグリッド(例:0.6/0.8)や、複数のグリッドをターゲットにすることが現実的でないグリッド - Spotiton/Chameleon グリッドを横切るサンプルの縞模様で構成される19,20グリッド。レイシーグリッド。自動スクリーンを使用した傾斜グリッドコレクションは開発中ですが、まだ利用できません。最初にストライプの領域を手動でイメージングして狭いパラメータしきい値を決定し、次にステップ2.1.7.4でそれぞれ大きな正方形と小さな正方形をグループ化し、次にiceのグループからターゲットを選択することで、Spotiton/Chameleonグリッドで動作するようにプロトコルを変更できる場合があります。この変更の目的は、Smart Leginon で空の正方形と空でない正方形を 2 つのグループに分離することです。パラメータが見つかった場合、スクリーニングされる残りのグリッドにうまく拡張されない可能性があります。また、手順2.1.9.1でhl_finding.shスクリプトを削除し、必要に応じて明るい/暗い領域をターゲットにするようにパラメータを設定することで、レイシーグリッドで動作するようにプロトコルを変更することもできます。この修正の成功率は、氷の厚さとグリッド材料に基づいてグリッドごとに異なる場合があります。
自動スクリーニングセッション中のトラブルシューティングは可能であり、適切な場合もあります。プリセット(デフォーカスなど)とターゲットパラメータ(穴ターゲットしきい値など)の変更は、自動収集中に行うことができます。自動スクリーン・セッションの収集中は、グリッド・セッションは autoscreen.py 終了するため、キャンセルできません。ただし、ターゲットノードの「中止」ボタンを使用して、グリッドの一部または全体をスキップできます。時折、autoscreen.py メモリを使いすぎてフリーズすることがあり、「強制終了」または「待機」の2つのオプションが提供されます。「強制終了」を選択すると、スクリプト全体が終了し、ユーザーはスクリプトを再実行して残りのグリッドに適用してスクリーニングを行う必要があります。'wait' が選択されている場合、スクリプトは続行され、Exposure ノードで画像表示をオフにしたり、アトラスでピクセルサイズを小さくしたり、メモリクリアスクリプトを実行したりするなど、将来のフリーズを防ぐために設定を変更することができます。2つのオプションを提示せずにプログラムがフリーズすると、メモリエラーが自然に解決されず、集録が一時停止する可能性があります。この場合、「強制終了」オプションが役立つ場合があります。
Smart Leginon Autoscreenは、SEMCで定期的に使用されています。単粒子クライオ電子顕微鏡パイプラインのボトルネックが減り続けるにつれて、クライオ電子顕微鏡の採用は生物学的な疑問に答えるために増加し続けるでしょう。このプロトコルは、フィードバックループを大幅に削減するための明確なパスを提供することにより、パイプライン全体を最適化する方向への一歩です。

単粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)は、精製された高分子複合体の原子分解能に近い構造決定を可能にします。単一粒子クライオ電子顕微鏡実験では、サンプルとグリッド条件が異なる、はるかに大きなグリッドセットから選択された1つまたは2つのグリッドのみが必要です。これらのグリッドを調べるための顕微鏡スクリーニングでは、各グリッドを数倍でイメージングし、氷の厚さ、完全なデータ収集のための十分な面積、タンパク質の純度、タンパク質濃度、タンパク質の安定性、および最小優先配向の問題など、高解像度データ収集の最も重要な要件を満たすグリッドを決定します1.これらの重要な要件に合わせて最適化するには、多くの場合、顕微鏡でのスクリーニングと、タンパク質産生、バッファーの選択、界面活性剤の候補、グリッドタイプ2、3、4 などの調製条件との間のフィードバックが必要です(図1)。従来のグリッドスクリーニングは、Leginon5、SerialEM6、EPU7などのソフトウェアを使用して手動または半手動で行われます。従来のスクリーニングでは、顕微鏡オペレーターが顕微鏡で何時間もかけて複数のグリッドをスクリーニングする必要があり、サンプル/グリッドの最適化ではなく、オペレーターを暗記操作に費やすため、高解像度の単粒子ワークフローに大きなボトルネックが生じていました。
以前、Smart Leginon Autoscreenと基礎となる機械学習ソフトウェアであるPtolemyを紹介し、その基礎となる方法とアルゴリズムを例とともに説明しました8,9。SmartScope11、Smart EPU12、CryoRL13,14など、他のいくつかのソフトウェアパッケージは、完全に自動化されたマルチグリッドスクリーニング10が可能であるか、またはそれに向けて機能しています。スクリーニングのボトルネックに対処するために、Smart Leginonでは、まずテンプレート顕微鏡セッションでスクリーニングパラメータを設定し、次にそのテンプレートセッションのパラメータをテンプレートとして使用して、顕微鏡オートローダーでグリッドのフルカセットをスクリーニングすることができます。カセットスクリーニング中の手作業がすべて排除されるため、最適化のフィードバックループが大幅に効率的に進行します。
このプロトコルでは、読者が完全に自動化されたマルチグリッドクライオ電子顕微鏡スクリーニングを独立して実行できるように、完全なSmart Leginon Autoscreenワークフローが説明されています。Leginonを初めて使用する人のために、プロトコルの最初のセクションでは、従来のLeginonの使用法について説明します。この知識は、複数のオートローダー顕微鏡での数年間の経験から構成されており、プロトコルの次のSmart Leginonセクションで構築されています。その他のチュートリアルビデオは、https://memc.nysbc.org にあります。

