Name: In vitroモデリングのための初代ブタ網膜色素上皮細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学ぶブタ網膜色素上皮細胞の単離培養法。初代細胞を用いたin vitroモデリングにより、加齢黄斑変性などの網膜疾患の病態理解と治療標的の同定に貢献します。

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著者らは、ブタRPE細胞の培養と単離に協力してくれたFarhad Farjood氏と、SEMを支援してくれたThomas Harris氏に感謝します。著者らは、ユタ州立大学の顕微鏡コア施設からのSEM分析のサポートに感謝しています。この施設では、米国国立科学財団のMajor Research Instrumentation Grant(CMMI-1337932)から取得した走査型電子顕微鏡が維持されています。この研究の資金は、米国国立衛生研究所(NIH)から助成金1R15EY028732(Vargis)およびBrightFocus Foundation助成金M2019109(Vargis)を通じて提供されました。追加の資金は、ユタ州立大学研究局からの学部研究および創造的機会助成金(ウェザーストン)と、ユタ州立大学のアルツハイマー病および認知症研究センターからのシード助成金(Vargis)によって提供されました。

この手順で使用される目は、USDAが検査した地元の精肉店から死後採取され、生きた動物を使用した作業は行われません。動物が犠牲にされた後、眼球が摘出されるまでに約2時間が経過します。組織の腐敗が起こり始める可能性があるため、さらなる腐敗を防ぐために、輸送中は目を涼しく保つことが重要です。この手順では、眼球摘出後すぐに冷蔵庫に入れます。その後、目の袋を1000mLのポリプロピレンビーカーに入れ、8Lのクーラーボックス内で氷で囲みます。氷に直接目を置かないことが重要です。眼球が実験室に到着すると、RPE細胞の分離はバイオセーフティキャビネット内で行われます。このプロセスを3〜5時間以内に完了することが重要です。このプロトコルは、10 個の目を処理するように最適化されています。
1. DNaseストックアリコートの調製
注: この手順は、分離の前に実行することをお勧めします。
<ol><li>滅菌脱イオン水で 5 mM 塩化カルシウム溶液を調製します。 注意: 塩化カルシウム粉末は、重度の眼の炎症や損傷を引き起こす可能性があります。適切なPPEを着用してください。</li>
	<li>5 mM 塩化カルシウム溶液を DNase 粉末( 材料表を参照)に添加し、最終的な DNase 濃度を 3 mg/mL にします。溶液が完全に混合されていることを確認してください。 注意:DNaseは呼吸器感作の危険性があります。粉末/物質を吸い込まないでください。</li>
	<li>少量(例えば1 mL)を微量遠心チューブに分注します。</li>
	<li>アリコートは、使用するまで-20°Cで凍結してください。</li>
</ol>2. 解剖エリアの設置
<ol><li>無菌解剖器具と細胞培養装置をバイオセーフティキャビネットに移します:外科用ドレープ、ペトリ皿、細胞ストレーナー、ウェルプレート、ガーゼ、ピンセット、メスのハンドル、メスの刃、虹彩はさみ( 材料表を参照)。</li>
	<li>ピンセットを使用して、外科用ドレープをレイアウトします。外科用ドレープの上に6ウェルプレートを1枚置き、蓋を外します。</li>
	<li>滅菌済みのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)のアリコートを氷上およびバイオセーフティキャビネットに入れます。</li>
	<li>6ウェルプレートの1ウェルを半分(約6 mL)に10%ポビドンヨード溶液で満たします。</li>
	<li>残りのウェルを冷やしたDPBSで満たします。</li>
	<li>ペトリ皿の1つから蓋を外し、逆さにして外科用ドレープの上に置きます。ペトリ皿のベースを廃棄物容器として取っておきます。</li>
	<li>細胞培養培地(ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%抗生物質/抗真菌薬)のアリコートと0.25%トリプシン/EDTAのアリコートを37°Cのウォーターバスに入れます。</li>
	<li>DNaseストック溶液を冷凍庫から取り出します(詳細については、プロトコルの残りの部分を参照)。</li>
</ol>3.外部組織の除去
注:外部組織の除去は、バイオセーフティキャビネットの外で行うことができます。切断する前に目を検査して、強膜に穴が開いていないこと、瞳孔が曇っていないこと、視神経が存在することを確認してください。これらの基準を満たさない目は破棄します。
<ol><li>片手で眼球に付着した筋肉を持ちながら、もう片方の手で強膜の周りの組織をメスで優しく切り取ります。目をつぶったり、誤って強膜を切ったりしないように注意してください。強膜が切り裂かれて黒い内部が露出している場合は、目を捨てます。 注意: 偶発的な切り傷から保護するために、筋肉を保持する手には耐切創性手袋を強くお勧めします。</li>
