Name: コンビナトリアルプラグ製造のための二層マイクロ流体デバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶPDMS製二層マイクロ流体デバイスの製造法。圧力駆動型Quakeバルブを用いてプラグ生成を自動化し、蛍光プラグの定量的コンビナトリアルライブラリを作成する。がん研究とプレシジョンオncolジーに応用可能。

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HMDS蒸気蒸着にご協力いただいたNanoLab TuEのStacey Martina氏に感謝いたします。この研究は、TU/eの複雑分子システム研究所(ICMS)とオランダ科学研究機構(NWO)の重力プログラムIMAGINE!(プロジェクト番号24.005.009)。

コンビナトリアルプラグ製造のためのマイクロ流体デバイスの構築

F.E.はTheraMeのフリーランサーです!AGです。著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言している。

この論文では、プラグと呼ばれる油中水コンパートメントにコンビナトリアルライブラリを自動生成するためのPDMSベースのマイクロ流体デバイスの製造と操作のための一連のプロトコルが提示されました。マイクロ流体工学と液滴技術の組み合わせは、少量の試薬を多数のコンパートメントにカプセル化する強力な技術を提供し、大規模なコンビナトリアルスクリーニングへの道を開きます。
以前に、マイクロ流体工学を使用して化学的に異なるコンパートメントを生成するためのいくつかの技術が説明されており、それぞれに利点と制限があります。Kulesaら50は、マイクロタイタープレートを使用して細胞をバーコードで液滴にカプセル化し、電場を使用してこれらの液滴を融合して組み合わせライブラリを作成する戦略について説明しました。このようなアプローチでは、多くの液滴の組み合わせを生成できますが、ワークフローで手動処理手順が必要になるため、制限があります。Tomasiら51 は、スフェロイド(自由浮遊細胞凝集体)を含む液滴を刺激液滴と融合させるマイクロ流体プラットフォームを開発し、それによってスフェロイド微小環境の操作を可能にしました。この方法は、細胞間相互作用や薬物の効果などの重要な現象の研究を可能にしますが、比較的スループットが低くなります。Eduatiら46 およびUtharalaら47 は、ハイスループットのコンビナトリアルライブラリを自動的に生成できるマイクロ流体バルブベースのプラットフォームを開発しました。しかし、これらの研究では、バルブは点字デバイスを使用して操作されるため、マイクロバルブとマイクロ流体チップの間の煩雑なアライメントステップが必要になります。このホワイトペーパーで説明するシステムの主な特徴は、入力チャネル内の流体の流れを調整するための空気圧PDMSバルブの実装です。これらのバルブはPDMSベースであるため、マイクロ流体チップの製造工程にかなりスムーズに組み込むことができます。さらに、外部ガス源を介して圧力を加えることで作動させることができるため、入口チャネル内の液体の流れを制御するための比較的簡単なオプションです。最後に、これらのバルブの加圧と減圧の持続時間と順序をプログラムできるため、高スループットの方法で異なるプラグ集団の製造を自動化できます。もう一つの重要な特徴は、入口からの試薬の注入に一定の圧力レジームを使用していることであり、これにより、一定の流量レジームで発生する圧力の蓄積を軽減するために、廃棄物チャネルの組み込みをオプトアウトすることができます。これにより、デバイスの設計が簡素化され、廃棄物チャネルのバルブを制御するための追加のバルブやハードウェアの必要性が減り、試薬の無駄が最小限に抑えられます。