<table><tbody><tr><td>氷河クライオTEM&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>GLACIOSTEM</td><td>FEG、200 keV、Falcon 3ECカメラ&nbsp;</td></tr><tr><td>Krios cryoTEM&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>KRIOSG4TEM</td><td>XFEG、300 keV、&nbsp;Gatan BioQuantumエネルギーフィルター、Gatan K3カメラ&nbsp;</td></tr><tr><td>レギノン&nbsp;</td><td>サイモンズ電子顕微鏡センター&nbsp;</td><td></td><td>http://leginon.org&nbsp; (英語)</td></tr><tr><td>プトレマイオス&nbsp;</td><td>サイモンズ機械学習センター&nbsp;</td><td></td><td>https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy&nbsp;</td></tr></tbody></table>

smart leginon を使用した複数のグリッドにわたるクライオ電子顕微鏡スクリーニングの自動化

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

過去10年間のクライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)技術の進歩により、構造生物学者は高分子タンパク質複合体を原子に近い分解能で日常的に分離できるようになりました。クライオ電子顕微鏡パイプライン全体の一般的なワークフローでは、高分解能データ収集に移る前に、サンプル調製、クライオ電子顕微鏡グリッド調製、サンプル/グリッドスクリーニングを繰り返します。サンプル/グリッド調製とスクリーニングの繰り返しは、すべての反復実験で、サンプル濃度、バッファー条件、グリッド材料、グリッドホールのサイズ、氷の厚さ、氷中のタンパク質粒子の挙動などの変数を最適化する必要があるため、研究者にとって通常、大きなボトルネックとなります。さらに、これらの変数が十分に決定されると、同じ条件下で準備されたグリッドは、データ収集の準備ができているかどうかで大きく異なるため、高解像度のデータ収集に最適なグリッドを選択する前に、追加のスクリーニングセッションが推奨されます。このサンプル/グリッドの調製およびスクリーニングプロセスでは、多くの場合、数十グリッドと数日分のオペレーターが顕微鏡で作業する時間が消費されます。さらに、スクリーニングプロセスは、オペレーター/顕微鏡の可用性と顕微鏡へのアクセス性に限定されます。ここでは、LeginonとSmart Leginon Autoscreenを使用してクライオ電子顕微鏡グリッドスクリーニングの大部分を自動化する方法を紹介します。Autoscreenは、機械学習、コンピュータービジョンアルゴリズム、顕微鏡処理アルゴリズムを組み合わせて、オペレーターが常に手動で入力する必要をなくします。Autoscreenは、自動検体交換カセットシステムを使用して、マルチスケールイメージングでグリッドを自律的にロードしてイメージングできるため、カセット全体の無人グリッドスクリーニングが可能になります。その結果、12グリッドをスクリーニングするオペレーター時間は、グリッド間の大きな変動性を考慮できないために妨げられていた以前の方法を使用した~6時間と比較して、自動スクリーニングを使用すると~10分に短縮できます。このプロトコルでは、まずLeginonの基本的なセットアップと機能を紹介し、次にテンプレートセッションの作成から12グリッドの自動スクリーニングセッションの終了まで、自動スクリーニング機能を段階的にデモンストレーションします。