	<li>湾曲した虹彩はさみで視神経を3mm以下の長さにトリミングします。視神経が長すぎると、アイカップが後でセルストレーナーに適切に収まりません。</li>
	<li>角膜を下にして氷の上に目を置きます。</li>
	<li>外装組織が各目から取り除かれるまで、手順3.1〜3.3を繰り返します。</li>
</ol>4.眼の解剖
<ol><li>ピンセットを使用して、バイオセーフティキャビネットと10%ポビドンヨード溶液を含むウェルに眼球を移し、眼球を回転させてヨウ素溶液で完全にコーティングされていることを確認します。ツールをできるだけ無菌に保つために、これらのピンセットは目の外側に触れる場合にのみ使用する必要があります。</li>
	<li>目がヨウ素溶液に浸かっている間に、先ほど準備したペトリ皿の浅い逆蓋に滅菌ガーゼを置きます。別のペトリ皿に、セルストレーナーを置きます。セルストレーナーは、細胞分離ではなく、アイカップを支えるためにのみ使用してください。</li>
	<li>眼をヨウ素溶液に約30秒間浸した後、DPBSを含むウェルにそれぞれ約5秒間浸して眼を洗浄し、ウェルからウェルへと移動してヨウ素溶液を徐々に希釈し、滅菌ガーゼの上に眼を移します。</li>
	<li>オラセラタの下、または虹彩の端から約1/3下にメスを使用して小さな切開を行います。</li>
	<li>切開に続いて、虹彩ハサミを使用して、角膜と平行に地球の円周に沿って均等に切断します。目を操作するときは、ピンセットのみを使用して目の外側に触れるか、ガーゼを使用して無菌状態を維持します。</li>
	<li>ピンセットを使って視神経をつかみ、地球儀をガーゼからそっと持ち上げます。硝子体は地球から落ちるはずです。必要に応じて、硝子体を取り除くために目を静かに振ってください。 注意: 硝子体を取り除くのが非常に難しい場合は、地球の下部をカットしてみてください。</li>
	<li>アイカップの内部を上に向けて、準備したセルストレーナーにアイカップをそっと置きます。不均一な場合は、ピンセットを使用してアイカップを調整し、切開をできるだけ水平にします。</li>
	<li>冷却したDPBSをアイカップにそっと加え、液面が切開部の最低点のすぐ下になるようにします。このDPBSは、神経網膜除去後に除去されます。 注:追加されるDPBSの量は、目の大きさと切開位置によって異なります。</li>
	<li>すべての目が解剖されるまで、手順4.1〜4.8を繰り返します。</li>
</ol>5. 神経網膜除去とRPE解離
注: 次のセクションは、段階的に実行する方が簡単です。このセットアップでは、このプロセスは一度に 1 つのバッチ (通常は 3 つのアイ カップ) で実行されます。ステップ 5.1 から 5.7 では、次のステップに進む前に、各ステップをバッチ全体で実行する必要があります。
<ol><li>懐中電灯の下で、神経網膜(白/ピンク)がRPE(黒)から剥離し始めている領域を見つけます。次に、鈍いピンセットを使用して、持ち上げられた神経網膜をそっとつかみ、剥がします。 注意: 神経網膜が剥離している領域がない場合は、ピンセットを使用してアイカップの上部付近をそっとつかみます。この方法を使用すると、RPE /脈絡膜に損傷が加えられた場合、それらの細胞はRPE収集中に解離されません。</li>
	<li>視神経乳頭の近くの神経網膜を静かに集めます。</li>
	<li>真空吸引システムに取り付けられたパスツールピペットを使用して神経網膜を吸引します。除去プロセスを支援するために、吸引をフェザーすることをお勧めします。 注:パスツールピペットの先端にピペットチップをセットして、吸引力を減らすことができます。</li>
	<li>冷却したDPBSを慎重に追加して、吸引したものと交換します。</li>
	<li>もう一度吸引して残った神経網膜を取り除きます。今回は、公開されているRPEを乱さずに、できるだけ多くのDPBSを削除します。</li>
	<li>トリプシンをアイカップにそっと加えます。コンタミネーションを減らすために、体積レベルを切開線と損傷したRPEのセクションの下に保ちます。 注意: トリプシンは、接触すると皮膚や目の炎症を引き起こす酵素です。適切なPPEを着用してください。</li>
	<li>トリプシンを各眼に加えた後、ペトリ皿の蓋が交換されていることを確認します。次に、ペトリ皿を37°C、5%CO2 の加湿インキュベーターに30分間移します。</li>
	<li>すべてのアイカップが処理されるまで、バッチごとに手順5.1〜5.7を繰り返します。</li>
</ol>6. RPEコレクション
<ol><li>各バッチの目(2〜3目)からRPE細胞を回収し、1本の15 mL遠心チューブに入れて、播種プロセスを簡単にします。<ol><li>懐中電灯の下で、1000 μLのピペットを使用して静かにトリチュレーションし、RPE細胞を取り除きます。RPE細胞が剥離しない場合は、新鮮なトリプシンを加え、さらに10〜15分間インキュベートします。網膜をこすらないように注意してください。</li>
		<li>RPE細胞を15 mLの遠心チューブに集めます。</li>
