Name: 培養ディッシュコーティングのための成体ヒト線維芽細胞からの心臓細胞外マトリックスの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶ 成体ヒト心臓由来線維芽細胞を用いた心臓細胞外マトリックスの作製法。脱細胞化技術で培養ディッシュをコーティングし、心筋細胞とマトリックスの相互作用を研究するための基質を提供します。

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<meta charset="utf8"></head><body>細胞培養のための心筋模倣細胞外マトリックスの生成

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1Lラボラトリーボトル&nbsp;</td><td>VWR</td><td>215-1595</td>使用<td>前に清掃してオートクレーブ</td></tr>してください<tr><td>10mL血清ピペット</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>滅菌、&nbsp; ポリスチレン</td></tr><tr><td>100mmガラスプレート&nbsp;</td><td>VWR</td><td>391-0578</td><td>使用前に清掃し、オートクレーブ</td></tr><tr><td>100 mmプレート</td><td>ファルコン</td><td>351029</td><td>処理済み、滅菌細胞培養皿</td></tr><tr><td>15 mL 滅菌チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352097</td><td>遠心分離滅菌チューブ、ポリプロピレン</td></tr><tr><td>22 mm x 22 mm カバーガラス</td><td>VWR</td><td>631-1570</td><td>オートクレーブ使用前</td></tr><tr><td>25 mL 血清学的ピペット</td><td>ファルコン</td><td></td><td>357525 滅菌、&nbsp;ポリスチレン</td></tr><tr><td>250mL実験用ボトル&nbsp;</td><td>VWR</td><td>215-1593</td><td>使用前に清掃し、オートクレーブ</td></tr><tr><td>35 mmプレート</td><td>ファルコン</td><td>353001</td><td>処理済み、滅菌細胞培養皿</td></tr><tr><td>5 mL 血清ピペット</td><td>ファルコン</td><td>357543</td><td>滅菌済み、ポリスチレン</td></tr><tr><td>50 mL 滅菌チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352098</td><td>遠心分離機 滅菌チューブ、ポリプロピレン</td></tr><tr><td>500 mL 実験用ボトル</td><td>VWR</td><td>215-1594</td><td>クリーンで使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>60mmプレート</td><td>ファルコン</td><td>353004</td><td>処理された無菌細胞培養皿</td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム(NH4OH)</td><td>シグマ- アルドリッチ</td><td>338818</td><td>液体</td></tr><tr><td>使い捨てメス</td><td>VWR</td><td>233-5526</td><td>滅菌および使い捨て</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)</td><td>シグマ- アルドリッチ</td><td>D6429-500ml</td><td>2-8°Cで保管します。C;光への曝露を避け</td></tr>てください <tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>F9665-500ml</td><td>-20°Cで保管してください。血清は、より小さな作業量に分注する必要があります</td></tr><tr><td>細かい鉗子</td><td>VWR</td><td>232-1317</td> 使用<td>前に清掃し、オートクレーブ</td></tr><tr><td>豚の皮膚からゼラチン</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>G1890-100G</td><td>市販の粉末</td></tr><tr><td>ハンクのバランスの取れた塩溶液 (HBSS)</td> <td>シグマ - アルドリッチ</td><td>H1387-1L</td><td>粉末</td></tr><tr><td>大型手術用ハサミ</td><td>VWR</td><td>233-1211</td><td>清潔で使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S3146</td>ペニシリンとストレプトマイシン<td>を使用する前に、清掃してオートクレーブ</td></tr>してください<tr><td>&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P4333-100ml-20</td><td>°Cで保存します。ソリューション&nbsp;塩化</td></tr><tr><td>カリウム</td>シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>P9333</td><td>粉末</td></tr><tr><td>リン酸カリウムモノ塩基性</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P5665</td><td>粉末</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S7653</td><td>粉末</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 二塩基性</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>94046</td><td>粉末</td></tr><tr><td>ステリカップ フィルター</td><td>ミリポア</td><td>S2GPU05RE</td><td>滅菌済みおよび使い捨て 0.22 mm フィルター膜&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>液体</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ml</td><td>-20°Cで保管してください。それはより小さな作業量に分注されるべきです</td></tr></tbody></table>

培養ディッシュコーティングのための成体ヒト線維芽細胞からの心臓細胞外マトリックスの作製

Production of Cardiac Extracellular Matrix from Adult Human Fibroblasts for Culture Dish Coating