プロトコルに従って、クライオ電子顕微鏡スクリーニングセッションは、穴の開いたグリッドと条件の大部分(80%-90%)に対して自動的かつ正常に実行できます。Smart Leginon Autoscreenセッションの成功の期待される結果を実証するために、以前にいくつかの例と実験が提示されています8,9。成功したオートスクリーンセッションは、セットアップの~10分から始まり、通常、約6時間(グリッドあたり30分)後に自動的にスクリーニングされる12グリッドのフルカセットで、異なるサイズの3〜5個の正方形と正方形あたり3〜5個の穴が高倍率で画像化され、ユーザーは各グリッド上のサンプルの特性をすばやく決定し、サンプル/グリッド条件を迅速に反復できます(図3).時折、セッションが失敗することがありますが、その原因は、壊れた正方形をターゲットにした自動スクリーニング、グリッド全体または正方形全体の大きな氷の厚さの勾配を適切に解釈しない、またはカーボングリッド上の穴を適切に識別できないことです。さらに、メモリリークが発生すると、メモリ使用量が多すぎるためにLeginonがクラッシュする可能性がありますが、これはRAMを解放するか、コンピュータを再起動するか、コンピュータにRAMを追加することで改善できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig01.jpg"> 図1:Smart Leginon AutoscreenのワークフローSmart Leginon Autoscreenワークフローの概要。まず、スクリーニングするグリッドのバッチ内の代表的なグリッドのパラメータを選択することにより、テンプレートセッションが作成されます。Leginonのセットアップとテンプレートセッションの作成には45分もかかりません。第 2 に、自動スクリーンは、テンプレート・セッション・パラメーターを使用してカセット内のすべてのグリッドをスクリーニングするように設定されています。自動スクリーンの設定には10分もかかりません。最後に、自動スクリーンはスクリーニングセッションを終了します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig02.jpg"> 図2: 自動スクリーニング前の従来の単粒子クライオ電子顕微鏡パイプライン。自動スクリーニング前の従来の単粒子クライオ電子顕微鏡パイプラインの最も一般的なステップと、改善可能な成分。各ステップは、そのステップが他のステップと比較してどの程度のボトルネックであるかを概算するために色分けされています。青い円形の矢印は、ほとんどのステップ間のいくつかのフィードバック ループを表します。いくつかのステップでのスループットは、サンプル、資金、および研究者の所在地に大きく依存します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig03.jpg"> 図3:Smart Leginon Autoscreenの代表的な結果。BioQuantumエネルギーフィルターとK3カメラを備えたTFS KriosクライオTEMで収集されたSmart Leginon Autoscreenプロトコルに従った代表的なマルチスケール画像。(A)クライオ電子顕微鏡グリッドの概要を示す合成「アトラス」画像。(B-F)グリッドアトラス内の指定された位置からのマルチスケール画像。1列目の低倍率画像、2列目の中倍率画像、3列目の高倍率画像をそれぞれ自動的に選択し、薄い氷の正方形から厚い氷の正方形まで試料に関する情報を得た。レギノンが推定した氷の厚さは底面に示されています。スケールバーは、(A)が500μm、1列目が10μm、2列目が5μm、3列目(B-F)が100nmです。この図は、Cheng et al.8の許可を得て変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>gr: グリッド</td>
			<td>sq: 正方形</td>
			<td>hln: 穴</td>
			<td>ファン:オートフォーカス</td>
			<td>fcn:セントラルフォーカス</td>
			<td>enn: 露出 </td>
		</tr><tr><td>拡大</td>
			<td>210</td>
			<td>2600</td>
			<td>6700</td>
			<td>120000</td>
			<td>120000</td>
			<td>120000</td>
		</tr><tr><td>デフォーカス</td>
			<td>-0.0002</td>
			<td>-0.00015</td>
			<td>-0.00015</td>
			<td>-2×10-06 </td>
			<td>-7×10-07 </td>
			<td>△2.5×10-06 </td>
		</tr><tr><td>スポットサイズ</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>4</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>強度</td>
			<td>1.1</td>
			<td>0.83</td>
			<td>0.65</td>
			<td>0.44</td>
			<td>0.44</td>
			<td>0.45</td>
		</tr><tr><td>次元 </td>
			<td>1024×1024</td>
			<td>1024×1024</td>
			<td>1024×1024</td>
			<td>1024×1024</td>
			<td>1024×1024</td>
			<td>4096×4096</td>
		</tr><tr><td>相殺</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>512, 512</td>
			<td>0, 0</td>
		</tr><tr><td>ビニング</td>
			<td>4×4</td>
			<td>4×4</td>
			<td>4×4</td>
			<td>4×4</td>
			<td>2×2</td>
			<td>1×1</td>
		</tr><tr><td>露光時間(ms)</td>
			<td>200</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>曝露前</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>線量 (e/Å2)</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>36.5</td>
