Name: 二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学ぶ 二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた細胞外小胞のシングルステップ分離法。大量バイオ流体からの連続流動による自動化分離技術で、生体反応器との統合も可能。臨床応用への実用性向上に貢献します。

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この研究に参加してくださったすべてのドナー、サンプルを提供してくださったラトビアゲノムデータベースのスタッフに感謝します。ラトビア大学固体物理学研究所は、欧州連合(EU)のHorizon 2020 Framework Programme H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2から、プロジェクトCAMART2の助成金契約第739508号に基づき、資金提供を受けました。この研究は、ラトビア科学評議会プロジェクトNo.の支援を受けました。LZP-2019/1-0142およびプロジェクト番号:LZP-2022/1-0373。

ヒト尿からの連続的な細胞外小胞分離のためのマイクロ流体デバイス

<ol><li>Colombo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Tricarico, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biogenesis+of+shed+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Biology and biogenesis of shed microvesicles.</a> Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+drug+delivery+system+for+cancer+treatment%3A+Current+strategies+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances.</a> Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).</li>
<li>Royo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+separation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+Results+of+a+Worldwide+Survey+Performed+by+the+ISEV+Rigor+and+Standardization+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee.</a> Cells. 9 (9), 1955(2020).</li>
<li>Sidhom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+Is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Reshi, Q. U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles+%28EVs%29+using+benchtop+size+exclusion+chromatography+%28SEC%29+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns.</a> Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Priedols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcated+asymmetric+field+flow+fractionation+of+nanoparticles+in+PDMS-free+microfluidic+devices+for+applications+in+label-free+extracellular+vesicle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation.</a> Polymers. 15 (4), 789(2023).</li>
<li>Zhang, H., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric-flow+field-flow+fractionation+technology+for+exomere+and+small+extracellular+vesicle+separation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).</li>
<li>Talebjedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+microfluidics+for+extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Potential+use+for+standardized+embryo+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment.</a> Front Vet Sci. 7, 620809(2020).</li>
<li>van Meer, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+absorption+by+PDMS+in+the+context+of+drug+response+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays.</a> Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Bussooa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+oxygen+levels+within+thermoplastic+Organ-on-Chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%3A+X%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices.</a> Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).</li>
<li>Tang, L., Lee, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+route+for+irreversible+bonding+of+plastic-PDMS+hybrid+microdevices+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature.</a> Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).</li>
<li>Borda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformable+neural+interface+based+on+off-stoichiometry+thiol-ene-epoxy+thermosets%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets.</a> Biomaterials. 293, 121979(2023).</li>
<li>Sandström, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+injection+molding+and+direct+covalent+bonding+of+OSTE%2B+polymer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).</li>
<li>Sticker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+based+polymers+as+versatile+materials+for+microfluidic+devices+for+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).</li>
<li>Bajo-Santos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolation+from+large+volume+samples+using+a+polydimethylsiloxane-free+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).</li>
<li>Claridge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extracellular+vesicle+therapeutics%3A+Challenges%2C+considerations%2C+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).</li>
<li>Rezaie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+exosomes+application+in+clinical+trials%3A+Perspective%2C+questions%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges.</a> Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).</li>
<li>Aragón, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urinary+tract+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol+Focus%22%5BJournal%5D)">The urinary tract microbiome in health and disease.</a> Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).</li>
</ol>

