Name: 難治性植物の プランタ内 変態のための真空強制農業浸透:ケーススタディとしてのカカオ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 学ぶ局所真空浸透法によるカカオの遺伝子導入技術。大規模熱帯植物の難治性組織へのAgrobacterium tumefaciensを用いた効率的な形質転換プロトコルで、ベタレイン蓄積による可視的な導入成功指標を確認できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Licに感謝します。ヘスス・フエンテス・ゴンサレス氏とネストル・イバン・ロブレス・オリバレス氏には、ビデオ映像の撮影に協力していただきました。CIATEJ(テオブロマ・カカオ 植物)のアントニア・グティエレス・モラ博士からの寛大な贈り物に感謝します。また、CIATEJとメキシコのLaboratorio Nacional PlanTECCの施設支援にも感謝します。H.E.H.D.(CVU:1135375)は、Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México(CONAHCYT)の資金提供を受けて修士研究を実施しました。R.U.L.は、ハリスコ州サンフランシスコ市立技術研究所(COECYTJAL)およびメキシコ・ハリスコ州イノバシア工科大学事務局(SICYT)(助成金7270-2018)の支援に感謝の意を表します。

1. アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の培養
<ol><li>Agrobacterium tumefaciens株LBA4404のエレクトロコンピテントセルを解凍します。</li>
	<li>酵母麦芽(YM; 表1)17 mm x 100 mmの培養チューブにブロスを入れます。このチューブは後で使用するために保存し、室温(RT)で保管してください。</li>
	<li>1.5 mLのマイクロチューブに、30 μLの解凍した アグロバクテリウム 細胞と100-250 ng(最大5 μL)の 35S:RUBYを含むDNAを加えます。穏やかに混ぜます。 注: 35S:RUBY はYunde Zhaoからの贈り物です。サンプルのアーク放電を防ぐには、イオン性化合物の存在をできるだけ減らしてください。これらのイオン性化合物は、DNA19のエタノール沈殿からの残存塩であってもよい。</li>
	<li>この時点で、1mmのエレクトロポレーションキュベットを氷の上に置きます。</li>
	<li>前の懸濁液を冷やした1 mmのエレクトロポレーションキュベットに移します。すべてを氷の上に置いてください。キュベットの金属電極を拭きます。</li>
	<li>エレクトロポレーターを Agr (2.2 kV、~5 ms、1パルス)に設定します。キュベットをエレクトロポレーションチャンバー内に置きます。</li>
	<li>パルスボタンを押します。パルスパラメータを登録します。サンプルがアーク状に傾いた場合、エレクトロポレーションプロセスは失敗しました。 注:パルスの直後に細胞をYMブロスにすばやく移すことが重要です。この転移を遅らせると、形質転換効率20が劇的に低下する可能性がある。</li>
	<li>すぐに、保存したYMブロスを使用して、細胞をキュベットから17 mm x 100 mmのチューブに移します。細胞を穏やかに再懸濁します。</li>
	<li>形質転換した細胞をオービタルインキュベーターで28°C、250rpmで3時間インキュベートします。 注:この培養物には抗生物質は含まれていません。適切な無菌状態に注意してください。</li>
	<li>この培養液を選択的YM寒天プレート21にストリークする。形質転換LBA4404-RUBY株の場合、これらのプレートにリファンピシン(25 μg/mL)、スペクチノマイシン(50 μg/mL)、およびストレプトマイシン(50 μg/mL)が含まれていることを確認してください。このプレートを28°Cのスタンディングインキュベーターで一晩インキュベートします。 注:このプロトコルでは、スペクチノマイシン(50 μg/mL)に対する細菌耐性を付与し、浸潤した植物組織のビジュアルレポーターとして機能するベ クター35S:RUBY を使用しました。</li>
	<li>YMブロスとLuria Bertani(LB)ブロスの混合物12.5 mL(それぞれ9:1の割合)、10 mMのMES、pH 5.722で一晩培養したコロニーを接種します。この選択的液体培地に、ステップ1.10で使用したものと同じ抗生物質が含まれていることを確認してください。これらの培地の成分と濃度については、 表1 を参照してください。<ol><li>アグロバクテリウムをインキュベートするときは、培養に十分な曝気スペースを、液体量の約4〜5倍残してください。アグロバクテリウム株LBA4404にはYMブロスを使用して、細胞の凝集を防ぎます23。</li>
	</ol></li>
	<li>培養液を28°Cのオービタルインキュベーターで250rpmで16時間インキュベートします。</li>
	<li>ステップ1.11で使用したのと同じ培地で、培養を初期容量の10倍までスケールアップします。</li>
	<li>培養液を28°Cのオービタルインキュベーターで16時間250rpmインキュベートします。</li>
	<li>一晩培養した光学濃度(OD600)を0.4に調整します。20 μMのアセトシリンゴン(AS)を添加します。</li>
	<li>28°CのオービタルインキュベーターでOD600 が約1.0に達するまで250rpmでインキュベートします。</li>
	<li>細胞を4,500 x g で20°Cで10分間遠心分離します。</li>
	<li>ペレットを懸濁液(10 mM MES、10 mM MgCl2、pH 5.7)で再懸濁し、OD600 を0.6に調整します。200 μM AS24 を添加します。 注:懸濁液を28°Cで予備インキュベートします。 懸濁液を添加したときに冷えていると、細胞が沈殿します。</li>
	<li>細菌懸濁液を暗所および25°Cで2〜24時間放置します。 攪拌は必要ない22.</li>
</ol>2. 植物の選定