培養中に置かれた天然心筋の小さな断片からの線維芽細胞の増殖は、3〜5日以内に観察されました(図1)。
その後の数日間、線維芽細胞の数は増加し続けましたが、これはおそらく心臓組織標本からの持続的な増殖と、皿表面での移動した線維芽細胞の増殖によるものです。メスによる機械的解凝集によって得られたすべての心筋断片が、同じ時間内に同じ数の線維芽細胞を生成するとは期待できません。なぜなら、結果として得られる組織断片は、わずかに異なる体積と細胞生存率を持つことができるからです。特に、成長活性が確認された心筋断片は保持および再播種できるため、線維芽細胞の単離に少なくとも2回使用できます。
線維芽細胞を数回継代培養して、さらなる実験に利用できる細胞の数を増やすことができます。しかし、合流点に達すると、線維芽細胞は in vitro での増殖を停止し、合成と分泌の活性を担い、細胞外マトリックスを沈着させます。その後の脱細胞化により、プレートの表面は心臓ECMメッシュでコーティングされたままになります(図2)。線維芽細胞除去中に、肉眼で逆位相コントラスト顕微鏡を使用して培養皿を目視観察することは、脱細胞化溶液でのインキュベーション時間を必要かつ十分な最小限に抑えるために不可欠です。インキュベーション中に浮遊ベールが存在することは、線維芽細胞の単層の透過化と剥離を示しており、脱細胞化溶液は直後に希釈して除去する必要があります。
線維芽細胞由来の心臓ECMの組成は、線維芽細胞の供給源によって異なります。我々の実験では、正常なヒトの心臓と虚血性心疾患のヒトの心臓から分離された線維芽細胞によって産生される心臓ECMは、異なるタンパク質含有量を持ち、原始的な心細胞の増殖、アポトーシス、および移動に異なる影響を及ぼした11,12。ECMタンパク質の損失は脱細胞化プロセス中に避けられませんが、本プロトコルで採用された方法は、in vitroで産生された心臓ECMの組成と構造を大幅に保存しました(図3)。
このプロトコルでは、心房組織は正常(ドナー)と病理学的(レシピエント)の両方の心臓から取得できるため、使用されました。病理学的(レシピエント)心臓全体を切片にして研究に使用することができますが(ヘルシンキ宣言の原則に従い、地元の倫理委員会の承認を得て)、移植時にドナーの心臓から心室のサンプルを採取することはできません。このため、研究の範囲が正常状態と病理学的状態の心臓組織の違いを調査することである場合、サンプルの最良の供給源は心房壁です。他の生存可能な心臓組織源の利用可能性に応じて、正常または病的な心臓の心房壁または心室壁からのサンプルを、心臓ECMディッシュコーティングの同じプロトコルに従って使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig01.jpg"> 図1:心臓線維芽細胞の単離。 培養の4日後(A)、8日後(B)、および12日後(C)の心筋断片からの線維芽細胞の成長。スケールバー:200μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig01large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig02.jpg"> 図2:細胞外マトリックスの脱細胞化。 脱細胞化溶液中での約10秒(A)、20秒(B)、30秒(C)、40秒(D)、50秒(E)、および60秒(F)のインキュベーション後の線維芽細胞。スケールバー:200μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig03.jpg"> 図3:脱細胞化前後の細胞外マトリックス組成。III型(A,E)およびIV型(B,F)コラーゲン、ラミニン(C,G)、フィブロネクチン(D,H)などの代表的な心臓細胞外マトリックスタンパク質の、線維芽細胞除去前(A-D)および除去後(E-H)の間接免疫蛍光染色。細胞核をDAPI(青)で染色しました。スケールバー:(AC、EG)50μm;(D,H) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ソリューション</td>
			<td colspan="2">ソリューションの構成</td>
			<td>最終巻数</td>
			<td>コメント</td>
		</tr><tr><td>ハンクの平衡塩溶液(HBSS)</td>
			<td colspan="2">市販の動力塩+二重蒸留滅菌水+重炭酸ナトリウム0.35g</td>
			<td>1リットル</td>
			<td>ろ過による滅菌/4°Cでの保存</td>
		</tr><tr><td>脱細胞化ソリューション</td>
			<td colspan="2">0.25% Triton X-100 + 10 mM NH4OH+ PBS</td>
			<td>50ミリリットル</td>
			<td>ろ過による滅菌/4°Cでの保存</td>
		</tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)</td>
			<td colspan="2">DMEM 223.75 mL + ウシ胎児血清 25 mL + ペニシリン/ストレプトマイシン溶液 1.25 mL</td>
			<td>250ミリリットル</td>
			<td>4°Cで保存</td>
		</tr><tr><td>ゼラチン溶液</td>
			<td colspan="2">ゼラチン粉末0.2 g + リン酸緩衝生理食塩水100 ml</td>
			<td>100ミリリットル</td>
			<td>ろ過による滅菌/4°Cでの保存</td>
		</tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)</td>
			<td colspan="2">リン酸カリウム1塩基性カリウム0.1g+塩化カリウム0.1g+塩化ナトリウム4.0g+リン酸二塩基性ナトリウム0.575g+二重蒸留滅菌水</td>
			<td>500ミリリットル</td>
			<td>ろ過による滅菌/4°Cでの保存</td>
		</tr><tr><td>トリプシンストップソリューション(TSS)</td>
			<td colspan="2">5 mL ウシ胎児血清 + 45 mL ハンクスバランス塩溶液</td>
			<td>50ミリリットル</td>
			<td>4°Cで保存</td>
		</tr></tbody></table>表1:研究で使用された各溶液の成分とそれぞれの濃度。