		<li>アイカップを細胞培養培地で洗浄して、残っている細胞を回収し、トリプシンを中和します。15 mL遠心チューブ内にトリプシンの培地が少なくとも2倍の量あることを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>すべてのアイカップからRPE細胞が収集されるまで、手順6.1を繰り返します。</li>
	<li>細胞懸濁液を室温で250 x g で5分間遠心分離します。</li>
</ol>7. DNaseワーキングソリューションの準備
<ol><li>細胞培養培地に添加するのに必要な3 mg/mLのDNaseストック溶液(ステップ1で調製)の容量を計算し、最終濃度が100 μg/mL、最終容量が3 mL/細胞チューブあたり3 mLになります(つまり、細胞の遠心分離チューブ3本の場合、100 μg/mLのDNase溶液が9 mL必要です)。</li>
	<li>適切な量のDNaseストック溶液と細胞培養培地を組み合わせます。作業溶液にDNaseを使用すると、細胞の凝集を防ぎ、細胞を均一に播種することができます。</li>
</ol>8. RPE細胞播種
<ol><li>ステップ6.3の遠心分離に続いて、細胞ペレットを破壊しないように注意しながら、各15 mL遠心チューブから上清を取り除きます。</li>
	<li>各細胞ペレットを3 mLのDNaseワーキング溶液に再懸濁します。</li>
	<li>再懸濁した細胞を入れた15 mL遠心チューブを加湿インキュベーターに37°C、5%CO2 で15分間入れます。</li>
	<li>インキュベーション後、細胞懸濁液を室温で150 x g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>細胞ペレットを破壊しないように注意しながら、上清を取り除きます。</li>
	<li>各細胞ペレットを3 mLの新鮮細胞培養培地に再懸濁します。</li>
	<li>2〜3眼分のRPE細胞を含む遠心分離管ごとに、6ウェルプレート(継代0)の1ウェルを播種します。</li>
	<li>播種した6ウェルプレートを、37°C、5%CO2の加湿インキュベーターに慎重に移します。</li>
</ol>9. 初代ブタRPE細胞培養
<ol><li>プレートを移動する前に、新しく播種したRPEセルを48〜72時間付着させます。最初の培地交換では、新鮮な細胞培養培地で洗浄を行うことで、余分な細胞破片を除去することができます。</li>
	<li>細胞培養培地は48時間ごとに交換してください。</li>
	<li>細胞がコンフルエントに達したら、FBS濃度2%の細胞培養培地に移行し、実験まで維持します。</li>
</ol>10. RPEセルの検証
<ol><li>免疫細胞化学(ICC)染色<ol><li>細胞をDPBS中の4%ホルムアルデヒドで室温で10分間固定します。</li>
		<li>DPBSで2回洗ってください。</li>
		<li>0.2% Triton-X 100 in DPBS を使用して、室温で 10 分間細胞を透過処理します(必要な場合)。</li>
		<li>DPBSで2回洗ってください。</li>
		<li>3%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)のブロッキング溶液をDPBSに溶かし、室温で1時間アプライします。</li>
		<li>一次抗体を希釈倍率1:100(またはメーカー推奨濃度)で添加し( 材料表を参照)、室温で1時間、または4°Cで一晩放置します。</li>
		<li>DPBSで各5分間3回洗浄します。</li>
		<li>必要に応じて二次抗体を2 μg/mL(またはメーカー推奨濃度)で添加し( 材料表を参照)、室温で1時間放置します。</li>
		<li>二次抗体を添加する場合は、DPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。</li>
		<li>メーカーの濃度( 材料表を参照)で核染色プローブを添加し、室温で25分間放置します。</li>
		<li>PBSで5分間ずつ3回洗浄します。</li>
		<li>細胞培養インサートに装着する場合は、Rickabaugh and Weatherston et al.20 で概説されているように、封入培地を使用してカバーガラスを使用して顕微鏡スライドにマウントします。それ以外の場合は、DPBSの画像セル。</li>
	</ol></li>
	<li>走査型電子顕微鏡(SEM)<ol><li>Harris et al.21 によって概説された手順に従ってください。</li>
	</ol></li>
	<li>経上皮電気抵抗(TEER)<ol><li>TEER測定に関するメーカーのプロトコル( 材料表を参照)に従い、基底チャンバー15に1mLの培地を添加します。</li>
	</ol></li>
	<li>酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)<ol><li>メーカーのプロトコルに従って、マルチプレックスヒト酵素結合免疫吸着アッセイキットを使用してELISA15 を実施します( 材料表を参照)。</li>
	</ol></li>
</ol>

