Name: エンドソーム由来小胞の大量生産のための磁気分離支援高速均質化法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: 学ぶエンドソーム由来小胞の大量生産法。磁気ナノ粒子標識と高速均質化により、エクソソームミメティクスを高収率で調製し、細胞外小胞研究と医療応用に貢献します。

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著者らは、中国科学院基礎医学・がん研究所(IBMC)の共用機器コア施設で機器が使用されていることを認めている。本研究は、中国国家自然科学基金会(NSFC;82172598)、中国浙江省自然科学基金会(LZ22H310001)、中国浙江省衛生健康委員会の551健康人材育成プロジェクト、杭州市科学技術局農業社会発展研究プロジェクト(2022ZDSJ0474)、銭塘学際研究助成金の支援を受けた。

注:この方法の概略図を 図1に示します。
1. EMの準備と分離
<ol><li>MNPの細胞内在化<ol><li>細胞培養<ol><li>10%ウシ胎児血清(FBS)および5%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(P/S)を含むDMEM完全培地に、1×106ラット骨髄間葉系幹細胞(BMSC)、293T細胞、またはマウス卵巣上皮がん細胞(ID8)を懸濁します(6ウェルプレートあたり2 mL)。</li>
			<li>細胞を37°C、5%CO2で一晩培養します。 注:接着後の細胞数は約1×106であった。</li>
		</ol></li>
		<li>MNPのエンドサイトーシス<ol><li>各 6 ウェルプレートの培地容量を 1 mL に減らします。10 nmのポリリジン修飾酸化鉄ナノ粒子(IONP)( 材料表を参照)と100 μg/1 × 106 細胞の濃度で細胞を共培養し、5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで12 時間インキュベートして、細胞がIONPを完全にエンドサイトースできるようにします。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>エンドソームの単離と均質化<ol><li>細胞低張治療<ol><li>IONPを完全に取り込んだ細胞を0.5 mL/ウェルトリプシンで3分間消化し、1 mL/ウェル完全培地を添加して消化を終了します。</li>
			<li>1000 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、遠心分離機で2回繰り返して、残留培地と吸収されていないIONPを洗い流します。</li>
			<li>最後に、ペレットをあらかじめ調製した高張溶液(71.4 mM塩化カリウム、1.3 mMクエン酸ナトリウム、pH 7.2-7.4)に8 mLで15分間再懸濁します( 材料表を参照)。</li>
		</ol></li>
		<li>低速ホモジナイズによるオルガネラの放出<ol><li>低張溶液中の細胞懸濁液をガラス試験管に移し、ガラスホモジナイザー( 材料表参照)を使用して1000rpmで20回の衝撃で細胞小器官を放出します。</li>
		</ol></li>
		<li>エンドソームを得るための磁気分離<ol><li>ホモジナイズした細胞溶液1 mLを1.5 mLの微量遠心チューブに移し、磁気分離器に1時間入れて、IONP負荷エンドソームを他の細胞小器官(核やミトコンドリアなど)や細胞破片から完全に分離します。</li>
			<li>磁気フレーム( 材料表を参照)の隣にある微量遠心チューブの接触面、つまりIONPをロードしたエンドソームに茶色のペレットを回収します。微量遠心チューブ内の液体を廃棄し、3 mLのPBSを加えてエンドソームを再懸濁します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>高速均質化<ol><li>エンドソームを含む溶液を、液量が3〜10mLの15mL遠心チューブに移します。</li>
		<li>高速ホモジナイザーの 10 mm プローブ ( 材料表を参照) を遠心分離管の底部に触れずに伸ばします。画面下の 速度 ボタンを調整し、速度を140 x gに設定し、 時間ボタンを調整して5分の 時間 を設定してから、 OK ボタンを押します。</li>
		<li>スタートボタンを押して、サンプルの下にアイスボックスを置いた後、均質化を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>EMの磁気選別<ol><li>高速ホモジナイズで得られたナノベシクルを含む溶液を1.5mLの微量遠心チューブに移し、磁気分離器に1時間入れます。</li>
		<li>必要なEMを含む液体を収集します。遊離IONPとIONP負荷EMを吸着した磁気フレームの隣のチューブの表面に触れないように注意してください。</li>
	</ol></li>
</ol>2. EM特性評価(図2および図3)
<ol><li>動的光散乱(DLS)解析<ol><li>壁に沿って 1 mL の EM サンプル(20 μg/mL)をキュベットに注入し、DLS 装置の装置サンプルスロットに入れます( 材料表を参照)。</li>
