Name: CRISPR-Cas9システムを用いた RIP1 ノックアウトU937細胞株の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶCRISPR-Cas9を用いたRIPK1ノックアウトU937細胞株の作製法。遺伝子編集の効率性や実験課題への対処法を含み、細胞シグナル伝達と遺伝学研究への応用可能性を示します。

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</ol>

<table><tbody><tr><td>調整済みDMEM媒体</td><td>ギブコ</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>シグマ</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>ビスベンズイミド Hoechst 33342 三塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>完全なRPMI-1640ミディアム</td><td>シグマ</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR NTC gRNA大腸菌株</td><td>トランスオミック</td><td>TELA1011</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR RIP1 gRNA大腸菌株</td><td>トランスオミック</td><td>TEVH-1162203</td><td></td></tr><tr><td>エンドオーバーエンドローテーター</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL蛍光顕微鏡</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenEluteプラスミドMaxiprepキット</td><td>シグマ</td><td>PLX15</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG抗体、(H+L)HRP複合体</td><td>シグマ</td><td>AP307P</td><td></td></tr><tr><td>HEK293Tセル</td><td>ATCCの</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーターシェーカー</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB寒天</td><td>BDの</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>LBブロス</td><td>BDの</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>LV-MAXレンチウイルス包装ミックス</td><td>ギブコ</td><td>A43237</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOXレッド</td><td>メドケムエクスプレス</td><td>ハイ-D1055</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop分光光度計</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ネクロスタチン-1</td><td>メドケムエクスプレス</td><td>HY-14622A</td><td></td></tr><tr><td>オプティMEM</td><td>ギブコ</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>シグマ</td><td>P7255</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗ヒトRIP1 mAb</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>3493</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGEおよびウェスタンブロット装置</td><td>バイオラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&アルファ;</td><td>メドケムエクスプレス</td><td>ハイ-P7058</td><td></td></tr><tr><td>U937ヒト単球</td><td>ATCCの</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WST-1 細胞増殖アッセイシステム</td><td>タカラ</td><td>MK400</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNAトランスフェクション試薬</td><td>ロシュ・ダイアグノスティックス</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>z-VAD-FMK</td><td>APExBIOの</td><td>A1902</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9システムを用いた rip1 ノックアウトu937細胞株の作製

Generation of a RIP1 Knockout U937 Cell Line Using the CRISPR-Cas9 System

RIP1 CRISPR変異U937細胞のコンフルエント集団の作製に続いて、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を行った。ウェスタンブロット解析を使用して、RIP1タンパク質発現レベルの損失を評価することにより、RIP1 CRISPR変異細胞株の作製に成功しました。この決定は、WT U937単球とNTC細胞との比較結果に基づいて行われました。図2では、RIP1の発現は5 μg/mLのピューロマイシンRIP1 CRISPR変異体細胞では検出されませんでしたが、WT U937細胞とNTC細胞の両方で検出されました。この結果は、このプロトコルが生存可能なRIP1 CRISPR変異体を選択するための信頼性と効果的な方法であることを示しています。
RIP1 CRISPR変異体細胞におけるRIP1タンパク質発現の喪失が成功したことから、これがRIP1の機能的喪失にも等しいかどうかを判断しました。以前に確立された研究では、腫瘍壊死因子-α (...

CRISPR-Cas9システムを用いた RIP1 ノックアウトU937細胞株の作製

This protocol outlines a procedure for knocking out the RIP1 gene using CRISPR/Cas9 in the human monocyte U937 cell line. The method utilizes designated ...