A.A.、G.M.、R.R.は、Cellbox Labs, LLCの創設者、取締役、株主です

今回紹介したマイクロ流体デバイスは、体液からEVを分離・抽出するための有望な方法を提供し、UCやSEC12などの既存のゴールドスタンダード法の重大な限界に対処します。UCとSECは、労働集約的で時間がかかり、歩留まりが低いことが知られているため、大量のEVが必要なハイスループットアプリケーションにはあまり適していません21,22。対照的に、記載のマイクロ流体デバイスは、最小限のユーザー入力で最大20mLの相当量の体液を連続的に処理できるため、産業または臨床環境におけるゲームチェンジャーとなる可能性があります。このマイクロ流体デバイスの主な利点の1つは、EVアイソレーションを標準化し、手動ステップを必要とする従来の方法と比較して再現性を向上させることができることです。大量生産によってEV絶縁デバイス製造のばらつきを減らすことで、デバイスの性能をより適切に制御し、一貫性を持たせることができ、EVベースの治療や診断などのアプリケーションに不可欠です。さらに、このデバイスは、適切な基板の反応射出成形による大量生産との互換性により、スケーラビリティと幅広い採用の可能性がさらに高まります。
再現性と一貫した性能を確保するためには、チップの製造と実験での使用の両方において、広範で明確に定義されたプロトコルが必要です。このチップは、工業化を念頭に置いて設計されています。しかし、実験室環境でのデバイス製作では、気泡の発生を防ぎ、正確で堅牢な接合を確保し、実際の実験で予想されるよりも速い流速で徹底的なテストを行うことに注意を払う必要があります。この予防措置は、特に高流量でボンディングの失敗により漏れが発生しやすいため、COC-OSTEデバイスにとって特に重要です。さらに、OSTEは感光性材料であるため、デバイスの製造は、不必要な紫外線への曝露を避けるために黄色の光で行う必要があります。この技術はまだ初期段階にあるため、この新しい方法の標準化されたプロトコルはまだ確立されておらず、液体の粘度が私たちの結果に基づいてEVの分離効率に明らかに影響する可能性があるため、研究者はさまざまな流速で実験して特定のアプリケーションに最適な設定を特定する必要があります。これらのガイドラインに従い、標準化の課題に取り組むことで、EVアイソレーションのためのこのマイクロ流体デバイスの可能性は、さまざまな研究分野やアプリケーションにわたって完全に実現することができます。
マイクロ流体デバイスを使用したEV絶縁の方法では、性能を最適化するための広範な変更とトラブルシューティングが可能です。粒子分離を改善するために、研究者はより長いチャネル、異なる膜の空隙率と細孔密度、および変化した寸法を調べることができます。小さな粒子の出口に大きな粒子がたくさんある場合は、バッファーの入口速度を速くすると効果的ですが、大きな粒子の出口に小さな粒子が多数ある場合は、より長いチャネルまたは大きな細孔を持つメンブレンで実験することをお勧めします。粒子の吸収に対処するには、流速、表面改質、OSTE組成の調整、またはUV露光時間の変更が含まれます。不安定性や漏れが発生しているデバイスの場合、流速を下げ、適切な接着を確保することが重要なステップです。EVの損傷を最小限に抑えるために、研究者は流速を下げ、デバイスの滅菌後にPBSでより徹底的に洗浄し、より小さな膜孔または代替の金型設計技術と材料の使用を検討することができます。これらの調整により、マイクロ流体デバイスを微調整することができ、EV研究および関連分野での多様なアプリケーションの可能性を解き放ちます。さらに、デバイスの性能を最適化するために、密度や粘度の測定を含む上流のサンプル特性評価を組み込んで、流量パラメータを調整することができます。さらに、生体液の確立された非無菌性を考えると、サンプルの性質に特に重点を置く必要があります23。したがって、臨床応用における投与前のサンプルの滅菌は十分に考慮されるべきです。
これらの課題にもかかわらず、マイクロ流体デバイスはさまざまな研究分野で大きな可能性を秘めています。大量の不均質なサンプルからEVを連続的に分離する能力により、自動化への扉が開かれ、ハイスループットアプリケーションが容易になり、さまざまなソースからのEVのより詳細な分析が可能になります。このマイクロ流体モジュールを中空糸細胞バイオリアクターカートリッジや高分解能フローサイトメーターなどのさまざまなデバイスに統合することで、EVアプリケーションをより業界に優しいものにし、ドラッグデリバリー、診断、化粧品などの分野でイノベーションを促進することができます4。全体として、このマイクロ流体デバイスは、EV研究の分野における重要な前進を表しており、EV絶縁のための効率的で標準化された方法を提供し、幅広い研究および産業環境で有望なアプリケーションを提供します。