ブタの眼から初代RPE細胞を単離するための費用対効果の高い方法

<ol><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+nature+of+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The dynamic nature of Bruch's membrane.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).</li>
<li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li>
<li>Georgiadis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tight+junction+associated+signalling+proteins+ZO-1+and+ZONAB+regulate+retinal+pigment+epithelium+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice.</a> PLOS One. 5 (12), e15730(2010).</li>
<li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li>
<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Yang, S., Zhou, J., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+diseases+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Functions and diseases of the retinal pigment epithelium.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 727870(2021).</li>
<li>Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE65+is+the+isomerohydrolase+in+the+retinoid+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).</li>
<li>Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+roles+of+RPE65+S-palmitoylation+in+membrane+association+and+visual+cycle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5218(2019).</li>
<li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration%3A+A+review+of+major+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li>
<li>Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+barrier+breakdown+in+diabetic+retinopathy%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Biology%2C+Diseases%2C+and+Informatics%22%5BJournal%5D)">RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing.</a> Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).</li>
<li>Hellinen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+artificially+re-pigmented+ARPE-19+retinal+pigment+epithelial+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13761(2019).</li>
<li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line%2C+ARPE-19%2C+induced+by+nicotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li>
<li>Samuel, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriately+differentiated+ARPE-19+cells+regain+phenotype+and+gene+expression+profiles+similar+to+those+of+native+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells.</a> Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).</li>
<li>Middleton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+ophthalmology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Porcine ophthalmology.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).</li>
<li>Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+mechanical+stress+in+primary+porcine+RPE+cells+induces+angiogenic+factor+expression+and+in+vitro+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis.</a> Journal of Biological Engineering. 14, 13(2020).</li>
<li>Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).</li>
<li>Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+monolayer+to+complement+retinal+ex+vivo+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures.</a> STAR Protocols. 4 (3), 102443(2023).</li>
<li>Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+cryosectioning+of+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+on+transwell+cell+culture+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101758(2022).</li>
<li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).</li>
<li>Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+biomimetic+in+vitro+model+of+bruch%27s+membrane+using+hagfish+slime+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+recombinant+spider+silk+proteins+to+develop+a+synthetic+bruch%27s+membrane+for+modeling+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).</li>
<li>Zou, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+tight+junction+between+RPE+cells+with+tissue+factor+targeting+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide.</a> International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).</li>
</ol>