<ol><li>アグロインフィルトレーションに最適な段階にある葉を持つ枝を持つ植物を選択してください。 注:植物は成長した木でも成熟した木でもかまいません。カカオはC期の若葉がおすすめです。これらの葉は青銅色から薄緑色です。それらは完全に拡張されておらず、ステージDの葉25(図1)ほど硬くもありません。<ol><li>対照として、他の植物(例えば、 Nicotiana tabacum)に対して、使用した菌株およびベクターについて報告されている高い農業浸透効率で同時にagroinfiltrationを実行します。 注:このコントロールで肯定的な結果が得られない場合、否定的な結果は、使用されたひずみまたはベクトルが原因である可能性があります。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 真空チャンバーのセットアップ
<ol><li>真空チャンバーとして、真空計を備えたデシケーターを使用して、内部の真空圧力を測定します。</li>
	<li>ステップ1.19のアグロバクテリウム懸濁液に250μMのジャスモン酸(JA)18,26を加えます。</li>
	<li>アグロバクテリウム培養液を広口ビーカーに移し、選択した枝と葉を沈めます。次に、アグロバクテリウム培養液の入ったビーカーをデシケーター内に置きます。</li>
	<li>デシケーターとその蓋の間に枝を置きます。目的の葉を アグロバクテリウム 培養液の中に沈めてください。次に、植物の枝がデシケーターに入ることができる切り欠きのある丸いリングであるジャンプリングを使用します。ジャンプリングは、デシケーターの下部と上部の間のスペーサーとしても機能します。</li>
	<li>ガスケットが蓋で押しつぶされないように構造的に十分に安定しており、デシケーターの円周に合わせて曲げて調整するのに十分な柔軟性があり、多孔質材料でできていないことを確認してください。 注:この研究では、ガスケットに似た非多孔質プラスチック材料でコーティングされた、いくつかの小さなワイヤを撚り合わせた撚り線金属線を使用しました(図2)。</li>
	<li>枝をデシケーターに固定するには、シリコン印象材を使用します。材料が粘着性があり、非多孔質で、デシケーターとプラントに対して化学的に不活性であり、枝、ガスケット、およびデシケーターの間の小さな隙間を簡単に塗布して埋めることができることを確認してください。</li>
	<li>シリコーン印象材が重合し(これには約1分かかります)、枝を所定の位置に固定したら、デシケーターを閉じます。隙間を残さないように注意してください。</li>
	<li>デシケーターを真空ポンプに接続します(図3)。</li>
</ol>4.真空浸透
<ol><li>-0.07MPaになるまで真空ポンプを始動します。</li>
	<li>この圧力に達したら、圧力バルブを閉じ、真空ポンプをオフにします。この圧力を5分間維持します。</li>
	<li>圧力バルブを開いて、チャンバーの圧力を回復します。 注: これは重要な手順です。チャンバーの圧力を徐々に着実に回復させます。デシケーターを完全に再加圧するには、最大3分かかる場合があります。長時間の再加圧は、組織10の内部に浸潤する細菌の数を増加させる。</li>
	<li>このプロセスをさらに2回繰り返します。</li>
	<li>細胞懸濁液とデシケーターから枝を取り除きます。</li>
	<li>浸潤した葉を蒸留水できれいにします。</li>
</ol>5.浸透葉の孵化
<ol><li>浸潤した葉を25°Cの暗所で48時間放置します。</li>
	<li>次に、浸潤した組織を16/8時間の明暗日長に曝露します。</li>
	<li>感染後3〜7日(DPI)の一過性の葉の変化を評価します。</li>
</ol><img alt="葉の成長段階図、A-E、スケールバー10cm、植物学研究、発生生物学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66024/66024fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:カカオは発育段階を離れる。 (A-E) 発達段階25.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66024/66024fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="ゲージ、蓋、シール、バルブ、チャンバー、ホースを備えた真空デシケーターセットアップ図。乾燥に使用されます。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66024/66024fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:真空チャンバーの構成とそのコンポーネント。 真空チャンバーは、真空計に接続されたデシケーターです。ガスケット/Oリングは、枝が配置される開口部があるように切断されています。(A)真空計、(B)蓋、(C)ガスケット/Oリング、(D)圧力バルブ、(E)デシケーター、(F)ホース。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66024/66024fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="水蒸気圧測定のための真空セットアップによる植物蒸散実験図" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66024/66024fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3: プランタ 真空農業浸透システム内。 浸透プロセス中の真空損失を回避するには、デシケーターへの分岐とガスケット/Oリングをシリコーン印象材で固定することが重要です。(A)カカオ植物、(B)真空チャンバー、(C)シリコーン印象材、(D) アグロバクテリウム 懸濁液に沈めた葉、(E)真空ポンプ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66024/66024fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