		<li>DLSソフトウェアを開き、[ 粒子サイズテスト]を選択して、テストを開始します。</li>
		<li>BCAタンパク質アッセイキット( 材料表を参照)を使用してタンパク質濃度を測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>ナノ粒子トラッキング分析(NTA)<ol><li>EM を PBS で 1 × 107-1 × 108 粒子/mL の溶液に希釈し、1 mL シリンジを使用して 500-1000 μL/分の流速で NTA 装置のチャンバーに注入します ( 材料表を参照)。</li>
		<li>488のレーザーチャンネルを開き、ソフトウェアインターフェースのEMの数が100〜300以内で、ブラウン運動していることを確認します。</li>
		<li>メーカーのプロトコルに従って、適切なSOP(EV-488)を選択し、機器の感度がEM検出に適していることを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>透過型電子顕微鏡(TEM)<ol><li>EM(1 mg/mL)を等量の 5% グルタルアルデヒドで 30 分間固定し、BCA タンパク質アッセイキットで EM の濃度を 1 mg/mL として定量します。</li>
		<li>銅メッシュのカーボン側にEMを10μL滴下し、10分後にろ紙で余分な液体を取り除きます。PBS10 μLを加え、すぐにろ紙でブロットします。これを2回繰り返して、余分なグルタルアルデヒドを取り除きます。</li>
		<li>酢酸ウラニル造影剤5μLを滴下し、1分間ネガティブ染色した後、余分な造影剤を除去します。脱イオン水で3回洗浄し、室温(RT)で乾燥させます。</li>
		<li>加速電圧100kVのTEMで画像を記録します。</li>
	</ol></li>
	<li>ウェスタンブロッティング<ol><li>100 μLの細胞溶解バッファーと50倍プロテアーゼ阻害剤カクテル5 μLをサンプルに加えます( 材料表を参照)。ピペットガンで穏やかに混ぜ、30分間氷の上に置きます。</li>
		<li>溶液を1000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、BCAタンパク質アッセイキットで上清のタンパク質濃度を定量し、回収します。</li>
		<li>上清100 μLを25 μLの5xタンパク質ローディングバッファーと混合し、95°Cで10分間加熱します。</li>
		<li>予備成形されたゲルの指示に従ってゲルを調製する。1ウェルあたり15 μgのタンパク質をロードし、80 Vでゲル電気泳動を行い、サンプルが分離ゲルに流れるのを待ち、100 Vに変更してから、タンパク質を100 Vのニトロセルロースメンブレンに移し、氷浴下で60分間泳動します。</li>
		<li>非EV特異的マーカー(カルネキシン)およびEVバイオマーカー(アネキシンおよびCD63)をウェスタンブロッティングで検出します( 材料表を参照)。 注:抗体は、メーカーの推奨に従って希釈されています。</li>
	</ol></li>
</ol>3. in vitro EM機能検出
<ol><li>EMのラベリング<ol><li>1 μL の PKH26 と 250 μL の希釈液 C(1:250)を混合して、2 倍染色溶液 (4 × 10-6 M) を調製します ( 材料表を参照)。</li>
		<li>250 μL の EM (1 mg/mL) を 2 倍染色液 250 μL と混合し、ピペッティングガンですばやくブローします。</li>
		<li>遠心分離管を静かに反転させながら、室温で2〜5分間インキュベートします。</li>
		<li>等量の血清または1%ウシ血清タンパク質を添加し、1分間インキュベートして消化を終了します。</li>
		<li>1000 KD限外ろ過チューブで3000 x g で30分間限外ろ過することにより、余分なPKH26を除去し、PBSを添加して3回繰り返します。残りの液体をPBSで500 μLに再懸濁し、0.22 μmフィルターでろ過します。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞取り込みアッセイ<ol><li>細胞接種:10%FBSおよび5%P/Sを含むDMEM1 mLを含む35 mm共焦点皿に1×10 6個の細胞を 播種し、37°Cおよび5%CO2 で一晩インキュベートします。</li>
		<li>0.22 μmの滅菌シリンジフィルターでEMをろ過し、潜在的な汚染を除去します。</li>
		<li>細胞をPKH26標識EM(10,9粒子/mL)で8時間処理します。</li>
		<li>PBSで3回洗浄し、DAPI(10 ng/mL)を添加し、室温で10分間インキュベートします。</li>
		<li>405 nmおよび561 nmのレーザーチャンネルを使用して、共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡で蛍光画像を取得します( 材料表を参照)。</li>
	</ol></li>
</ol>