このプロトコルはブタの目からRPEのセルを隔離する方法を記述する。色素沈着と丸石の形態は、分離後7日以内に見られます(図1B)。さらに、TEERデータは、タイトジャンクション形成22 と健全な単層を示しています(図5)。これらの結果は、この方法で単離されたRPE細胞がヒトRPEに類似しており、網膜細胞培養モデルにおいて有益であり得ることを示しています。
この原稿で使われている目は、地元の精肉店から死後に入手したものだが、ブタ製品を使用する共同研究者がいる学術的な環境など、他の情報源から入手したこともある。動物の死後、できるだけ早く処置を開始し、処置の前に目を涼しく保つことが重要です。単離中は、トリプシン処理後のトリチュレーションまでRPEを破壊しないことが不可欠です。神経網膜を剥がす際には、注意を怠るとピンセットでブルッフ膜1 をつかみ、他の種類の細胞を溶液に取り込んでしまう可能性があるため、この注意が最も重要です。
この手順は私たちの条件に合わせて最適化されていますが、方法論にいくつかの変更を加えることができます。例えば、特定の播種密度が望ましい場合、DNaseインキュベーション後に細胞をカウントすることができる。さらに、真空吸引が機能しない場合は、小さく湾曲したハサミで慎重にトリミングすることで、神経網膜を除去できます。実験用の播種時には、2.5×105 細胞/cm2 などの高い播種密度を用いて、過剰な細胞分裂を防ぐことができる。さらに、継代を繰り返すことは、細胞が本来の表現型を失い始める可能性があるため、推奨されません。この研究では、継代1細胞を実験に使用しましたが、RPEの表現型と特性が維持されれば、追加の継代が使用される可能性があります。最後に、必要に応じて、2%の代わりに1%の濃度のFBSを継代培養または実験に使用できます。
この方法にはいくつかの欠点があります。第一に、初代細胞単離でよく問題となる動物の年齢、性別、品種、死亡時期の再現や取得が困難である。第二に、トリプシンの過剰化は、すぐに異常な細胞をもたらす可能性があり、これはFietzらによっても指摘されています17。しかし、究極的には、この方法は一次RPE細胞を得るための安価で効率的な方法を提供する。これらの細胞は、iPS細胞のように長い分化時間を必要としません。これらのブタRPEは、未分化のものとは異なり、微絨毛や色素沈着15,16などの重要な構造を先天的に持っています。そのため、これらの細胞は網膜研究のためのより代表的な細胞タイプを提供します。最後に、この方法は、人間のドナーの目にアクセスできない農村部や機関にとって、視力や病気を理解するための人間のモデルに類似した網膜モデルを作成するのに非常に有益である可能性があります。

網膜色素上皮(RPE)は、ブルッフ膜と視細胞1の間の網膜外に位置する単層である。RPE細胞は、閉塞帯帯-1(ZO-1)などのタンパク質とタイトジャンクションを形成し、色素沈着と六角形の形態を特徴とする独特の表現型を持っています2,3。これらの細胞は血液網膜関門に寄与し、それによって視細胞の健康をサポートし、網膜の恒常性を維持します4,5。さらに、RPE細胞は、光を吸収し、光受容体に不可欠な成分をリサイクルすることにより、視覚において重要な役割を果たします6。例えば、RPE細胞で高発現するタンパク質であるRPE65は、オールトランスレチニルエステルを11-シスレチノール7,8に変換します。RPE細胞が果たす機能の多さを考えると、その機能不全は、加齢黄斑変性症や糖尿病性網膜症などのさまざまな疾患に関与しています9,10。網膜の病状の理解を深め、新しい治療法を開発するために、網膜のin vitroモデルが頻繁に採用されています。
健康な網膜または病気の網膜の代表的なモデルを生成するには、模倣RPE細胞タイプを使用することが不可欠です。市販のARPE-19細胞株は、色素沈着などの天然表現型を欠いていますが、iPS細胞は11,12,13を分化するのに数ヶ月かかることがあります。ヒトのドナーの目は理想的かもしれませんが、多くの研究室ではすぐには入手できないことがよくあります。
ここでは、ヒトの目と多くの類似点を持つブタの目14を利用して、初代RPE細胞を得る方法を考案した。これらの初代ブタRPE細胞は、複数の網膜モデルで利用されている15,16。これらの細胞は費用対効果が高いだけでなく、iPS細胞やドナーの眼球よりも取得に要する時間が短くて済みます。さらに、色素沈着や微絨毛などの天然の特徴を示します。ブタRPE抽出のための同様のプロトコルが存在しますが17,18,19、この単純で詳細な技術は、酵素解離をさらに検証し、ほとんどの細胞培養ラボで一般的に見られる材料を採用しています。