			<td>36.5</td>
			<td>64.7</td>
		</tr><tr><td>生のフレームを保存</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
		</tr></tbody></table>表1:Simons Electron Microscopy Center(SEMC)で、Falcon 3ECカメラを搭載したGlaciosクライオTEMを使用したクライオ電子顕微鏡グリッドスクリーニングのプリセットパラメータ。 SEMCのFalcon 3ECカメラを搭載したGlaciosクライオTEMで一般的に使用される各プリセットのパラメータを示します。顕微鏡が異なれば、利用できる倍率も異なり、実験によって、焦点ぼけや露光時間などのパラメータも異なります。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>gr: グリッド</td>
			<td>sq: 正方形</td>
			<td>hln: 穴</td>
			<td>ファン:オートフォーカス</td>
			<td>fcn:セントラルフォーカス</td>
			<td>enn: 露出 </td>
		</tr><tr><td>拡大</td>
			<td>64</td>
			<td>1700</td>
			<td>2850</td>
			<td>75000</td>
			<td>75000</td>
			<td>75000</td>
		</tr><tr><td>デフォーカス</td>
			<td>0</td>
			<td>-5×10-05 </td>
			<td>-5×10-05 </td>
			<td>-1×10-06 </td>
			<td>-7×10-07 </td>
			<td>-2×10-06 </td>
		</tr><tr><td>スポットサイズ</td>
			<td>6</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>強度</td>
			<td>0.001</td>
			<td>1.65×10-05 </td>
			<td>1.5×10-05 </td>
			<td>4.3×10-07 </td>
			<td>4.3×10-07 </td>
			<td>5.5×10-07 </td>
		</tr><tr><td>エネルギーフィルター幅</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>次元</td>
			<td>1024×1024</td>
			<td>1024×1024</td>
			<td>1024×1024</td>
			<td>1024×1024</td>
			<td>2048×2048</td>
			<td>4096×4096</td>
		</tr><tr><td>相殺</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
		</tr><tr><td>ビニング </td>
			<td>4×4</td>
			<td>4×4</td>
			<td>4×4</td>
			<td>4×4</td>
			<td>2×2</td>
			<td>1×1</td>
		</tr><tr><td>露光時間(ms)</td>
			<td>500</td>
			<td>2000</td>
			<td>1000</td>
			<td>500</td>
			<td>300</td>
			<td>8700</td>
		</tr><tr><td>曝露前</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>線量 (e/Å2)</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>47.4</td>
		</tr><tr><td>生のフレームを保存</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
		</tr></tbody></table>表2:Selectris XおよびFalcon 4iカメラを搭載したKriosクライオTEMを使用したSEMCでのクライオ電子顕微鏡グリッドスクリーニングのプリセットパラメータ。 SEMCのSelectris XエネルギーフィルターとFalcon 4iカメラを搭載したKriosで一般的に使用される各プリセットのパラメーターを示します。顕微鏡が異なれば、利用できる倍率も異なり、実験によって、焦点ぼけや露光時間などのパラメータも異なります。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>gr: グリッド</td>
			<td>sq: 正方形</td>
			<td>hln: 穴</td>
			<td>ファン:オートフォーカス</td>
			<td>fcn:セントラルフォーカス</td>
			<td>enn: 露出 </td>
		</tr><tr><td>拡大</td>
			<td>1550</td>
			<td>940</td>
			<td>2250</td>
			<td>81000</td>
			<td>81000</td>
			<td>81000</td>
		</tr><tr><td>デフォーカス</td>
			<td>0</td>
			<td>-5×10-05 </td>
			<td>-5×10-05 </td>
			<td>-1×10-06 </td>
			<td>-7×10-07 </td>
			<td>-2×10-06 </td>
		</tr><tr><td>スポットサイズ</td>
			<td>4</td>
			<td>8</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>強度</td>
			<td>0.0015</td>
			<td>0.00017</td>
			<td>7.3×10-05 </td>
			<td>1.3×10-06 </td>
			<td>1.3×10-06 </td>
			<td>9.2×10-07 </td>
		</tr><tr><td>エネルギーフィルター幅</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>50</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>次元</td>
			<td>1024×1024</td>