細胞外小胞(EV)は、エクソソーム(30-200 nm)とマイクロベシクル(200-1000 nm)の2つの主要なタイプからなる細胞由来の膜結合粒子です1。エクソソームは、多胞体(MVB)内のエンドソーム膜の内向きの出芽によって形成され、細胞膜との融合時に管腔内小胞(ILV)を細胞外空間に放出します1。これに対して、マイクロベシクルは、細胞膜2の外向きの出芽および分裂によって生成される。EVは、タンパク質、核酸、脂質、代謝産物を輸送し、細胞の生理学的状態(増殖、血管新生、転移、増殖、治療抵抗性など)を反映することにより、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たします3。その結果、がんを含む疾患の有望なバイオマーカーや治療標的として浮上し、診断やドラッグデリバリーシステムにおける可能性を浮き彫りにしています4。
EVを疾患の診断や治療に活用するには、さまざまな生体液から効率的に分離することが重要です5。一般的な方法には、超遠心分離(UC)、密度勾配遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、ろ過、免疫単離などがあります6。UCは広く使用されている技術であるが、EVではない同様の密度の粒子を生成する可能性があり、EV凝集体を生成する可能性がある7。SEC は、密度8 ではなくサイズに基づいて粒子を除外することで、より純度の高いサンプルを提供できるため、人気を博しています。ただし、カイロミクロンや低密度リポタンパク質などの不要な粒子の共単離を最小限に抑えるには、SEC カラムに適したポアサイズの慎重な選択とクロマトグラフィー条件の最適化が不可欠です8。どちらの方法もその有効性にもかかわらず、特に細胞培地や尿などの大量のサンプルの場合、自動化に時間がかかり、自動化が困難であるため、産業用途での拡張性が制限されます9。
近年、非対称磁場流れ場分画(A4F)は、サイズと浮力に基づくマイクロおよびナノメートルサイズの粒子分離のための強力な分離技術として進化しています10。A4Fの動作原理は、その底部に多孔質膜を備えたマイクロ流体チャネルに依存し、クロスフロー10と呼ばれる膜に向かって加えられる力を生成します。系に固有のブラウン運動およびポアズイユ流と組み合わされると、クロスフローは、流れダイナミクス内の粒子位置が変化するため、効率的な粒子分離を容易にする11。利点にもかかわらず、この方法は、マイクロリットル範囲内のサンプル量12 に限定され、追加の集束ステップを必要とし、プロセス10の持続時間を延長する。
過去10年間で、マイクロ流体工学は、迅速で効率的、かつ臨床的に信頼性の高いEV分離のためのツールとして注目を集めてきました13。しかし、EV分離用に設計されたほとんどのマイクロ流体分析法は、少量、高濃度のEVサンプル用に最適化されているか、複雑な分離手順に依存しています14。さらに、マイクロ流体工学の分野では、ポリジメチルシロキサン(PDMS)は、その光透過性、生体適合性、および使いやすさにより、ゴールデンスタンダード材料として認識されています15。それにもかかわらず、EVを含む親油性低分子を吸収する既知の傾向は、EV分野でのその応用にとって問題となり得る13。
環状オレフィン共重合体(COC)は、生体適合性、分子の吸収が小さく、耐薬品性が高いため、マイクロ流体工学で頻繁に使用される材料です15。しかしながら、COC装置の製造は、しばしば複雑なプロセスまたは特殊な装置16を伴う。あるいは、オフ化学量論チオールエン(OSTE)は、低分子の吸収の減少、優れた化学的安定性、製造の容易さ、およびスケーラブルな製造プロセスにより、PDMSの有望な代替品です17,18。ただし、チューブへの接続が複雑なため、デバイスは漏れやすい場合があります19。
本研究の目的は、尿や細胞培地などの大容量サンプルからEVを分離するための、OSTEとCOCを組み合わせたマイクロ流体デバイスおよび二股A4F原理を設計および製造することでした。