<table><tbody><tr><td>6 マイクロウェルガラス底板、14 mm マイクロウェル #1 カバーガラス</td><td>Cellvis</td><td>P06-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質 - 抗真菌剤 (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム、乾燥、粉末、97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13191.30</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-363-548</td><td>片目につき1本</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ、15 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>05-539-12</td><td></td></tr>クーラー<tr><td>、8 L</td><td>イグル</td><td>ー32529</td><td></td></tr><tr><td>コーニング&nbsp;透過性ポリエステルメンブレンインサート付きトランズウェルマルチプルウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>07-200-154</td><td>カルチャーインサート</td></tr><tr><td>耐切創性手袋</td><td>ダウエルライフ</td><td>712971375857</td><td></td></tr><tr><td>Cytiva&nbsp;HyClone Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水、溶液</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>ICC希釈のみのSH3026401&nbsp;</td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM、1x 4.5 g/L グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNase I from Bovine Pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modified - カルシウム - マグネシウム</td><td>Cytiva</td><td>SH3002B.02</td><td>4 °C;C</td></tr><tr><td>ELISAキット、Q-Plexヒト血管新生(9-Plex)&nbsp;</td><td>Quansys Biosciences, Logan, UT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENDOHM 6 TEER device</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Avantor</td><td>232B20</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp;ウシ血清アルブミン(BSA)DNaseおよびプロテアーゼフリーパウダー</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>BP9706100</tr><tr><td>懐中電灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド、ACSグレード、36.5%(w / w)〜38.0%(w / w)、LabChem</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>LC146501</tr><tr><td>ガーゼスポンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>22-415-504</td><td>片目につき1個</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor Plus 647、Invitrogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32728</td><td>RPE65二次抗体</td></tr><tr><td>Ice&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Crushed prefered</td></tr><tr><td>Inverted Phase Contrast Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp;NucBlue Live ReadyProbes試薬(Hoechst 33342)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>アイリスファインチップはさみ、標準グレード、湾曲、4.5 "</td><td>コールパー</td><td>マーEW-10818-05</td><td></td></tr><tr><td>アイリスはさみ、11 cm、ストレート、炭化</td>タングステンフィ<td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>50-822-379</td><td></td></tr><tr><td>LSM-710 共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 100 mm x 20 mm&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td>2〜3アイごとに1つ、解剖面/廃棄物用に1つ&nbsp;</td></tr><tr><td>Povidone-Iondine Solution, 10%</td><td>Equate</td><td>49035-050-34</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA116578</td><td>RPE65 一次抗体</td></tr><tr><td>メスの刃 サイズ 10</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>メスハンドルスタイル3</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>50-118-4164</td><td></td></tr><tr><td>外科用ドレープ、18 x 26インチ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>50-209-1792</td><td></td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター37</td><td></td><td></td><td>&deg;C、5% CO2、95% 湿度</td></tr><tr><td>組織培養プレート、6 ウェル</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>1 つは洗眼用、もう 1 つは播種用&nbsp;</td></tr><tr><td>三角ポリプロピレンビーカー、1000 mL</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>14-955-111F</td><td></td></tr><tr><td>トリトン&nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate</td><td>Corning</td><td>25053Cl</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Style 20A</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>17-467-231</td><td></td></tr>ピン<tr><td>セットスタイル2A</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>50-238-47</td><td>神経網膜除去用</td></tr> ピン<tr><td>セット スタイル 5-SA-PI</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>17-467-168</td><td></td></tr><tr><td>真空吸引システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス、37°;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 モノクローナル抗体 (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>33-911-1</td><td>ZO-1標識一次抗体</td></tr></tbody></table>

in vitroモデリングのための初代ブタ網膜色素上皮細胞の単離

Isolation of Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells for In Vitro Modeling