PDMSを使用したデバイスの製造は比較的複雑ではありませんが、このようなデバイスの実装には、空気圧ソレノイドバルブ(PDMSバルブの作動を制御するため)、圧力ポンプ(入口およびオイル試薬の流れを制御するため)、ソフトウェアプログラム(ソレノイドバルブを調整するため)などの広範なハードウェア機器を使用する必要があります。これらは多額の投資を表しますが、このようなセットアップは、デバイスの正常な動作のための一貫性と信頼性を提供します。さらに、このプロトコルで概説されているハードウェアコンポーネントとアーキテクチャは、モジュラー方式でセットアップされます。したがって、一部のモジュールでは、コストを削減したり、特定のニーズに適合させたりするために、代替手段を使用できます。例えば、実用性、予算、可用性、および利便性に基づいて使用できるさまざまなポンプが存在する52,53,54。流体リザーバや温度調節器などの追加成分は、敏感な入口試薬23のために組み込むことができる。さらに、この設計は、特定の科学的ニーズに対応するためにスケールアップまたはスケールダウンできます。例えば、この論文では、8つのユニークな試薬を組み合わせてプラグを製造することができる8つのインレットプロトタイプについて説明します。これは、より多くのインレットとそれらのより大きな組み合わせを可能にする16インレットデバイスにアップスケールすることができます。その結果、インレットに対処するために追加の制御チャネルとソレノイドバルブが必要になりますが、そのようなプロトタイプを使用すると、より大きく、より多様な組み合わせライブラリを生成できます。最後に、この論文では、各プラグ集団は、マイクロ流体デバイスの8つの水性入口のうち3つを開くことによって生成されます。このような構成では、オイル試薬の圧力が約200 mbar、水性試薬の圧力が約400 mbarで、バルブの作動のみによって駆動されるプラグ製造の体制に対応することが観察されました。オイルに高い圧力をかけると、プラグの破壊が観察され、より低い圧力を加えるとプラグが融合しました。プラグ製造に最適な圧力領域は、プラグの形成に寄与する入口の数、流体の性質と粘度、チャネルの寸法など、さまざまな要因に依存し、必要に応じて最適化する必要があります。
定圧領域で動作することの欠点の1つは、粘度の異なる流体が一定圧力下で異なる流量を持つことです。したがって、入口を流れる水性試薬の粘度が同等であることを確認する必要があります。異なる粘度の流体を使用すると、入口チャネル内の流体の流れだけでなく、T接合部でのプラグ形成にも影響し、プラグ集団の構成が損なわれます。別の欠点は、T接合部の残留試薬によるプラグ集団の汚染です。デバイスが異なるプラグ集団の生産を切り替えると、各集団のシーケンスの最初/最後のプラグは、前または次の母集団によって汚染される傾向があります。これは、各母集団の余分な反復を生成し、分析中に汚染されたプラグを割り引くことで克服できます。最後に、製造および/または外部ソースの不整合(圧力変動)から生じる個々のデバイス間の変動の可能性もあります。この問題は、単一のマイクロ流体チップを複数回再利用し、組み合わせライブラリの完全な実行が単一のチップで実行されるようにすることで軽減でき、これらの不整合の影響を最小限に抑えることができます。
この論文で紹介したマイクロ流体デバイスとそれに付随する一連の操作プロトコルは、プラグの定量的な組み合わせライブラリの作成を実証するために使用されてきました。したがって、このプラットフォームは、ハイスループットな方法で、異なるプラグポピュレーションの組み合わせライブラリを迅速に生成できます。その結果、このような技術は、患者の生検サンプルに対する併用薬物スクリーニングを含むが、これらに限定されない様々なスクリーニング目的に使用することができ、これにより、生検から回収された少数の細胞を多数の液滴に分配し、抗癌薬の大規模な組み合わせで治療して、所与の患者サンプルに対する個々の治療を最適化することができ、したがって、個別化された癌治療を加速することができる46。48,55.