エンドソーム由来ナノベシクルの磁気的高収率生産の最適化

<ol><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), eaau6977(2020).</li>
<li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAL-1+controls+multivesicular+body+biogenesis+and+exosome+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion.</a> J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).</li>
<li>Farooqi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+biogenesis%2C+bioactivities+and+functions+as+new+delivery+systems+of+natural+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds.</a> Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).</li>
<li>Gatti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+opportunity%2C+and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Castilletti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+induction+of+IFN-alpha+and+-gamma+by+SARS-CoV+also+in+the+absence+of+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication.</a> Virology. 341 (1), 163-169 (2005).</li>
<li>Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicines+in+an+evolving+oncology+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape.</a> Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).</li>
<li>Jo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+generation+of+cell-derived+nanovesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Large-scale generation of cell-derived nanovesicles.</a> Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).</li>
<li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nanovesicles+with+sliced+cellular+membrane+fragments+for+exogenous+material+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery.</a> Biomaterials. 59, 12-20 (2015).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+mimetics+derived+from+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+ablate+neuroblastoma+tumor+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo.</a> Biomater Adv. 142, 213161(2022).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+mimetics+derived+from+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+deliver+doxorubicin+to+osteosarcoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo.</a> Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+proteomic+analysis+of+exosome+mimetic+vesicles+and+exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312(2022).</li>
<li>Li, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+exosomes+for+translational+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial exosomes for translational nanomedicine.</a> J Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).</li>
<li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+characteristics+of+310+SARS-CoV-2+Omicron+variant+patients+and+comparison+with+Delta+and+Beta+variant+patients+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+Sin%22%5BJournal%5D)">Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China.</a> Virol Sin. 37 (5), 12(2022).</li>
<li>Shapira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+platform+for+attenuating+immune+hyperactivity+using+EXO-CD24+in+COVID-19+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond.</a> EMBO Mol Med. 14 (9), 15997(2022).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+exosome-mimetic+nanovesicles+for+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+to+malignant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors.</a> ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).</li>
<li>Le, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+mild+isolation+of+intact+lysosomes+using+magnetic-plasmonic+hybrid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles.</a> ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).</li>
<li>Jeong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovesicles+engineered+from+ES+cells+for+enhanced+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation.</a> Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).</li>
<li>Kooijmans, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+of+GPI-anchored+anti-EGFR+nanobodies+on+extracellular+vesicles+promotes+tumour+cell+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting.</a> J Extracell Vesicles. 5, 31053(2016).</li>
</ol>