Agrobacterium tumefaciensを用いたカカオ植物のプランタ一過性形質転換

<ol><li>Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYang%2C+J+%22Molecular+Pharmacognosy%22">Molecular Pharmacognosy</a>. , Springer, Singapore. (2019).</li>
<li>Janssen, B. J., Gardner, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+transient+expression+of+GUS+in+leaf+discs+following+cocultivation+with+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium.</a> Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+analysis+of+in+vivo+phosphorylation+sites+of+the+Arabidopsis+BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1+receptor+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and functional analysis of in vivo phosphorylation sites of the Arabidopsis BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1 receptor kinase.</a> Plant Cell. 17 (6), 1685-1703 (2005).</li>
<li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assembly+of+the+sorgoleone+biosynthetic+pathway+and+its+impact+on+agroinfiltrated+leaves+of+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">In vivo assembly of the sorgoleone biosynthetic pathway and its impact on agroinfiltrated leaves of Nicotiana benthamiana.</a> The New Phytologist. 230 (2), 683-697 (2021).</li>
<li>Manavella, P. A., Chan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+sunflower+leaf+discs+via+an+agrobacterium-mediated+method%3A+Applications+for+gene+expression+and+silencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of sunflower leaf discs via an agrobacterium-mediated method: Applications for gene expression and silencing studies.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1699-1707 (2009).</li>
<li>Guo, M., Ye, J., Gao, D., Xu, N., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+horizontal+gene+transfer%3A+Mechanism%2C+biotechnological+application%2C+potential+risk+and+forestalling+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated horizontal gene transfer: Mechanism, biotechnological application, potential risk and forestalling strategy.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 259-270 (2019).</li>
<li>He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+for+noninvasively+monitoring+gene+expression+and+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation.</a> Horticulture Research. 7 (1), 152(2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+efficient+method+of+Agrobacterium+syringe+infiltration+for+transient+transformation+and+its+application+in+the+elucidation+of+gene+function+in+poplar%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">An improved and efficient method of Agrobacterium syringe infiltration for transient transformation and its application in the elucidation of gene function in poplar.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 54(2021).</li>
<li>Leuzinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+agroinfiltration+of+plants+for+high-level+transient+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 77, 50521(2013).</li>
<li>Chincinska, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf+infiltration+in+plant+science%3A+old+method%2C+new+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities.</a> Plant Methods. 17 (1), 83(2021).</li>
<li>Simmons, C. W., Vandergheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+agrobacterium+tumefaciens+vacuum+infiltration+into+harvested+leaf+tissue+and+subsequent+in+planta+transgene+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (3), 965-970 (2009).</li>
<li>Cao, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium+-mediated+transient+expression+of+heterologous+genes+in+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium -mediated transient expression of heterologous genes in spinach.</a> Plant Biotechnology Reports. 11, 397-405 (2017).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+the+perennial+woody+Paeonia+ostii%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in the perennial woody Paeonia ostii.</a> PeerJ. 7, ee7001(2019).</li>
<li>Prasad Babu, K., Maligeppagol, M., Asokan, R., Krishna Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+multi-virus+resistant+RNAi+construct+in+cowpea+through+transient+vacuum+infiltration+method%5BTitle%5D)+AND+%22Virusdisease%22%5BJournal%5D)">Screening of a multi-virus resistant RNAi construct in cowpea through transient vacuum infiltration method.</a> Virusdisease. 30 (2), 269-278 (2019).</li>
<li>Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+MARK+cascades%2C+NPR1%2C+and+TGA+transcription+factors+play+a+role+in+Pto-mediated+disease+resistance+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two MARK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (6), 905-917 (2003).</li>
<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+for+Asteraceae-a+reverse+genetics+approach+for+functional+genomics+in+Gerbera+hybrida%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing for Asteraceae-a reverse genetics approach for functional genomics in Gerbera hybrida.</a> Plant Biotechnology Journal. 10 (8), 970-978 (2012).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TRV-mediated+VIGS+for+functional+genomics+research+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%2C+Tissue+and+Organ+Culture%22%5BJournal%5D)">Use of TRV-mediated VIGS for functional genomics research in citrus.</a> Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 139 (3), 609-613 (2019).</li>
<li>Salazar-González, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-planta+transient+transformation+of+avocado+%28Persea+americana%29+by+vacuum+agroinfiltration+of+aerial+plant+parts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tissue+Organ+Cult%22%5BJournal%5D)">In-planta transient transformation of avocado (Persea americana) by vacuum agroinfiltration of aerial plant parts.</a> Plant Cell Tissue Organ Cult. 152, 635-646 (2023).</li>