マイクロ流体工学は、マイクロチャネル内の少量の流体の操作を可能にします1。一般的なマイクロ流体デバイスの動作規模は数十から数百マイクロメートルであり、化学反応や生体反応を小型化できるため、比較的少量の試薬で反応を行うことができます。当初、マイクロ流体デバイスは、シリコン2やガラス3などの材料で製造されていました。それらはまだ使用されていますが 4、溶剤の適合性、製造コストの高さ、流体の流れの制御の統合の難しさなど、特定の問題を引き起こします 5,6。ソフトリソグラフィーと呼ばれるPDMSベースの製造方法は、デバイスのラピッドプロトタイピング7のための安価な代替手段を提供し、複雑な多層デバイス8を製造する手段を提供します。PDMS装置にバルブとポンプを追加することで、装置9,10内の流体の経路と速度を制御することができます。可逆的または不可逆的な方法でマイクロバルブを設計し作動させるいくつかの方法が開発されている - 例えば、熱作動するシリコンとアルミニウムから作られたバイメタルバルブ11、または電気化学反応から生成されたガスを使用して窒化ケイ素膜12を偏向させる。Guらは、点字ディスプレイの機械的ピンを使用してマイクロチャネルに圧力を加え、流れを調整することを実証しています13。人気を博しているマイクロバルブの1セットは、Stephen Quake14のグループによって開拓された空気圧PDMSベースのバルブです。通常、このようなバルブは、流路と制御路の2つの直交するマイクロチャネルで構成されています。制御チャネルを加圧すると、薄いPDMS膜が流路上で偏向し、流路を閉じて流体の流れを遮断します。減圧されると、膜が弛緩し、流路が開き、流体の流れを再開できます。PDMSバルブは、制御チャネルを複数回加圧および減圧できるため、堅牢で可逆的な方法で流量調整を可能にします15。さらに、このようなバルブは圧力を加えることによって作動させることができるので、デジタル制御と自動化16への道を開く。さらに、それらは同じ材料であるため、ソフトリソグラフィー技術8、17、18を使用してPDMSベースのデバイスの製造にシームレスに統合することができる。これらの機能により、PDMSバルブはマイクロ流体デバイスの流量調整に魅力的な選択肢となっています。Thorsenらは、このようなバルブの原理を使用して、流体マルチプレクサ(空気圧バルブの組み合わせアレイ)を設計し、20の制御チャネル19で約1000の入力流路に対処しました。この原理は、流体を選択的にインチップマイクロ流体ケモスタットに経路指定するように拡張され、各反応器20、21、22、23において固有の反応を同時に行うことができる。しかし、このようなマイクロリアクターは、限られた試薬の使用を最適化するのには有用ですが、複数の反応を並列化することはできず、ハイスループット研究には十分ではありません。
液滴マイクロ流体工学は、マイクロ流体デバイス24における非混和性の多相液体流の操作による液滴の生成を含むマイクロ流体工学のサブカテゴリである。液滴形成は、非混和性流体の導入による連続流体の分解を含み、界面エネルギーの不安定性およびエマルジョンの形成によるピンチオフをもたらす25。界面活性剤は、界面エネルギーを安定化させることにより、エマルジョンがマイクロチャネルを離れるときに丸みを帯びた液滴の形成を助ける26。プラグと呼ばれる大きな液滴は安定性が低く、1つ以上の非混和性液体27によって両側に間隔を空けた水性コンパートメントの配列として保持コンパートメント(チューブの長さなど)に収集することができる。小型化および区画化に加えて、液滴マイクロ流体工学は、多数の単分散液滴を生成することができるので、生物学的反応のスループットも向上させる - それぞれがナノリアクターとして機能する28。液滴は、いったん生成されると、分割29,30、融合31,32、選別33,34、および高次構造35,36への集合などのさらなる操作を受けることもできる。液滴マイクロ流体工学は、PCR37からシングルセルトランスクリプトミクス38、創薬39,40からウイルス学41、次世代シーケンシング42から化学合成43まで、いくつかの科学分野と技術に革命をもたらしました。
PDMSベースのソフトリソグラフィーとマイクロバルブを液滴技術と統合することは、マイクロチャネル内の流体の流れを調整し、その後の液滴含有量の制御を可能にする強力な組み合わせです。チャネルの開閉に応じて、それぞれが特定の組成を持つ液滴の異なる集団を生成することが可能です。このようなプラットフォームは、生化学反応を小型化し、区画化し、並列化することができ、したがって、組合せスクリーニング44に有用な技術となる。コンビナトリアルスクリーニングは、選択された試薬の何万もの組み合わせを生成して、既知の組成の個々の集団で構成されるライブラリを生成するハイスループットな方法です。コンビナトリアルスクリーニングは、細菌増殖阻害のための薬物と抗生物質の間の相乗効果を発見するために使用されてきました45。がん治療の分野では、コンビナトリアルスクリーニングを使用して、特定の患者に対する抗がん剤の組み合わせをテストし、それによって個別化治療を進歩させてきました46,47。Mathurらは、ハイスループット薬物スクリーニングにおけるトランスクリプトームの変化を評価するために、コンビナトリアルDNAバーコーディングアプローチを統合することにより、この技術を構築しました48。このように、コンビナトリアルスクリーニングは強力でありながら初期段階の技術であり、このようなスクリーニング手順を実行および容易にするために、多様なマイクロ流体技術の開発が必要である。
この原稿の目的は、油中水型プラグの組み合わせライブラリを生成できる二層マイクロ流体デバイスを製造するためのプロトコルの完全なセットを提示し、そのようなデバイスの操作に必要なハードウェアとソフトウェアを説明することです。流体の流れは、圧力制御されたPDMSベースの空気圧バルブを使用して調整され、カスタムLabVIEWプログラムによって制御されます。装置内の試薬の流れは、市販の圧力ポンプを使用して達成されます。プラグが3つの入口の内容物によって形成され、それぞれが水性試薬を含む8つの入口プロトタイプが提示される。水相は連続油相と出会い、プラグは周波数0.33HzのT字型接合部で製造されます。システムの機能は、蛍光プラグの3つの異なる集団を含む定量的ライブラリを作成することによって実証されます。この技術と一連のプロトコルは、ハイスループットスクリーニングを目的としたコンビナトリアルライブラリの迅速な作成に役立ちます。