<table><tbody><tr><td>0.1 &マイクロ;m カルボキシレート FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td> <td>#F8803</td><td>ストック濃度: 3.6 x 1013 ビーズ/mL (LOTに依存)</td></tr><tr><td>0.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>1 mL ルアーコーンシリンジ 針なしの単回使用</td><td>RAYS</td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1.0 & micro;m ポリスチレン FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td> <td>#F13083</td><td>ストック濃度: 1 x 1010 ビーズ/mL (LOTに依存)</td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL (100k) Amicon Ultra 遠心フィルター</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Protein LoBind チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringes</td><td>BD PlastikPak</td><td></td><td></td>10569215</tr><tr><td>250 & マイクロ;m ID ポリエーテル エーテル ケトン管</td><td>ダーウィン マイクロ流体</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa MWCO 遠心フィルターユニット</td><td>メルク ミリポア、</td><td>UFC200324</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 医療用注射器 針なし</td><td>安徽省 Hongyu Wuzhou 医療</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti 固定角超遠心分離機ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>800 & マイクロ;m ID ポリテトラフルオロエチレンチューブ</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>96 well microplate, f-bottom, med. binding</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td><td>ELISA plate</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), 無血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas 顕微鏡スライドプラットフォーム</td><td>Microfluidic Chipshop</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas顕微鏡スライドプラットフォーム 2 x 16 Mini Luer&nbsp;</td><td>マイクロ流体チップショップ</td><td>10000387</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow OB1 圧力コントローラー</td><td>Elvesys Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ルアー コネクタ</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>&nbsp;CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>マスクアライナー Suss MA/BA6</td><td>SUSS MicroTec Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td>ナノ粒子分析装置&nbsp;</td></tr><tr><td>光学顕微鏡 Nikon Eclipse LV150N</td><td>Nikon Metrology NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 Crystal Clear</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS TABLETS.Ca/Mg 無料です。フィッシャーバイオ試薬。100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>PC メンブレン (孔径 50 nm、密度 11.8%)</td> <td>it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シャーレ、滅菌済み</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/35 nm カラム</td><td>Izon</td><td>SP5</td><td>SEC カラム</td></tr><tr><td>QSIL 216シリコーンエラストマーキット</td><td>PP&S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>樹脂 タフ ブラック</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti スイング 超遠心ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ ポンプ</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175 懸濁液フラスコ</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>TIM4-FC タンパク質</td><td>Adipogen LifeSciences</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)</td> <td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML</td><td>西洋わさびペルオキシダーゼ基質</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機 Optima L100XP</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄ユニット P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルマイクロプレート分光光度計</td><td>Bio-Tek instruments</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>採尿カップ、150mL、滅菌</td><td>APTACA</td><td>2120_SG</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 25 シリンジ フィルター</td><td>SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>動的光散乱 (DLS) システム&nbsp;</td></tr><tr><td>Zortrax インクスパイア</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

二股a4fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

細胞外小胞(EV)は、診断、ドラッグデリバリー、再生医療など、さまざまな生物医学的応用に大きな可能性を秘めています。それにもかかわらず、EVを分離するための現在の方法論には、複雑さ、時間の消費、かさばる機器の必要性などの大きな課題があり、臨床翻訳の妨げとなっています。これらの制限に対処するために、私たちは、大量のサンプルからEVを連続的に効率的に分離するための、環状オレフィン共重合体オフ化学量論チオール-エン(COC-OSTE)に基づく革新的なマイクロ流体システムの開発を目指しました。本研究で使用した技術は、サイズと浮力に基づく分離を利用することで、尿および細胞培地サンプルからの既存のアプローチと比較して大幅に狭いサイズ分布を達成し、将来のアプリケーションで特定のEVサイズ画分をターゲットにすることを可能にしました。当社の革新的なCOC-OSTEマイクロ流体デバイス設計は、二股非対称フローフィールドフロー分画技術を利用して、大量のサンプルに対して簡単で連続的なEV分離アプローチを提供します。さらに、このマイクロ流体デバイスの大量生産の可能性は、拡張性と一貫性を提供し、高い一貫性とスループットが不可欠な要件である日常的な臨床診断や産業プロセスにEVアイソレーションを統合することを可能にします。