網膜色素上皮(RPE)は、光受容体を支える網膜外部の重要な単層です。RPE変性症は、加齢黄斑変性症(AMD)などの進行性の視力低下を特徴とする疾患で一般的に発生します。AMDの研究は、RPEを表すために、ヒトのドナーの目や人工多能性幹細胞(iPS細胞)に頼ることがよくあります。しかし、これらのRPE源は、培養のための長い分化期間とかなりの専門知識を必要とします。さらに、一部の研究機関、特に農村部では、ドナーの目へのアクセスが容易ではありません。市販の不死化RPE細胞株(ARPE-19)は存在するが、in vivo RPEの本質的な特徴を欠いており、多くの眼科研究出版物では広く受け入れられていない。代表的な一次RPE細胞を、より容易に入手でき、費用対効果の高い供給源から入手することが急務となっています。このプロトコルは商業か学術の製造者から局部的に供給することができるブタの目から死後得られる第一次RPEのセルの隔離そしてsubcultureを解明する。このプロトコルには、組織培養ラボで一般的に見られる一般的な材料が必要です。その結果、iPS細胞、ヒトドナー眼球、ARPE-19細胞に代わる、分化型で費用対効果の高い一次代替細胞が誕生しました。

この手順を用いて、初代RPE細胞をブタの眼から単離することに成功しました。 図1A は、特徴的な色素沈着を伴う単離3日後のRPE細胞を示しています。増殖から1週間後、細胞は完全にコンフルエントになり、健康な単層を形成しました(図1B)。その後、細胞を細胞培養インサートに移し、そこで色素沈着と形態を維持し(図1C)、単離手順の有効性をさらに裏付けました。これらの特徴を示さず、代わりに変異形態と過剰な色素沈着を示した培養物(図1D)は、細胞汚染が疑われ、実験には使用されませんでした。この原稿で単離されたRPE細胞は、RPE細胞で高発現するタンパク質であるRPE65を発現しています(図2)。RPE65の発現が低く見える領域は、色素沈着が蛍光を遮断していることが原因であると考えられます(図2A)。単離されたRPE細胞によって発現された別の特徴的なタンパク質はVEGFでした。10日後、VEGFは、2141.2±53.5 pg/mLの頂端側と比較して、2612.528.0 pg/mLの濃度でRPE単層の基底側でより多く発現±ました(図3)。初代ブタRPE細胞は、微絨毛と丸石の形態も持っています(図4)。さらに、細胞培養インサートで増殖させた場合、TEERの測定値は、7日後の166.1±75.9 Ω∙cm2 から14日後には363.4±9.0 Ω∙cm2 に増加し(図5)、時間の経過とともに一貫した健康なタイトジャンクション形成を示しています22。ジャンクション形成をさらに調査するために、RPE細胞のZO-1発現を解析し、細胞境界に局在し、正常なジャンクション形成と単層の完全性を示唆しました(図6)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig01.jpg"> 図1:ウェルプレートに播種して継代培養した後の一次RPE。 単離後3日で健康なRPE細胞(A)、単離後7日で完全にコンフルエントな単層(B)、RPEが培養インサートに正常に継代された(C)、およびRPE培養で細胞汚染の可能性のある領域(矢印)が良好であった(D)。スケールバー = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig02.jpg"> 図2:ブタRPE細胞におけるRPE65発現を示す免疫細胞化学的画像。 播種後15日後の細胞の明視野(A)、RPE65(B)、核(C)、およびマージ(D)画像。明視野画像の粒子の粗い背景は、多孔質培養インサートメンブレンであることに注意してください。スケールバー = 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig03v2.jpg"> 図3:RPE単分子膜の頂端側および基底側におけるVEGF発現。VEGF濃度は、培養インサート上で細胞増殖の10日後に実施したELISAによって決定されました。エラーバーは、n = 2 の標準偏差を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig04.jpg"> 図4:ブタの初代RPE細胞の走査型電子顕微鏡(SEM)画像。 細胞を30日間増殖させてからイメージングしました。スケールバー = 5 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig05v2.jpg"> 図5:細胞培養インサートで培養したRPE細胞で実施したTEER測定値。 成長の7、10、および14日後の抵抗値。エラーバーは、n = 3 の標準偏差を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig05largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig06.jpg"> 図6:ブタRPE細胞におけるZO-1発現を示す免疫細胞化学的画像。 明視野(A)、ZO-1(B)、核(C)、およびマージ(D)の画像は、ガラス底ウェルプレートに播種してから6日後の細胞の画像です。スケールバー = 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは局部的に供給されたブタの目から第一次網膜の色素の上皮(RPE)のセルを得、培養するためのプロシージャを概説する。これらの細胞は、幹細胞の高品質な代替品として機能し、 in vitro 網膜研究に適しています。