D.W.とP.G.は、中国科学院基礎医学・がん研究所(IBMC)が出願した特許出願の共同発明者です。もう一人の著者は、利益相反がないことを宣言しています。

無細胞治療とナノスケールのドラッグデリバリーシステムの代替物であるEVは、臨床上の期待にまだ応えられておらず、主な障害は、スケーラブルで再現性のある製造および精製方法の欠如です6。そのため、生物学的に複雑な性質を持つEV類似体として、様々な種類のEMが開発されている14。現在、最も一般的に使用されているEMの例は、細胞質膜由来のナノベシクルです。このようなナノベシクルの調製は、親細胞全体を直接押し出すことによって比較的容易かつ容易である17。しかし、細胞質膜由来のナノベシクルは、2つの欠点により、天然のEVを再現することができません:第一に、これらのナノベシクルの生物学的起源は、天然のEVと比較して異なる脂質とタンパク質の組成を含む細胞原形質膜に由来します。第二に、非EV細胞小器官や細胞破片からのタンパク質、核酸、脂質などの汚染は、EMの不均一性を必然的に引き起こします。この方法では、細胞をIONPとインキュベートし、磁気分離によってIONPをロードしたエンドソームを回収し、高速ホモジナイズによって単分散ナノベシクルを生成し、最終的に2回目の磁気分離によってIONPフリーEMを得ました。さらに、均質化の速度や時間などのさまざまなパラメータがEMのサイズと収率に与える影響を調べることで、EM調製条件を最適化しました。このプロトコルは興味深い生物的現象を利用する: MNPs (例えば、10 nm IONPs)はendocytosisによってほとんどすべてのセルによって効率的に内在化され、endosomes、ない他の器官で専ら集めることができる。このユニークな生物学的プロセスにより、磁気分離により、非EV汚染のないMNP負荷エンドソームの単離が可能になりました。その見返りとして、これらの精製された細胞エンドソームによって調製されたナノベシクルは、天然EVの生物学的複雑さをより忠実に再現することができます。
さらに、EV単離法のゴールデンスタンダードは超遠心分離であり、大量の細胞培養培地と5時間を超える長い処理時間がかかり、1 x 106細胞6から1 × 107-1 × 108粒子しか生成しません。従来の全親細胞押出法には、超高圧膜押出および超遠心分離を含む複数のステップが含まれ、これらは比較的高い収率を有するが、高価な装置を必要とする17。しかし、EM生産の歩留まり、効率、コスト、および人的資源は、当社のプロトコルを利用することで大幅に改善されます。高速ホモジナイザーは、このプロトコルでは5分という短い処理時間で一般的かつ低コストの装置であり、この方法は、ネイティブEVと比較して、1セル×10 6セルから最大100倍のEMを生成できます。しかし、この方法には、高速ホモジナイズ中にエンドソームタンパク質が失われるなどのいくつかの制限があり、細胞によってエンドサイトーシスされたMNPがリソソームに移行できることが示されており、これは潜在的なコンタミネーションとなる18。
大局的には、EMは本来のEMと同様に重要な生物学的機能を発揮するように操作することができ、これは新規で有望なタイプの生物学的治療薬として役立つ可能性があります。生理活性物質(タンパク質や核酸など)は、特定の親細胞(幹細胞19など)の選択や遺伝子組み換え(融合タンパク質20など)によってEMに組み込むことができます。例えば、生きた胚性幹細胞を押し出すことによる細胞由来のナノベシクルは、回復または創傷治癒プロセスにプラスの効果をもたらす19。遺伝子組み換えは、特定の生物学的機能を持つEMを生成するための代替アプローチです。例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーシグナルペプチドに融合した抗上皮成長因子受容体(EGFR)ナノボディのベクターを細胞にトランスフェクションした場合、EGFRナノボディをEVの表面に固定して、EGFR発現腫瘍細胞を標的とすることができる20。EMは、複数の前臨床試験で無細胞療法およびナノスケールの薬物送達システムの代替として良好に機能しています14が、臨床調査におけるEVおよびEMの不均一性と再現性に関する懸念から、EMまたはEVベースの治療の包括的なメカニズムの理解が不足しています。まとめると、EMの生物学的機能とその臨床的意味合いは、さらなる研究が必要です。

