CRISPR-Cas9システムを用いた RIP1 ノックアウトU937細胞株の作製

私たちの研究は哺乳類プログラムの細胞死に焦点を当てており、特に高血糖の文脈におけるアポトーシスとネクロプトーシスのバランスを研究しています。ごく最近では、細胞死タンパク質 RIP1 キナーゼがネクロプトーシス中の遺伝子発現を調節することが示されています。現在の実験課題は、懸濁液で増殖する免疫細胞を遺伝子操作すること、特にCRISPR-Cas9を使用してRIP1キナーゼの遺伝子をノックアウトすることです。

私たちのプロトコルには 2 つの明確な利点があります。レンチウイルスを使用して懸濁液で増殖する免疫細胞のトランスフェクション方法を改善し、CRISPR-Cas9を使用して遺伝子ノックアウトを作成するプロセス中に単一細胞クローニングの必要性を排除し、私たちの結果は、ネクロプトーシスにおける高血糖シフトにおけるRIP1キナーゼの役割を研究する道を開きました。レンチウイルスベクターを保有する大腸菌を誘導する象限ストリークを開始するには、1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを添加したLuria-BertaniまたはLB寒天プレートにRNAを誘導します。

プレート上の最も希薄な領域に個々のコロニーが見えるまで、プレートを摂氏37度で1〜2日間インキュベートします。インキュベーション後、滅菌ループを使用して、単一のコロニーを選択し、50ミリリットルの円錐形チューブに1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを添加した5ミリリットルのLBブロスに加えます。チューブのキャップを通気してテープで留めます。

チューブを摂氏37度、225 RPMのオービタルシェーカーで8時間インキュベートします。その間、40ミリリットルのLBブロスを加え、アンピシリン1ミリリットルあたり100マイクログラムを4本の50ミリリットルチューブに加えます。インキュベーション後、40マイクロリットルの増殖培養物を4つのチューブのそれぞれに移します。

チューブのキャップを通気してテープで留めてから、摂氏37度、RPMのオービタルシェーカーで12〜16時間インキュベートします。翌日、スイングバケットローターで3, 220 x g で培養物を20分間遠心分離します。上清を廃ビーカーにデカントし、4つのペレットすべてをアンピシリンを添加した10ミリリットルのLBブロスに混ぜ合わせます。

結合したペレットをスイングバケットローター内で最高速度で20分間遠心分離して単一のペレットを取得し、できるだけ多くの上清を廃ビーカーに捨てます。HEK293T細胞を6倍10の3〜5倍の濃度でDMEMを含むT25フラスコに播種します。フラスコを摂氏37度で5%の二酸化炭素とともに一晩インキュベートします。

一方、プラスミドの比率を1:1:1:1、トランスフェクション試薬とプラスミドDNAを3:1の比率で、還元血清培地でトランスフェクション混合物を調製します。75マイクロリットルのトランスフェクション試薬、2, 500マイクロリットルの還元血清培地、および25マイクログラムの総プラスミドDNAを混合します。混合物を室温で15〜30分間インキュベートします。

次に、トランスフェクション混合物を培地を含むフラスコ内のコンフルエントHEK293T細胞に慎重にピペットで移動させます。フラスコを穏やかに回転させて、混合物の適切な均質化を確保し、摂氏37度で48時間インキュベートします。2日間のインキュベーション後、培地を生産者HEK293T細胞フラスコから15ミリリットルの円錐形チューブに移します。

チューブを800 x g で5分間遠心分離して、残りのHEK293T細胞をペレット化します。ペレットを乱すことなく、上清を含むすべてのウイルスを慎重に取り除き、新しい15ミリリットルの円錐形チューブに移します。U937細胞懸濁液の必要体積を数えて計算し、2 x 10のペレットを6細胞の累乗で得ます。

次に、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブ内で400 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞ペレットをチューブ内に残します。細胞ペレットを上清を含むウイルスに再懸濁し、チューブを290 x g で60分間遠心分離します。遠心分離後、ピペットを使用して、チューブ内の上清を含むウイルスを含むペレットを再懸濁します。

チューブを端から端までの回転子に60分間置きます。次に、チューブを400 x g で10分間遠心分離し、上清を含むウイルスと完全なRPMI 1640培地の1:1の比率でペレットを再懸濁し、10%熱不活化FBSを添加します。細胞混合物を新しいT25組織培養フラスコに移し、摂氏37度で48時間インキュベートします。

インキュベーション後、U937細胞を400 x g で10分間遠心分離し、上清を除去します。ペレットを完全なRPMI 1640培地で再懸濁し、10%熱不活化FBSと5マイクログラムのピューロマイシンを添加します。細胞培養物をT25フラスコに移します。

細胞を摂氏37度で2〜3週間インキュベートし、1〜2日ごとに細胞に成長の兆候がないかチェックします。ウェスタンブロット分析により、野生型および非標的対照細胞の強いシグナルと比較して検出可能なシグナルのないRIP1 CRISPR変異細胞におけるRIP1タンパク質発現の喪失が確認されました。TCZによる処理は、野生型および非標的対照細胞で有意な壊死性細胞死を誘発しましたが、これはネクロスタチン-1s処理によって逆転しました。

対照的に、RIP1 CRISPRノックアウト細胞は、ネクロスタチン-1の影響を伴わず、野生型および非標的対照細胞と比較して有意に低い細胞死を示し、RIP1機能の喪失を示しています。生細胞蛍光顕微鏡検査では、TCZ処理後の野生型および非標的対照細胞におけるミトコンドリアスーパーオキシド産生の有意な増加が示されましたが、これはネクロスタチン-1s処理で減少しました。RIP1 CRISPRノックアウト細胞は、ネクロスタチン-1s処理の観察可能な効果を伴わず、最小限のミトコンドリアスーパーオキシド産生を示しました。