我々は、二股A4F原理(図2B、C)に基づくハイスループットEV分離のために、ソフトリソグラフィー(図2A)を介して3Dプリントされた二重ネガティブモールド(図1)を使用してマイクロ流体デバイスを作製しました。このセットアップでは、図3に示すように、EVを自動隔離するためのポンプとフロースルーステーションが必要です。まず、デバイスの概念実証を評価するために、直径100nmおよび1000nmのポリスチレンビーズの混合物を調製して、それぞれ小胞および微細な細胞破片を表わした10。分岐流の有無にかかわらず、ビーズ混合物の流速を変えて実験を行い、線速度が分離効率に及ぼす影響を調べました。すべての実験において、小さなビーズの回収率は一貫しており、90%以上であり10、EVを回収できる可能性を示しています。
次に、最小限の前処理で複雑な生体液から大容量(&gt;1 mL)のEVを分離するCOC-OSTEデバイスの可能性を評価および比較しました。そのため、10人の健康なドナーの尿(図4)と2つの異なる前立腺細胞株の細胞培地(図5)をテンプレートとして使用し、超遠心分離(UC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、およびA4Fマイクロ流体ベースのOSTE-COCデバイスの3つの異なる手順に従ってEVを同時に分離しました。単離後、粒子の総数とその粒度分布をナノ粒子追跡分析(NTA)を用いて評価した。平均して、OSTE-COCデバイスはUCと比較して生体液からの総粒子回収率が良好であることを示しましたが、統計的有意性は両方のポートからの粒子数を組み合わせた場合にのみ達成されました(図4A)。デバイスの性能を他のシステムと比較するには、R&amp;Lコンセントを一緒に考慮する必要があります。 図4に示すように、LとRの出口を合わせた回収EVの性能は、UCとSECを凌駕しています。 これとは別に、Lポートは小さなEVフラクションを捕捉するように設計され、Rポートは同様のサイズの他の分子でより大きなEVフラクションを回収するように設計されています。興味深いことに、OSTE-COCデバイスのR-PORTを使用した回収率は、SECおよびUCのみの場合よりもわずかに高くなりました(図4A)。CD63の発現も同様のパターンを示しました(図4C)。この発見は、OSTE-COCデバイスがEV全体の回収においてより効果的であったことを示しています。異なる分析法間で同等の粒度分布が見られましたが、UC はより大きな粒度分布を示しました(図 4B)。
細胞培地培養でも同様の結果が観察されました。どちらのシナリオでも、両方のデバイスポートからのパーティクルの総回収率は、SEC または UC 分析法と比較して優れた性能を示しました( 図 5A、B を参照)。特に、PC3細胞由来のEVは、他の実験グループと比較して、L-PORT分布の均一性が高く、明確なサイズ分布を示しました(図5C、D)。さらに、CD63発現の解析により、COC-OSTEデバイスを使用してより高いEV回収率が達成されることが確認されました( 図5E、Fを参照)。本研究で検討したさまざまな方法論の単離特性を比較した要約を 表 1 に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg"> 図1:3DP蛇行形のダブルネガティブモールドの寸法とアイソメトリックビュー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg"> 図2:COC-OSTEマイクロ流体デバイス。 (A)OSTE-COCデバイスを製造するためのさまざまな主要ステップのスキーム。(B)デバイスの動作原理。(C)完成したデバイスの画像。スケールバー:15mm。この図は、Priedols et al.10 および Bajo-Santos et al.20 の許可を得て変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg"> 図3:デバイスの実験構成。 シリンジポンプは左側、OSTE-COCデバイスは中央、リカバリーステーションは右側にあります。この図は、Priedols et al.10 および Bajo-Santos et al.20 の許可を得て変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg"> 図4:超遠心分離(UC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、およびCOC-OSTEデバイスを使用した10人のドナーからの尿中EVサイズ分布と粒子回収。 (A)ナノ粒子トラッキング分析(NTA)により各単離法から回収された粒子量。データは平均 +/- 標準偏差で表されます。*(p&lt;0.05)で示される統計的有意性。(B)箱ひげ図は、NTAが評価したすべての尿サンプルの平均粒度分布を示し、ひげは最小値と最大値を示します。