<li>Bio-Rad. MicroPulserTM  electroporation apparatus operating instructions and applications guide. The Bio-Rad Literature Library, Rev B Bulletin# M4006174 at. , www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006174B.pdf (2010).</li>
<li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li>
<li>GoldBio. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Electrotransformation+of+Agrobacterium+tumefaciens+Protocol%22">Electrotransformation of Agrobacterium tumefaciens Protocol</a>. , https://goldbio.com/documents/3906/Electrotransformation%20of%20agrobacterium%20tumefaciens.pdf (2018).</li>
<li>Lindbo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRBO%3A+a+high-efficiency+tobacco+mosaic+virus+RNA-based+overexpression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRBO: a high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-based overexpression vector.</a> Plant Physiology. 145 (4), 1232-1240 (2007).</li>
<li>Rajasekaran, K. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation of Cotton. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRajasekaran%2C+K+%22Transgenic+Crops+of+the+World%22">Transgenic Crops of the World</a>. Curtis, I. S. , Springer, Dordrecht. (2004).</li>
<li>Llave, C., Kasschau, K. D., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-encoded+suppressor+of+posttranscriptional+gene+silencing+targets+a+maintenance+step+in+the+silencing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13401-13406 (2000).</li>
<li>Fister, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+transient+expression+system+for+functional+genomics+in+the+tropical+tree+Theobroma+cacao+L%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: transient expression system for functional genomics in the tropical tree Theobroma cacao L.</a> Plant Methods. 12, 19(2016).</li>
<li>Jung, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+mediated+transient+expression+of+plant+cell+wall-degrading+enzymes+in+detached+sunflower+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens mediated transient expression of plant cell wall-degrading enzymes in detached sunflower leaves.</a> Biotechnology Progress. 30 (1), 905-915 (2014).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (2), 259-273 (2005).</li>
<li>Keith, C. V., Ramos-Sobrinho, R., Marelli, J. -P., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+infectious+clone+of+the+Badnavirus+Cacao+Swollen+Shoot+Ghana+M+Virus+and+infectivity+by+gene+gun-+and+Agrobacterium-mediated+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Agronomy%22%5BJournal%5D)">Construction of an infectious clone of the Badnavirus Cacao Swollen Shoot Ghana M Virus and infectivity by gene gun- and Agrobacterium-mediated inoculation.</a> Frontiers in Agronomy. 3, 774863(2021).</li>
<li>Fister, A. S., Landherr, L., Maximova, S. N., Guiltinan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+CRISPR%2FCas9+machinery+targeting+TcNPR3+enhances+defense+response+in+Theobroma+cacao%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Transient expression of CRISPR/Cas9 machinery targeting TcNPR3 enhances defense response in Theobroma cacao.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 268(2018).</li>
<li>Grützner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+betalain+biosynthesis+in+tomato+for+high+level+betanin+production+in+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Engineering betalain biosynthesis in tomato for high level betanin production in fruits.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 682443(2021).</li>
<li>Saifi, S. K., Passricha, N., Tuteja, R., Kharb, P., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+transformation%3A+A+smart+way+of+crop+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Advancement+in+Crop+Improvement+Techniques%22%5BJournal%5D)">In planta transformation: A smart way of crop improvement.</a> Advancement in Crop Improvement Techniques. 21, 351-362 (2020).</li>
<li>Huda, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OsACA6%2C+a+P-type+IIB+Ca2%2B+ATPase+promotes+salinity+and+drought+stress+tolerance+in+tobacco+by+ROS+scavenging+and+enhancing+the+expression+of+stress-responsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">OsACA6, a P-type IIB Ca2+ ATPase promotes salinity and drought stress tolerance in tobacco by ROS scavenging and enhancing the expression of stress-responsive genes.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 76 (6), 997-1015 (2013).</li>
<li>Micheli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Genomics+of+Cacao%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Botanical+Research%22%5BJournal%5D)">Functional Genomics of Cacao.</a> Advances in Botanical Research. 55, 119-177 (2010).</li>
<li>Bailey, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+and+plant+gene+expression+during+the+colonization+of+cacao+seedlings+by+endophytic+isolates+of+four+Trichoderma+species%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Fungal and plant gene expression during the colonization of cacao seedlings by endophytic isolates of four Trichoderma species.</a> Planta. 224 (6), 1449-1464 (2006).</li>
<li>Motamayor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+and+genetic+population+differentiation+of+the+Amazonian+chocolate+tree+%28Theobroma+cacao+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Geographic and genetic population differentiation of the Amazonian chocolate tree (Theobroma cacao L).</a> PLoS ONE. 3 (10), e3311(2008).</li>
</ol>