私たちの研究は哺乳類プログラムの細胞死に焦点を当てており、特に高血糖の文脈におけるアポトーシスとネクロプトーシスのバランスを研究しています。ごく最近では、細胞死タンパク質 RIP1 キナーゼがネクロプトーシス中の遺伝子発現を調節することが示されています。現在の実験課題は、懸濁液で増殖する免疫細胞を遺伝子操作すること、特にCRISPR-Cas9を使用してRIP1キナーゼの遺伝子をノックアウトすることです。私たちのプロトコルには 2 つの明確な利点があります。レンチウイルスを使用して懸濁液で増殖する免疫細胞のトランスフェクション方法を改善し、CRISPR-Cas9を使用して遺伝子ノックアウトを作成するプロセス中に単一細胞クローニングの必要性を排除し、私たちの結果は、ネクロプトーシスにおける高血糖シフトにおけるRIP1キナーゼの役割を研究する道を開きました。レンチウイルスベクターを保有する大腸菌を誘導する象限ストリークを開始するには、1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを添加したLuria-BertaniまたはLB寒天プレートにRNAを誘導します。プレート上の最も希薄な領域に個々のコロニーが見えるまで、プレートを摂氏37度で1〜2日間インキュベートします。インキュベーション後、滅菌ループを使用して、単一のコロニーを選択し、50ミリリットルの円錐形チューブに1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを添加した5ミリリットルのLBブロスに加えます。チューブのキャップを通気してテープで留めます。チューブを摂氏37度、225 RPMのオービタルシェーカーで8時間インキュベートします。その間、40ミリリットルのLBブロスを加え、アンピシリン1ミリリットルあたり100マイクログラムを4本の50ミリリットルチューブに加えます。インキュベーション後、40マイクロリットルの増殖培養物を4つのチューブのそれぞれに移します。チューブのキャップを通気してテープで留めてから、摂氏37度、RPMのオービタルシェーカーで12〜16時間インキュベートします。翌日、スイングバケットローターで3, 220 x g で培養物を20分間遠心分離します。上清を廃ビーカーにデカントし、4つのペレットすべてをアンピシリンを添加した10ミリリットルのLBブロスに混ぜ合わせます。結合したペレットをスイングバケットローター内で最高速度で20分間遠心分離して単一のペレットを取得し、できるだけ多くの上清を廃ビーカーに捨てます。HEK293T細胞を6倍10の3〜5倍の濃度でDMEMを含むT25フラスコに播種します。フラスコを摂氏37度で5%の二酸化炭素とともに一晩インキュベートします。一方、プラスミドの比率を1:1:1:1、トランスフェクション試薬とプラスミドDNAを3:1の比率で、還元血清培地でトランスフェクション混合物を調製します。75マイクロリットルのトランスフェクション試薬、2, 500マイクロリットルの還元血清培地、および25マイクログラムの総プラスミドDNAを混合します。混合物を室温で15〜30分間インキュベートします。次に、トランスフェクション混合物を培地を含むフラスコ内のコンフルエントHEK293T細胞に慎重にピペットで移動させます。フラスコを穏やかに回転させて、混合物の適切な均質化を確保し、摂氏37度で48時間インキュベートします。2日間のインキュベーション後、培地を生産者HEK293T細胞フラスコから15ミリリットルの円錐形チューブに移します。チューブを800 x g で5分間遠心分離して、残りのHEK293T細胞をペレット化します。ペレットを乱すことなく、上清を含むすべてのウイルスを慎重に取り除き、新しい15ミリリットルの円錐形チューブに移します。U937細胞懸濁液の必要体積を数えて計算し、2 x 10のペレットを6細胞の累乗で得ます。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブ内で400 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞ペレットをチューブ内に残します。細胞ペレットを上清を含むウイルスに再懸濁し、チューブを290 x g で60分間遠心分離します。遠心分離後、ピペットを使用して、チューブ内の上清を含むウイルスを含むペレットを再懸濁します。チューブを端から端までの回転子に60分間置きます。次に、チューブを400 x g で10分間遠心分離し、上清を含むウイルスと完全なRPMI 1640培地の1:1の比率でペレットを再懸濁し、10%熱不活化FBSを添加します。細胞混合物を新しいT25組織培養フラスコに移し、摂氏37度で48時間インキュベートします。インキュベーション後、U937細胞を400 x g で10分間遠心分離し、上清を除去します。ペレットを完全なRPMI 1640培地で再懸濁し、10%熱不活化FBSと5マイクログラムのピューロマイシンを添加します。細胞培養物をT25フラスコに移します。細胞を摂氏37度で2〜3週間インキュベートし、1〜2日ごとに細胞に成長の兆候がないかチェックします。ウェスタンブロット分析により、野生型および非標的対照細胞の強いシグナルと比較して検出可能なシグナルのないRIP1 CRISPR変異細胞におけるRIP1タンパク質発現の喪失が確認されました。TCZによる処理は、野生型および非標的対照細胞で有意な壊死性細胞死を誘発しましたが、これはネクロスタチン-1s処理によって逆転しました。対照的に、RIP1 CRISPRノックアウト細胞は、ネクロスタチン-1の影響を伴わず、野生型および非標的対照細胞と比較して有意に低い細胞死を示し、RIP1機能の喪失を示しています。生細胞蛍光顕微鏡検査では、TCZ処理後の野生型および非標的対照細胞におけるミトコンドリアスーパーオキシド産生の有意な増加が示されましたが、これはネクロスタチン-1s処理で減少しました。RIP1 CRISPRノックアウト細胞は、ネクロスタチン-1s処理の観察可能な効果を伴わず、最小限のミトコンドリアスーパーオキシド産生を示しました。