			<td>1440×1024</td>
			<td>1440×1024</td>
			<td>1440×1024</td>
			<td>1008×1008</td>
			<td>5760×4092</td>
		</tr><tr><td>相殺 </td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>936, 519</td>
			<td>0, 0</td>
		</tr><tr><td>ビニング</td>
			<td>4×4</td>
			<td>8×8</td>
			<td>8×8</td>
			<td>8×8</td>
			<td>4×4</td>
			<td>2×2</td>
		</tr><tr><td>露光時間(ms)</td>
			<td>250</td>
			<td>600</td>
			<td>600</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>2100</td>
		</tr><tr><td>曝露前</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>線量 (e/Å2)</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>51</td>
		</tr><tr><td>生のフレームを保存</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
		</tr></tbody></table>表3:BioQuantumおよびK3カメラを搭載したKriosクライオTEMを使用したSEMCでのクライオ電子顕微鏡グリッドスクリーニングのプリセットパラメータ。 SEMCのBioQuantumエネルギーフィルターとK3カメラを備えたKriosで一般的に使用される各プリセットのパラメーターが示されています。顕微鏡が異なれば、利用できる倍率も異なり、実験によって、焦点ぼけや露光時間などのパラメータも異なります。
補足図1:Smart Leginonのスクエアターゲティング設定とスクエア設定 (A)スクエア ターゲティング設定。(B)正方形の設定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(1).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:Smart Leginonの穴ターゲット設定と穴設定。 (A)穴のターゲット設定。(B)穴の設定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(2).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図3:Smart Leginonの露出ターゲティング設定と露出設定 (A)露出のターゲット設定。(B)露出設定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(3).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図4:Smart Leginonのフォーカス設定とフォーカスシーケンス設定 (A)フォーカス設定。(B)フォーカスシーケンス設定(デフォーカス1)。(C)フォーカスシーケンス設定(デフォーカス2)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(4).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図5:Smart LeginonのZ_Focus設定とZ_Focusシーケンス設定 (A)Z_Focus設定。(B)Z_Focusシーケンス設定(Stage_Tilt_Rough)。(C)Z_Focusシーケンス設定(Stage_Tilt_Fine)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(5).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図6:Smart Leginon Square_Targetingパラメータを設定した後のアトラスの例。 青い円はブロブ、緑のプラス記号は取得場所、茶色の「x」は現在のステージ位置です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(6).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図7:Smart Leginon Hole_Targetingパラメータを設定した後のアトラスの例。 紫色のプラス記号は格子の位置、ボックス付きの緑色のプラス記号は取得位置、青色のプラス記号はフォーカス位置です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(7).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図8:Smart Leginon Exposure_Targetingパラメータを設定した後のアトラスの例。 青色の円はブロブ、緑色のプラス記号は取得位置、青色のプラス記号はフォーカス位置です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(8).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図9:Smart Leginon Autoscreen端末のセットアップ<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(9).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図10:Smart Leginon AutoscreenのGUI設定<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(10).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)のマルチグリッドスクリーニングは、多くの場合、何時間もの注意を必要とする退屈なプロセスです。このプロトコルでは、このプロセスを自動化するために、標準の Leginon コレクションと Smart Leginon Autoscreen を設定する方法を示します。このプロトコルは、大部分のクライオ電子顕微鏡穴埋めグリッドに適用できます。