著者は、利益相反を宣言することはありません。

本研究では、カカオ植物を例に、木本植物の プランタ一 過性形質転換のための効率的で低コストな農業浸透プロトコルを提示した。葉のクチクラが植物組織の形質転換に及ぼす制約はよく知られているため、通常はこの手順に抵抗する木本植物の真空による農業浸透を促進する戦略の開発に集中しました。
真空チャンバー内の真空圧は、デシケーター、木の枝、ガスケット/Oリング、デシケーターの蓋の間にできた小さな隙間を効率的に密閉し、充填することでのみ可能であり、これがプロトコルの主な課題でした。このため、シリコーン印象材を使用して分岐をデシケーターに固定することが重要です。この材料は非多孔質で、枝をデシケーターとガスケットに付着させるのに十分な粘着性があり、化学的に不活性であることが証明されているため、浸潤した枝もデシケーターも損傷しません。
さらに、真空ポンプを使用して葉部内の圧力勾配を達成する必要があり、気孔腔と葉肉領域から空気が吸い出され、再加圧中の大きな圧力勾配により、 アグロバクテリウム 懸濁液が気孔と傷口を...

植物の遺伝子組み換え法は、遺伝子の生物学的機能を調べるために不可欠であり、ポストゲノム時代に予測される多数の未解明遺伝子を考えると、今日では特に有用である1。これらの方法は、完全に形質転換された系統を取得したり、遺伝子を一過性に発現させたりするために使用できます。宿主が取り込んだ外来DNAが宿主ゲノムに完全かつ不可逆的に組み込まれ、遺伝子組み換えが次の世代に受け継がれることで、安定した形質転換が起こります。一過性形質転換として知られる一過性発現は、 アグロバクテリウム によって細胞内に移植されたT-DNAの複数のコピーから発生し、宿主ゲノムに組み込まれておらず、感染後2〜4日でピークに達します2。 
一過性発現アッセイは、遺伝子の機能的特性評価に十分であり、安定した形質転換よりもいくつかの利点があることは注目に値します。例えば、一過性形質転換では、組織培養ベースの再生手順は必要ありません。もう一つの利点は、シロイヌナズナ3やニコチアナ・ベンサミアナ4などのモデル植物種で十分に標準化されたプロトコルのいくつかの成功例であるが、非モデル種5ではまだ限られている遺伝子のplanta機能解析と互換性があることである。
一過性アッセイの開発は、効率的な遺伝子導入法の利用可能性に依存しています。このため、最も一般的なアプローチは、DNAを植物細胞に移植するアグロバクテリウムのユニークな能力を利用するアグロバクテリウム浸潤に基づいています6。これらの分析には、緑色蛍光タンパク質(GFP)、β-グルクロニダーゼ(GUS)、ルシフェラーゼ、RUBYなどのレポーター遺伝子の使用も有用なツールであり、これらはすべて形質転換イベントの追跡に用いられます。これらのレポーターシステムの中で、RUBYは現在最も可視化が容易であり、3つの酵素ステップ反応によるチロシンのベタレインへの変換に依存しています。他のレポーターシステムとは対照的に、得られたベタレインは、高度な装置や追加の反応物を必要とせずに、形質転換された植物組織上の明るい色の色素として容易に観察することができます7。