細胞外小胞(EV)は、30〜150 nmのサイズ範囲でほぼすべての細胞から分泌される小さな小胞であり、豊富な生理活性物質を含んでいます。EVは、起源の細胞にもよりますが、高い不均一性を示し、親細胞に特異的な複数の成分を持っています1。EVは体液中に放出され、遠隔地に運ばれ、そこで標的細胞に取り込まれて作用し2、組織の修復、腫瘍の診断と治療、免疫調節のための幅広い生理活性分子や薬剤の送達に利用することができる3,4。しかし、体液中で同様の生物物理学的特性を持つ他の生物学的ナノ粒子(リポタンパク質など)やナノベシクル(非エンドソーム経路由来のEV)は、EVの単離と精製に必然的に影響を及ぼします。現在まで、超遠心分離は依然としてEV単離のゴールドスタンダードであり、スクロース密度勾配遠心分離、限外ろ過、ポリエチレングリコール沈殿、クロマトグラフィー、免疫磁気ビーズ単離などの他の分離法が開発されています5。EV治療薬の臨床翻訳と商業化を制限する現在のボトルネックは、EVの高度にスケーラブルで再現性の高い分離を可能にする分離技術の深刻な欠如です6、7、8。従来のEV単離技術(超遠心分離やサイズ排除クロマトグラフィーなど)は、収率が低い(1 x 107-1 x10 8/1 x 106細胞)、長い生産サイクル(24-48時間)、製品品質の再現性が低く、高価でエネルギー集約的な生産設備を必要とするため、EVに対する現在の臨床需要を満たすことができません6。
在来EVの合成代替品であるエクソソーム模倣体(EM)は、構造、機能、生産のスケーラビリティが非常に似ているため、重要な注目を集めています。EMの主な発生源は、連続切片化による親細胞全体の直接押し出しによるもので9,10、天然EVとしての強力な生物学的機能を示しています11,12。例えば、ヒト臍帯間葉系幹細胞(hUCMSC)に由来するEMは、天然のEVと同様の創傷治癒効果を発揮し、タンパク質組成が豊富である13。全細胞由来のEMはEVのような生物学的な複雑さを持っていますが、その主な欠点は、さまざまな細胞小器官や細胞破片によって必然的に汚染されるため、製品の不均一性です。さらに、タンパク質局在解析により、全細胞押出に由来するEMには、ミトコンドリアや小胞体由来の非EV特異的タンパク質が多数含まれていることが明らかになった13。さらに、EMを製造するためのほとんどの方法は、非常に時間とエネルギーを消費するプロセスである超遠心分離を必要とします14。エクソソームが細胞エンドソームのみに由来するという事実を考慮し、バイオエンジニアリングされたエンドソーム由来のナノベシクルは、全細胞押出法によって生成された確立された細胞膜由来のEMと比較して、エクソソームとEMの間の生物学的相同性をよりよく再現する可能性があるという仮説を立てました14。それにもかかわらず、エンドソーム由来のナノベシクルの製造は、実行可能なアプローチがないために困難です。
EVを無細胞治療の代替として、またナノスケールのドラッグデリバリーシステムとして、様々な疾患の治療に活用した臨床研究が行われています。例えば、骨髄間葉系幹細胞由来のEVは、COVID-19による重症肺炎の治療に使用され、有望な結果を達成しています。最近では、CD24タンパク質を搭載した遺伝子組み換えEVも、COVID-19患者の治療に強力な治療効果があることが実証されています15,16。しかし、EV療法の臨床的要件は、収量とコストが低いため、従来の分離方法ではまだ満たすことができません。本研究は、磁気分離支援高速均質化法によるエンドソーム由来ナノベシクルの大規模生産について報告する。MNPのエンドサイトーシス経路を利用して、MNPがロードされたエンドソームを磁気分離によって分離し、その後、高速ホモジナイズしてエンドソームを単分散ナノベシクルに製剤化します。このプロトコルによって収集されるエンドソームの種類は多様であるため、業界で適正製造基準(GMP)を確立するには、さらに詳細な研究が必要です。この新しいEM調製アプローチは、ネイティブEVと相同なナノベシクルを得るための時間効率(5分間の高速ホモジナイズ)です。これは、一般的にさまざまな細胞タイプに適用できる超遠心分離よりも、同じ量の細胞から指数関数的に多くの小胞を生成します。