<table><tbody><tr><td>1,1,3,3テトラメチルジシロキサン</td><td>Merck Life Science NV</td><td>MFCD00008256</td><td></td></tr><tr><td>4チャンネルデジタル入出力モジュール</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-504</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Boom Labs</td><td>BOOMSKEUZW3</td><td></td></tr><tr><td>分析ソフトウェア</td><td>アイントホーフェン工科大学</td><td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE</td><td></td></tr><tr><td>AZ 40XT 11D</td><td>メルク ライフサイエンス NV&nbsp;</td><td>212299</td><td>&nbsp;ポジ型フォトレジスト&nbsp;</td></tr><tr><td>AZ 726 MIF 現像液</td><td>Merck Life Science NV</td><td>10055824960</td><td>ポジ フォトレジスト</td></tr><tr><td>Biopsy Punch 現像液、Rapid Core</td><td>World Precision Instruments Germany、GMBH</td><td>504529</td><td>0.75 mm ID、W/プランジ</td></tr><tr><td>ブルー 食用色素</td><td>PME</td><td>FC1036</td><td></td></tr><tr><td>コントローラー エンド モジュール&nbsp;</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH&nbsp;</td><td>750-600</td><td></td></tr><tr><td>イーサネット・コントローラ&nbsp;</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH&nbsp;</td><td>750-881</td><td></td></tr><tr><td>FC-40</td><td>メルク ミリポア</td><td>F9755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>フルイジェント フロー ユニット</td> フル<td>イジェント</td><td>FLU-S-D</td><td></td></tr><tr><td>フルイジェント圧力システム&nbsp;</td><td>フルイジェント&nbsp;</td><td>MFCS-EZ&nbsp;</td><td>0 - 2バー</td></tr>ル<tr><td>フルオレセインメル</td><td>クライフサイエンスNV</td><td>MFCD00005050</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート&nbsp;</td><td>トーリーパインズサイエンティフィック&nbsp;</td><td>HP61</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコンインスツルメンツ&nbsp;</td><td>LabVIEW BOOMSKEUZE3</td> Eclipse Ti-E <td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Boom Labs</td><td></td> (ソフトウェアバージョン20)アイントホーフェン工科大学 https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_ <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>VERSION_1</td><td>すべてのファイルはLabVIEWバージョン20用に保存されています。ファイルを開くには、このバージョン以降を使用することをお勧めします。</td></tr><tr><td>ルアースタブ&nbsp;</td><td>株式会社インステック研究所&nbsp;</td><td>LS23</td><td>23 ga、0.5インチ</td></tr><tr><td>オスルアー-バーブコネクタ&nbsp;</td><td>コール・パーマー&nbsp;</td><td>45505-32&nbsp;</td><td>3/32インチID</td></tr><tr><td>MasterFlex PTFEチューブ</td><td>Avator / VWR</td><td>48634</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドVWR</td><td></td><td>470150-480</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、&nbsp;プレーン</td><td>コーニング</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>メルク ミリポア</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>mr DEV 600</td><td>マイクロレジスト技術</td><td>R815100</td><td>ネガフォトレジスト用現像液</td></tr><tr><td>オーブン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>&nbsp;ヘレウス T6P 50045757</td><td></td></tr><tr><td>酸素プラズマアッシャー</td><td>Quorum Technologies</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Art Services, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フォトマスクデザイン</td>アイ<td>ントホーフェン工科大学(Merten Lab、EPFLから適応)</td><td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg</td><td></td></tr><tr><td>空気圧バルブアレイ</td><td>FESTO</td><td></td><td>1x 8バルブアレイ、ノーマルクローズバルブ</td></tr><tr><td>シリコンウェーハシリコン</td><td>材料</td><td></td><td><1-0-0>、直径100 mm、525 &mu;m 厚さ</td></tr><tr><td>片刃&nbsp;</td><td>GEM Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトチューブ</td><td>Fluigent</td><td></td><td>内径 1 mm Øm、外径 3 mm</td></tr><tr><td>スピン コーター&nbsp;</td><td>ローレル・テクノロジーズ・コーポレーション&nbsp;</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス株式会社&nbsp;</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Kayakli Advanced Materials</td><td>Y311075 1000L1GL</td><td>ネガティブフォトレジスト</td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコーンエラストマーキット (PDMS)</td><td>ダウ</td><td>1317318</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>B Braun Injekt - F Fine Dosage シリンジ</td><td>10303002</td><td></td></tr><tr><td>UV-LED 露光システム</td><td>Idonus</td><td>UV-EXP150S-SYS</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>&nbsp;Vacuumbrand GmbH&nbsp;</td><td>MD1C</td><td></td></tr><tr><td>はかり&nbsp;</td><td>ザルトリウス&nbsp;</td><td>エムプルーブ</td><td></td></tr></tbody></table>