アグロバクテリウム懸濁液を葉肉の細胞間空間に浸潤させる場合、アグロ感染を成功させるための最も重要なステップは、葉の表皮クチクラによって課せられる物理的障壁を克服することです8。一部の植物では、Nicotiana benthamiana9で発生するように、針なしシリンジ(シリンジAgroinfiltration)で作成された圧力勾配が効率的な農業浸透に十分であるが、他の植物種は、真空ポンプ10の助けを借りて作成されたようなより大きな圧力勾配を必要とする場合がある。真空アシストプロセスでは、アグロインフィルトレーションは2つのステップで行われます。最初のものでは、真空は植物材料を減圧する役割を果たし、気孔や創傷を通して葉肉の空気空間からガスを強制的に放出します。その後、再加圧段階では、アグロバクテリウム懸濁液が気孔および創傷を介して細胞間空間に浸潤する11。
シリンジ浸潤と比較して、真空浸潤は、より高い使用頻度、再現性、および浸透プロセスのあらゆる段階で圧力および持続時間を制御する能力を可能にする10。ほうれん草(Spinacia oleracea)12、牡丹(木本多年生植物)(Paeonia ostii)13、ササゲ(Vigna unguiculata)14などの異なる植物種の葉では、真空農業浸透プロトコルは、シリンジ浸透よりも深い浸透率を達成しました。同様に、トマト(Lycopersicon esculentum)15、ガーベラ(Gerbera hybrida)16では、真空農業浸潤はシリンジ浸潤よりも強力で均一な遺伝子サイレンシングを引き起こした。真空浸潤のさらなる利点は、最近3つの柑橘類品種(Fortunella obovata、 Citrus limon、 C. grandis)で観察された注射器浸潤と比較して、遺伝子型への依存性が低いことです17。しかし、デシケーターに収まらないほど大きすぎる植物に真空農業浸透を適用しようとすると、熱帯の木本植物で典型的に発生するように、真空チャンバーのサイズが制限になる可能性があります。
以下では、真空チャンバーの空間的限界を克服し、カカオ葉のプランタ一過性形質転換におけるその有用性をテストするプロトコルについて説明します。カカオの最初の局所真空浸透法を提示し、追加の機器を必要とせず、植物全体の浸透に使用されるのと同じ実験室用デシケーターの使用さえ可能にしますが、真空チャンバー内の植物の一部へのアクセスを可能にする簡単な適応で、植物開発のさまざまな段階での使用を可能にします。今回提案した局所真空浸透法の有用性を検証するため、形質転換が困難な大葉熱帯植物種の代理としてカカオを選定した。この局所浸潤法を用いて、アグロバクテリウムを介した真空浸潤によるアボカドのオオバコ一過性発現を、これまで剥離葉に最適化していた条件で初めて報告し18、本稿ではカカオにおけるオオバコ一過性発現を初めて報告する。