<table><tbody><tr><td>アネキシン抗体</td><td>ABclonal</td><td>A11235</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>BCA assay kit</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>タンパク質濃度アッセイ</td></tr><tr><td>Calnexin</td><td>GeneTex</td><td>HL1598</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CD63 antibody</td><td>ABclonal</td><td>A19023</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Western and IP</td><td>Beyotime</td><td>P0013</td><td>Westernブロッティング</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td>細胞遠心分離機</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>サーモ</td><td></td><td>セルカルチャー</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡</td><td>NIKON</td><td>A1 HD25</td><td>蛍光写真</td></tr><tr><td>DMEM 基本 (1x)</td><td>GIBCO</td><td>C11995500BT</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>動的光散乱 (DLS)</td><td>マルバーン</td><td>ゼータサイザー ナノ ZS ZEN3600</td><td>直径分析</td></tr><tr><td>電気ガラスホモジナイザー</td><td>SCIENTZ(中国・寧波)</td><td>DY89-II</td><td>低速均質化</td></tr><tr><td>エクソソーム枯渇FBS</td><td>システム バイオサイエンス</td><td>EXO-FBS-50A-1</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>高速ホモジナイザー</td><td>SCIENTZ(中国・寧波)</td><td>XHF-DY</td><td>高速均質化</td></tr><tr><td>磁気格子</td><td>Tuohe Electromechanical Technology (上海、中国)</td><td>NA</td><td>Magnetic separation</td></tr><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH26GL-1KT</td><td>このキットには、PKH26 細胞リンカーをエタノールおよび希釈剤 C</td></tr><tr><td>ポリリジン変性酸化鉄ナノ粒子 (IONPs)</td> <td>Zhongke Leiming Technology (中国、北京)</td><td>Mag1100-10</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>カリウム塩化物</td><td>アラジン</td><td>7447-40-7</td><td>細胞高張治療</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td>カクテル <td>Beyotime</td><td>P1030</td><td>プロテイナーゼ阻害剤</td></tr><tr>ク<td>エン酸ナトリウム</td><td>アラジン</td><td>7447-40-7</td><td>細胞低張治療</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡(TEM)</td><td>日本電子</td><td>JEM-2100plus</td><td>形態画像</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td>オプティマXPN-100</td><td>エキソソーム遠心分離機</td></tr><tr><td>ゼータView ナノ粒子&nbsp; トラッキングアナライザー</td><td>Particle Metrix</td><td>PMX120</td><td>ナノ粒子トラッキング分析</td></tr></tbody></table>

エンドソーム由来小胞の大量生産のための磁気分離支援高速均質化法

A Magnetic Separation-Assisted High-Speed Homogenization Method for Large-Scale Production of Endosome-Derived Vesicles

細胞外小胞(EV)は、生理学的および病理学的研究、疾患の診断、および治療において大きな注目を集めています。しかし、スケールアップ製造アプローチの欠如により、その臨床的翻訳は制限されてきました。そこで、本プロトコルは、従来の超遠心分離法の約100倍の収率を有するエンドソーム由来のナノベシクルを、エンドソーム由来のエキソソーム模倣体(EM)として大量生産するための磁気分離支援高速均質化法を提供する。この方法では、磁性ナノ粒子(MNP)がエンドサイトーシスを介して親細胞によって取り込まれ、その後エンドソーム内に蓄積されました。その後、MNPを充填したエンドソームを回収し、低張処理と磁気分離により精製した。高速ホモジナイザーを使用して、MNPをロードしたエンドソームを単分散ナノベシクルに分解しました。得られたエンドソーム由来の小胞は、ナノ粒子追跡分析、透過型電子顕微鏡、およびウェスタンブロッティングを特徴とする、同じ生物学的起源と構造を特徴としています。その形態とタンパク質組成は天然EVと類似しており、EMは臨床翻訳のためのネイティブEVの低コストで高収率の代替物として機能する可能性があることを示しています。