generation-rip1-knockout-u937-cell-line-using-crispr-cas9

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

CRISPR/Cas9は、遺伝子と遺伝的要素の破壊を生み出す堅牢なシステムです。ここでは、CRISPR/Cas9を使用して哺乳類細胞株のゲノム欠失を効率的に作成するためのプロトコルについて説明します。...

CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic...

hiPSC神経系統を効率的に生成するCRISPRを使用して特定のノック記者/ Cas9とCas9ダブルニッカーゼシステム

体細胞株を遺伝子操作する能力の最近の進歩は、基礎研究および応用研究の大きな可能性を秘めている。ここでは、選択マーカーを使用した場合と使用しない場合の、哺乳類細胞株におけるCRISP / Cas9生成ノックアウト産生およびスクリーニングのための2つのアプローチを提示する。...

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9...

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)...

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。...

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

このプロトコルでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせて褐色脂肪組織(BAT)特異的ノックアウトマウスを生成するための技術的手順について説明します。記載されたステップには、sgRNAの設計、AAV-sgRNA粒子の調製、およびBATローブへのAAVのマイクロインジェクションが含まれる。...

Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルスシングルガイドRNAシステムを組み合わせた褐色脂肪特異的ノックアウトマウスの作製

本稿では、CRISPR/Cas9システムと3つの表現型ベースのスクリーニング戦略を用いたセントロメア関連プロテインE(CENP-E)ノックアウト細胞の構築について報告します。私たちは、...

CRISPR/Cas9システムを用いたセントロメア関連プロテイン-E CENP-E-/-ノックアウト細胞株の作製

THP-1細胞株は、さまざまな生物学関連研究領域において、ヒト単球/マクロファージの機能を調べるためのモデルとして広く使用されています。この記事では、効率的なCRISPR-Cas9ベースのエンジニアリングとシングルセルクローン単離のためのプロトコルについて説明し、堅牢で再現性のある表現型データの生成を可能にします。...

エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

zpc:cas9ノックインゼブラフィッシュを用いた母性変異体の生成

学ぶCRISPR-Cas9を用いたRIPK1ノックアウトU937細胞株の作製法。遺伝子編集の効率性や実験課題への対処法を含み、細胞シグナル伝達と遺伝学研究への応用可能性を示します。

CRISPR-Cas9システムを用いた RIP1 ノックアウトU937細胞株の作製

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