<table><tbody><tr><td>35S:RUBYプラスミド</td><td>Addgene</td><td>160908</td><td>http://n2t.net/addgene:160908;RRID:Addgene_160908</td></tr><tr><td>1mmエレクトロポレーションキュベット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>FB101</td><td>フィッシャーブランド&nbsp;エレクトロポレーションキュベットプラス</td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>Bel-Art SP SCIENCEWARWE</td><td>F42400-2121</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>LABCONCO</td><td>700402040</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8281-500G</td><td>YM媒体用 0.38 g/L</td></tr><tr><td>LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium</td><td>Intact Genomics USA</td><td>1285-12</td><td>を追加https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/</td></tr> <tr><td>マンニトール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63560-250G-F</td><td>YM媒体用 10 g/L</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHG0003</td><td>(LB、YMおよび再懸濁媒体用) 1.95 g/L (10mM)</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>再懸濁媒体用 0.952 g/L (10 mM)</td></tr><tr><td>MgSO4&middot;7H20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138-1KG</td><td>YM媒体用 0.204 g/L</td></tr><tr><td>MicroPulser エレクトロポレーション装置</td><td>Biorad&nbsp;</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Karal</td><td>60552</td><td>LBミディアムの場合、5 g / Lを追加します。YMミディアムの場合は、0.1 g/L</td></tr><tr><td>NanoDrop OneマイクロボリュームUV-Vis分光光度計</td>を追加してください <td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>プレジデントシリコーン印象材</td><td>コルテン</td><td>60019938</td><td></td></tr><tr><td>リファンピシン&nbsp;</td><td>ゴールドバイオ</td><td>R-120-1</td><td>(100 mg / mL)</td></tr><tr><td>シリコーン印象材料ガン</td><td>Andent</td><td>TBT06</td><td></td></tr><tr><td>スペクチノマイシン</td><td>ゴールドバイオ</td><td>S-140-SL10</td><td>(100 mg / mL)</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>ゴールドバイオ</td><td>S-150-SL10</td><td>(100 mg / mL)</td></tr><tr>カゼインシ<td>グマアルドリッチ</td><td>95039-1KG-F</td><td>からのトリプトン酵素消化</td>物LB<td>培地の場合、10 g / L</td></tr><tr><td>酵母を追加します抽出</td><td>物 MCD LAB</td><td>9031</td><td>LBミディアムの場合、5 g / Lを追加します。YMミディアムの場合、0.4 g / Lを追加します</td></tr></tbody></table>

難治性植物の プランタ内 変態のための真空強制農業浸透:ケーススタディとしてのカカオ

Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study

一過性の プランタ 形質転換は、植物の遺伝的形質転換のための迅速で費用対効果の高い代替手段です。 Plantaの 変形のためのほとんどのプロトコルはア グロバクテリウム仲介された変形の使用に頼る。しかし、現在使用されているプロトコルは、大型プラントを真空処理にかけることの物理的および経済的制約により、小規模プラント向けに標準化されています。この研究は、大型植物用にカスタマイズされた局所的な真空ベースの農業浸透のための効果的なプロトコルを提示します。提案手法の有効性を評価するため、遺伝子組み換えに抵抗性のある熱帯植物種であるカカオ植物での使用を検証しました。私たちのプロトコールでは、カカオ葉の局所的な地上部に最大0.07MPaの真空を繰り返し適用することができ、付着した葉の細胞間空間に アグロバクテリウム を強制的に浸透させることが可能になりました。その結果、ア グロバクテリウムを介した付着カカオ葉の プランタ 形質転換における一過性現象をRUBYレポーターシステムで発現させることに成功しました。また、これはア グロバクテリウムが媒介する初めての プランタ 一過性カカオの形質転換です。このプロトコルは同じようなサイズの抑制の他の植物種に真空基づかせていたagroinfiltration方法の適用を可能にし、recalcitrant木質、大型種の遺伝子の planta の性格描写のためのドアを開ける。

このプロトコルは大型の木本植物のための有効なagroinfiltration方法を示す。このプロトコルにより、真空圧-0.07MPaを達成し、カカオ葉の効果的で局所的な浸透を実現しました。 図4では、浸透システムのセットアッププロセスを観察し、 図5では最終的な構成を観察しています。
<img alt="植物蒸散測定のセットアップ。センサーの応用、実験室実験で示されたシールプロセス。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66024/66024fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:真空チャンバーのセットアップ。 (A</str...

ここでは、大型植物の遺伝的形質転換の in vivo 研究のための局所真空浸透のための最初のプロトコルを紹介します。この方法論を用いて、 アグロバクテリウムを介したカカオ のプランタ 一過性形質転換を世界で初めて達成しました。

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation ...