The myocardium is composed of cardiomyocytes and an even greater number of fibroblasts, the latter being responsible for extracellular matrix production. ...

production-cardiac-extracellular-matrix-from-adult-human-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。...

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

この原稿は、表面マーカー発現と細胞選別を使用して、定義された人工心臓組織の作成について説明しています。次に、定義された組織をマルチティッシュバイオリアクターで使用して、心臓細胞療法のメカニズムを調査し、機能的でありながら制御されたヒト心臓のモデルシステムを提供できます。...

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これらの研究では、我々は、回生の研究で使用するための新規、新生児マウスの心臓足場のための方法論を提供します。...

新生児心臓足場：再生研究のための新しい行列

このプロトコルでは、その細胞外マトリックス成分を維持しながらひと心筋の完全な decellularization...

ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

心臓の細胞外マトリックス (ECM) は、人生を通して生理学的な改造に耐えながら組織や臓器における主要なプロセスを調整する分子の複雑なネットワークです。胎児と大人の心の標準化された decellularization 3 D コンテキスト ネイティブ...

生体外研究における 3 D のようなプラットフォームとして胎児と成人の心筋組織を外植体の対等な Decellularization

このプロトコルでは、満足のいく構造的整合性と同期打撃動作立体足場無料心臓組織を作成する純金型ベースの方法について説明します。...

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

このプロトコルの目的は傷の修復のために目標として再生足場インプラントの臨床評価のために適している全体細胞外マトリックス繊維の生産。これらの繊維は中空糸膜の線維芽細胞の培養による生産、膜の分解によって抽出されました。...

いけにえの中空糸膜細胞培養による細胞外マトリックス繊維の生産

この方法の目的は、その後の細胞アッセイのための天然足場として線維芽細胞由来の3D行列を得る。線維芽細胞は、前処理された培養プレートに播種され、マトリックス生成のためにアスコルビン酸で刺激される。マトリックスは、脱細胞化され、関連する細胞(例えば、内皮細胞)を培養するために遮断される。...

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本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞由来の心血管細胞を含むメッシュ状の人工心臓組織を生成し、心臓病の細胞移植療法の調査を可能にする。...

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ここでは、分化前のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、および内皮細胞からなる3D自己組織化心臓ミクロ組織アレイを生成するための使いやすい方法論について説明する。心臓ミクロ組織を生成するためにこのユーザーフレンドリーで低細胞を必要とする技術は、疾患モデリングおよび医薬品開発の初期段階に実装することができる。...

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

ここで提示されるプロトコルは、機械研究、疾患モデリング、およびスクリーニング用途に適した、二重極を有するマルチウェルプレートで48組織の平行培養のための設計された結合組織を生成するプロトコルである。プロトコルは、異なる臓器や種からの線維芽細胞と互換性があり、ヒトの原発性心臓線維芽細胞とここで例示される。...

スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織

学ぶ 成体ヒト心臓由来線維芽細胞を用いた心臓細胞外マトリックスの作製法。脱細胞化技術で培養ディッシュをコーティングし、心筋細胞とマトリックスの相互作用を研究するための基質を提供します。

培養ディッシュコーティングのための成体ヒト線維芽細胞からの心臓細胞外マトリックスの作製

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