コンビナトリアルプラグ製造のための二層マイクロ流体デバイス

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

液滴マイクロ流体工学は、化学的に異なるナノリットルコンパートメントで多数の反応を実行することを可能にする汎用性の高いツールです。このようなシステムは、単一細胞のインキュベーションからPCR反応の実施、ゲノミクスから化学合成まで、さまざまな生化学反応をカプセル化するために使用されてきました。マイクロ流体チャネルと制御バルブを結合することで、その開閉を制御することができ、それによって、ユニークな組成の液滴の集団からなる大規模なコンビナトリアルライブラリの迅速な生産が可能になります。この論文では、プラグと呼ばれる油中水型エマルジョンのコンビナトリアルライブラリを生成するために利用できる、圧力駆動のPDMSベースの二層マイクロ流体デバイスの製造と操作のためのプロトコルが提示されます。ソフトウェアプログラムとマイクロ流体ハードウェアを組み込むことにより、デバイス内の所望の流体の流れを制御および操作して、コンビナトリアルプラグライブラリを生成し、構成プラグ集団の組成と量を制御することができます。これらのプロトコルは、特に癌患者の生検からの細胞における薬物反応を研究するために、組み合わせスクリーニングを生成するプロセスを迅速化します。

ここでは、油中水型エマルジョン(プラグ)でコンビナトリアルライブラリを産生するためのポリジメチルシロキサン(PDMS)ベースの二重層デバイスの作製について説明します。プラグ製造の自動化に必要なハードウェアとソフトウェアがプロトコルに詳述されており、蛍光プラグの定量的ライブラリの製造も実証されています。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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