磁気分離支援高速均質化によるEM調製のワークフローを 図1に示します。細胞は10 nmのポリリジン修飾IONPを内在化し、エンドサイトーシスを介してエンドソームに特異的に蓄積されます(図3A)。ハイポトニックバッファーで処理され、ホモジナイズされた後、IONP負荷エンドソームは細胞から放出され、続いて磁気分離によって収集されます。単離されたエンドソームは、高速ホモジナイズによってさらに単分散ナノベシクル(EMとも呼ばれる)に再構成されます。複数の重要なパラメータ(均質化の速度や時間など)を調べて、最適なEM調製条件を特定しました(図2)。最後に、140 x g で 5 分間の均質化速度を、製造された EM の粒子径と収率を考慮して最適な条件として選択しました。遊離 IONP および IONP 負荷 EM は、最終的に 2 回目の磁気分離によって最終生成物溶液から除去され、IONP フリーの EM が得られます。この方法は、天然のEVと同じ生物学的起源を共有する親細胞エンドソームから、非常に均一で単分散のナノベシクルを生成します。
超遠心分離で得られたEVと、この方法で生成したEMを比較するために、EVとEMにはBMSCと293Tを用意しました。EMの直径と形態をNTAとTEMで分析しました。BMSC-EMの形態は、典型的なお椀型の小胞状構造を特徴とし、脂質二重層で区切られています(図3A)。NTAの分析によると、BMSC-EMと293T-EMはどちらもネイティブEV(BMSC-EVと293T-EV)と同様の流体力学的直径を持っています(図3B)。高速ホモジナイズにおけるBMSC-EMの収率は、8.16 × 10 8-1.42 × 109/1 × 106細胞であり、超遠心分離により調製されたネイティブEVの収率は、108/1×106細胞×7-12×7.2収率であった。同様に、高速ホモジナイズによる293T-EMの収率は、3.71 × 108-7.58 × 108/1 × 106セルであり、従来の超遠心分離法で調製された天然の293T-EVの収率(≈5.5 × 106/1 × 106セル)よりも最大約100倍高い(図4A)。
さらに、ウェスタンブロッティングの結果、BMSC-EMにはEVと同じタンパク質バイオマーカー(CD63およびアネキシン)が含まれていることが示されました。EMとEVはどちらもカルネキシンの発現が陰性であり、この方法で産生されたEMは原形質膜の汚染がほとんどないことが示唆されています(図3C)。EMとEVの間にタンパク質濃度に有意差はなく、BMSC-EMとBMSC-EVは、BCAタンパク質アッセイキットを介して、11.15μg/1×109 粒子および14.71μg/1 ×109 粒子の同様の総タンパク質濃度を示しました。さらに、293T-EMおよび293T-EVは、それぞれ約31.8μg/1 × 109 粒子および9.95μg/1 × 109 粒子の総タンパク質濃度を示しました(図4B)。これらの結果は、EMが天然EVと類似したタンパク質組成を持っていることを示している。EMがエンドサイトーシスできるかどうかを検出するために、PKH26標識EMおよびEVをBMSCおよびID8と1 × 109 粒子/mLの濃度で8時間共インキュベートし、共焦点蛍光顕微鏡で細胞を観察し、EMがEVと同様に細胞に容易に取り込まれて作用することを確認しました(図5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig01.jpg"> 図1:磁気アシスト高速均質化法の模式図。ステップ1:細胞はエンドサイトーシスによってIONPをエンドソームに内在化します。ステップ2:低張処理および均質化後に、IONP負荷エンドソームを含む細胞小器官を収集する。ステップ3:IONPをロードしたエンドソームを磁気分離により精製します。ステップ4:エンドソームは均質化され、単分散ナノベシクルに再構成されます。ステップ5:遊離IONPおよびIONP負荷EMを磁気分離により除去し、IONPフリーEMを回収します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig02v2.jpg"> 図2:EM調製条件の最適化 (A)時間を5分に設定した場合の均質化速度変化に対するBMSC-EMの直径とPDIをDLSで分析した。(B)均質化速度を140×gに設定した場合の均質化時間変化に対するBMSC-EMの直径とPDIをDLSで解析した。(C)異なる保管時点におけるBMSC-EMの直径とPDIをDLSで分析した。(D)時間を5分に設定した場合の均質化速度変化に応答するBMSC-EMの直径と濃度をNTAで分析した。(E)均質化速度を140×gに設定した場合の均質化時間変化に応じたBMSC-EMの直径と濃度をNTAで分析した。(F)BMSC細胞と異なる濃度のIONPsとの共インキュベーションに応答するBMSC-EMの直径と収量をNTAで分析しました。p &lt; 0.0001 です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig03.jpg"> 図3:EMの特性評価 。 (A)エンドサイトーシスされたIONP、エンドソーム、およびEMを持つ親細胞の形態のTEM特性評価。スケールバーは 500 nm を表します。(B)BMSC-EM、BMSC-EV、293T-EM、および293T-EVの流体力学的直径はNTAによって特徴付けられます。(C)BMSC-EM、BMSC-EV、およびBMSC細胞溶解物のウェスタンブロット解析結果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig04.jpg"> 図4:EMの歩留まりはEVよりも高い 。 (A)BMSCと293Tから調製したEMとEVの歩留まりをNTAで分析した。(B)BMSCおよび293Tから調製したEMおよびEVのタンパク質収量。 **p &lt; 0.01。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig05.jpg"> 図5:BMSCとID8によって取り込まれたPKH26標識されたEVおよびEMの代表的な蛍光顕微鏡画像。 スケールバーは10μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