熱帯多年生種や園芸樹木作物における遺伝子の生物学的機能を調べるためには、生体内遺伝学的手法が必要です。しかし、これらの種の多くは、すべての世代における変化に抵抗的です。本研究は、大型植物に適用可能な簡便かつ効率的な遺伝子組み換え法の開発を目的としています。事を図解します。アグロバクテリウムを介した組織への浸潤が困難な植物の遺伝子組み換えは、真空ポンプを用いた強制浸潤によって可能になりました。しかし、現在使用されているプロトコルは、大型プラントを真空チャンバーに投入するという物理的および経済的な制約により、小規模プラントに限定されています。通常、実験室の乾燥剤である真空チャンバーのサイズは、熱帯の木本植物の場合のように、乾燥剤に収まらない大きすぎる植物の真空浸透を防ぎます。我々は、熱帯木本植物の効率的な局所真空浸透のためのプロトコルを開発し、大型植物種のin vivo遺伝子形質転換研究を可能にしました。このプロトコルにより、カカオやアボカドなどの園芸樹木作物におけるアグロバクテリウムを介した真空浸潤に対する植物のサイズ制限を克服することができました。組織培養フリー アグロバクテリウムを介した局所的な真空浸潤による付着葉の形質転換は、高価な機器を追加する必要がなく、同じポンプと真空容器を使用できるため、すでに真空浸潤を使用しているラボでも、迅速、簡単、かつ費用対効果の高い方法で行うことができます。

vacuum-forced-agroinfiltration-for-planta-transformation-recalcitrant

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単​​で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告...

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

アグロインフィルトレーションおよびPVXのアグロパネシスは、植物の遺伝子の一過性異所性発現に関する日常的な機能アッセイです。これらの方法は、エフェトロミクス戦略(迅速抵抗性およびアビルール遺伝子発見)における効率的なアッセイであり、分子植物病理における現代研究にとって極めて重要である。プラントでの堅牢な高スループット機能分析の需要に対応します。...

ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

アグロバクテリウムは、（タバコモザイクウイルスベース）の起動ベクタを運ぶと真空浸透に基づいてタバコ植物での一過性のタンパク質生産は、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を生産するための迅速かつ経済的なアプローチです。我々は、手順を簡略化し、細菌培養の条件を最適化する宿主種の選択、RNAサイレンシング抑制因子を共導入することにより、目標蓄積を改善した。...

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

この研究では、異なる生産プラットフォームにおける標的ヒト組換えタンパク質の発現が比較されました。私たちは、従来の発酵槽ベースの培養物と植物に焦点を当て、各システムのセットアップを説明し、報告された結果に基づいて、各プラットフォームに固有の制限と利点を強調しました。...

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

ベンサミアーナ タバコ葉の生合成酵素の過渡の異種発現は新トリテルペン高付加価値製品の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。ここは、トリテルペン、この強力な植物ベースのプラットフォームを活用した類縁体の急速 (5 日間)...

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

植物形態素遺伝子は、再生成遺伝型の遺伝子変換を改善するために使用することができる。ここに記載されているのは、3つの重要な公共トウモロコシ近交線のためのアグロバクテリウム媒介遺伝形質転換(QuickCorn)プロトコルである。...

アグロバクテリウム-形態新生遺伝子を用いた再カルシトランストウモロコシ近交線の媒介性不成熟胚変態

様々な研究分野でのモデル種としての汎用性が高いため、オオバコ(Plantago lanceolata)の遺伝子形質転換ツールキットが必要です。 ここでは、...

アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介したナローリーフオオバコの遺伝子形質転換

プロトコルは シロイヌナズ ナの第一次花序の茎および Brassicaのnapusの hypocotylsを使用して毛が付いている根の誘導を記述する。毛むくじゃらの根は培養され、トランスジェニック植物を再生するための外植片として使用できます。...

シロイヌナズナとアブラナ属の毛根の変形と再生

このプロトコルは、効率的なキャベツ葉肉プロトプラストシステムについて説明しています。さまざまな酸素欠乏治療が試験され、システムは低酸素反応性遺伝子の高い活性化を示し、 アブラナ科...

アブラナ属の低酸素耐性を研究するためのキャベツプロトプラストシステムの開発

私たちは、P. capsiciにも応用可能な、P.

アグロバクテリウム媒介によるフィトフトラ・パルミヴラの簡易化方法

学ぶ局所真空浸透法によるカカオの遺伝子導入技術。大規模熱帯植物の難治性組織へのAgrobacterium tumefaciensを用いた効率的な形質転換プロトコルで、ベタレイン蓄積による可視的な導入成功指標を確認できます。

難治性植物のプランタ内変態のための真空強制農業浸透:ケーススタディとしてのカカオ

さらに動画を探す

難治性植物の プランタ内 変態のための真空強制農業浸透:ケーススタディとしてのカカオ

さらに動画を探す

難治性植物のプランタ内変態のための真空強制農業浸透:ケーススタディとしてのカカオ