In vitroモデリングのための初代ブタ網膜色素上皮細胞の単離

The retinal pigment epithelium (RPE) is a crucial monolayer in the outer retina responsible for supporting photoreceptors. RPE degeneration commonly ...

私たちは、網膜の病理学の側面を模倣する疾患モデルを設計しています。これらのモデルにより、単層にひずみが生じたり、角礫膜が加齢とともに厚くなったりするなどの物理的変化に対する反応に基づいて、疾患におけるRPE細胞の役割をよりよく理解することができます。最大の課題の1つは、代表的な細胞型を持つことです。一般的に使用されている不死化細胞株と比較して、この技術で単離された初代細胞は、私たちの目に起こることに対して私たちの病気モデルをより現実的にします。この技術は、長時間の分化時間を必要とせずに高品質の細胞を得る方法を提供します。さらに、研究室で一般的に利用できるリソースを使用しているため、費用対効果が向上しています。今後は、加齢時に目に起こる自然な変化が、AMDの初期段階にどのようにつながるのかを見ていきたいと思います。これらの変化をよりよく理解し、特定の治療ターゲットを特定できるようにしたいと考えています。

isolation-primary-porcine-retinal-pigment-epithelial-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、形態学、生理学、極性、および成人のネイティブ組織の蛋白質と遺伝子の発現パターンを示すことを人間の胎児の網膜色素上皮細胞（hfRPE）細胞の培養コンフルエントな単層のための再現可能な方法を提供する。この作品は、いくつかの眼疾患の動物モデルに拡張されています。...

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このビデオでは、ウサギモデルから眼の色素上皮細胞を取得する手順を示しています。これらの細胞は、網膜変性疾患の治療戦略の開発に役立ちます。...

IPEおよびRPE細胞の単離:ウサギの眼から眼の色素上皮細胞を得るための技術

このビデオでは、ブタの眼から虹彩と網膜色素上皮細胞を分離し、in vivoおよびex...

IPEおよびRPE細胞の単離:単離されたブタの眼から色素性上皮細胞を取得する技術

このビデオは、採取したウシの目から網膜色素上皮細胞(RPE)細胞と虹彩色素上皮細胞(IPE)を単離する手順を示しています。単離された細胞を培養して、眼疾患の治療におけるそれらの役割を研究することができます。...

ウシ眼からのRPEおよびIPE細胞の単離:ウシ初代色素上皮細胞の採取および培養手順

ここでは、種々の哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ)から一次虹彩および網膜色素上皮細胞を単離およびトランスフェクトするプロトコルが提示される。この方法は、ヒトに移管可能なエクスビボ分析およびインビボ研究のための様々なセットアップにおける眼遺伝子治療アプローチを研究するのに理想的である。...

非ウイルス遺伝子治療のための哺乳動物一次色素上皮細胞の単離、培養、遺伝子工学

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。...

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ここでは、初代ブタ網膜色素上皮細胞を 試験管内で 培養するためのわかりやすい方法が提示されている。...

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我々は、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)細胞の細胞を単離するための簡単で効率的な方法を説明する。この手順により、遺伝子発現解析を含む、単離されたRPEに関するフォローアップ分子生物学的研究が可能になります。...

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網膜色素上皮(RPE)は、脈絡膜と網膜との間の重要な障壁として機能し、光受容体などの網膜細胞タイプの健康と機能を促進します。ここでは、成体マウスRPEを単離および培養するための簡単で効果的なプロトコルについて説明します。...

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学ぶブタ網膜色素上皮細胞の単離培養法。初代細胞を用いたin vitroモデリングにより、加齢黄斑変性などの網膜疾患の病態理解と治療標的の同定に貢献します。

In vitroモデリングのための初代ブタ網膜色素上皮細胞の単離

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