本稿では、天然の細胞外小胞(EV)の生物学的起源と構造、形態、タンパク質組成が類似する新しいタイプのエクソソーム模倣体(EM)として、エンドソーム由来ナノベシクルの大規模生産のための磁気分離支援高速ホモジナイズ法について述べる。

Extracellular vesicles (EVs) have attracted significant attention in physiological and pathological research, disease diagnosis, and treatment; however, ...

本研究では、エクソソーム模倣体の大規模で再現性のある生産法の開発という、エクソソーム研究における重要なアンメットニーズに応えようとしています。ネイティブ回避の概念により、エクソソーム模倣物(EMS)は、リアルエクスクルージョンや超遠心分離ベースのろ過などの方法によって代替として製造されてきました。確かに、ほとんどのエクソソーム模倣物は、細胞全体を直接排除したものであり、最小限の生物学的機能を示しますが、細胞破片や細胞小器官によって汚染されることは避けられません。細胞外小胞は、生物医学研究、特に疾患治療において大きな注目を集めています。しかし、超高感度ろ過、内部排除、触媒グリフなどの従来のEV分離技術は、収率が低く、プラウダウン品質の生産性が低く、高価でエンジニアリング集約的な生産設備を必要とするため、EVの臨床的需要を満たすことができません。私たちの研究は、エクソソーム模倣体の産生をスキャンするためのシンプルでコストのかからない方法を提供しました。私たちは、磁性ナノ粒子が細胞内エンドソーム内にのみ取り込まれ、他の細胞小器官には取り込まれないというユニークな生物学的発見を利用しています。したがって、エンドソームを均一なナノセスコースに定式化することができます。この方法は、EMEを効果的に改善し、コストを削減します。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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エンドソーム由来小胞の大量生産のための磁気分離支援高速均質化法

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