p値はUCとの比較から導き出され、****は高い統計的有意性(p&lt;0.0001)を示しました。(C)ダブルサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法(dsELISA)を用いて評価した平均CD63量の中央値と範囲を、すべてのサンプルで計算しました。Lポート:左ポート。Rポート:右ポート。この図は、Bajo-Santos et al.20の許可を得て修正したものである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg"> 図5:PC3セルとLNCaPセルから分離したEVの特性評価。 (A)ナノ粒子トラッキング分析(NTA)を用いてPC3培地から回収した粒子量を平均+/-標準偏差で表したもの。(B)NTAを用いてLNCaP細胞培地から回収した粒子量は、平均+/-標準偏差で表されます。(C)PC3培養物由来のEVの粒度分布の中央値と範囲は、NTAによって決定されました。(D)レンジを有するLNCaP培養物から単離されたEVの中央値サイズ分布。(E)ダブルサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(dsELISA)を使用した、PC3細胞株由来EVの各単離法におけるCD63発現の中央値と範囲。(F)各単離法におけるdsELISAによるLNCaP由来EV CD63発現の中央値と範囲。UC:超遠心分離;SEC:サイズ排除クロマトグラフィー;Lポート:左ポート。Rポート:右ポート。この図は、Bajo-Santos et al.20の許可を得て修正したものである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>UCの</td>
			<td>秒</td>
			<td>COC-OSTE(コックオステ)</td>
		</tr><tr><td>処理時間/サンプル</td>
			<td>++/+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>スループット</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>コスト/サンプル</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>純度</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>自動化</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>EV歩留まり</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>サイズ選択</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr></tbody></table>表 1.3つの方式UC SEC、COC-OSTEデバイスによるEVの絶縁特性の比較 UC:超遠心分離;SEC:サイズ排除クロマトグラフィー。COC-OSTE:環状オレフィン共重合体-オフ-化学量論チオール-エン。+:低い;++:ミディアム;+++: 高。*デバイスによって異なります。

細胞外小胞は生物医学的応用に大きな期待を寄せていますが、現在の単離法は時間がかかり、臨床使用には実用的ではありません。本研究では、大量の生体液から細胞外小胞を最小限のステップで連続的に直接単離できるマイクロ流体デバイスを紹介します。

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私たちは細胞外小胞の可能性を認めていますが、特にバイオリアクター培地などの大きなサンプル生体液からの細胞外小胞の単離の難しさも認識しています。本研究では、細胞外小胞の単離に非対称な流れ場-流れ分画を用いることができるかどうかを検証しました。現在のところ、細胞外小胞を生体液から直接単離し、バイオリアクターに組み込むことは不可能です。代わりに、最初に生体液を収集して処理する必要があり、ばらつきと労力がかかります。大量の生体液から細胞外小胞を分離するために設計された当社のデバイスは、バイオリアクターとの統合を可能にし、連続フローと自動化を実現します。液体の粘度は、非対称磁場フロー分画を用いた細胞外小胞の単離に影響を与える可能性があることがわかりました。私たちは、生体液と緩衝液の流れを粘度に適合させることで、単離を強化できるかどうかを探っています。

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Research

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