Smart Leginon を使用した複数のグリッドにわたるクライオ電子顕微鏡スクリーニングの自動化

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

サイモンズ電子顕微鏡センターでは、優れた電子顕微鏡サービス、専門知識、トレーニングを国内外の研究者に提供し、ワークフローを最適化する革新的な方法を開発することを目指しています。当社の範囲は、サービス、開発、機械学習、生物医学研究をカバーしています。私たちは、どうすればサービスをよりよく最適化できるのか、その答えを出そうとしています。機械学習は電子顕微鏡の分野を変えています。データ収集は自動化されつつあります。データ分析ツールは急速に効率化しています。これには、画像のノイズ除去、粒子ピッキング、3G柔軟性分析、モデル構築が含まれます。私たちは、さまざまなグリッドホール、傾いたコレクション、本番環境でのベータテストソフトウェアで特定されたバグなど、さまざまな状況を考慮してソフトウェアを定期的に更新しています。また、ユーザーからのフィードバックも統合し、ユーザーに役立つ機能を継続的に提供しています。Smart Leginon は、クライオ TEM 上の 1 つまたは複数のグリッドをスクリーニングするという、労働集約的で時間のかかるタスクに対処します。これにより、オペレーターや研究者はグリッドをより迅速にスクリーニングおよび分析できるようになり、グリッドとサンプルの状態を並行して最適化する時間を確保できます。これにより、顕微鏡の時間とコストも削減されます。Smart Leginon オートスクリーンは、12 グリッドのスクリーニングを設定するのに約 10 分かかる、完全に無人のマルチグリッドスクリーニングを提供します。手作業によるスクリーニングと比較して、当社のプロトコルは1日あたり数時間の節約になります。Smart Leginonの導入以来、同様の自動化のために他のフリーソフトウェアや商用ソフトウェアが開発されてきました。

cryo-electron-microscopy-screening-automation-across-multiple-grids

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々は、分子機械のその場構造で高解像度を決定するために、ハイスループット低温電子断層撮影法を利用する方法のプロトコルを提示します。プロトコルは、処理すべき大量のデータを可能にし、一般的なボトルネックを回避し、ユーザは、重要な生物学的問題に集中することができ、リソースのダウンタイムを減少させます。...

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル...

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

ここで提示されるプロトコルは、液体クライオゲンのガラス化の前に最低90ミリ秒混合する自己ウィッキング、ナノワイヤーグリッドに関心のある2つのサンプルを提供するために、新しいロボットシステムであるSpotitonを使用することを説明しています。...

新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備

このプロトコルは、クライオ構造の照明顕微鏡を用いて、生物学的に凍結保存されたサンプルを画像化する方法を示す。U2OS細胞の細胞骨格をイメージングして方法論を実証する。...

極低温保存細胞からの微視的データ収集

集束イオンビームミリングを使用して、凍結した生物学的サンプルを急落させてクライオ電子線トモグラフィー用にガラス体オングリッドラメラを作成します。...

クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

cryoEMを用いた高分子複合体の構造決定は、ある種のタンパク質や複合体に対して日常的なものとなっている。ここでは、このパイプラインが要約され(サンプルの準備、スクリーニング、データの取得と処理)、読者は、より困難な標本の場合に変更される可能性があり、さらに詳細なリソースと変数に向けられています。...

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

単粒子のクライオ電子顕微鏡では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージとユーザーフレンドリーなパイプラインが必要です。ここでは、完全に自動化された画像取得ソフトウェアパッケージLatitude-Sの応用と、低線量条件下でのガラス化生体分子のデータ収集のための実用的なパイプラインを紹介する。...

単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア

この記事では、3 つのクライオ EM 処理プラットフォーム (cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3)...

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

高分子の高解像度クライオEMマップは、200kV TEM顕微鏡を使用することによっても達成できます。このプロトコルは、200kV TEMを使用して高解像度データセットを正常に収集するために不可欠な、正確な光学系アライメント、データ収集スキーム、およびイメージング領域の選択を設定するためのベストプラクティスを示しています。...

200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

このプロトコルは、TEMグリッドを凍結するためのサンプル調製の2つの方法を使用したヌクレオソーム複合体の調製について詳細に概説しています。...

クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのDNA修復因子と複合体を形成したヌクレオソームコア粒子の作製

学ぼう、Smart Leginonを用いたクライオ電子顕微鏡の複数グリッド自動スクリーニング手法。Ptolemyアプリケーションと機械学習を活用し、手動作業時間を大幅に削減して効率的なサンプル条件の最適化を実現する。

Smart Leginon を使用した複数のグリッドにわたるクライオ電子顕微鏡スクリーニングの自動化

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