Name: 複雑な3D多孔質媒体の運動性と増殖を研究するための3Dプリンティングバクテリア (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 学ぶ 3Dプリンティングを用いてVibrio choleraeやE. coliのコロニーを水素ゲル基質に封入し、複雑な多孔質環境における細菌の運動性と増殖を研究する方法です。細菌の拡散特性を詳細に観察できます。

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R.K.B.は、大統領ポスドク研究員プログラムからの支援を認めています。この資料は、NSF大学院研究フェローシッププログラム助成金DGE-2039656(AMHへ)の支援を受けた研究にも基づいています。A.S.D.-M.(エー・エス・ディー・エム)H.N.L.は、プリンストン大学のLidow Independent Work/Senior Thesis Fundからの支援を認めています。また、 コレラ菌の菌株を提供してくださったBonnie Basslerの研究室にも感謝します。S.S.D.は、NSF助成金CBET-1941716、DMR-2011750、EF-2124863、Eric and Wendy Schmidt Transformative Technology Fund、New Jersey Health Foundation、Pew Biomedical Scholars Program、Camille Dreyfus Teacher-Scholar Programからの支援に感謝しています。

運動性と成長の研究のためのヒドロゲルマトリックス中の細菌のバイオプリンティング

<ol><li>Persat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+world+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanical world of bacteria.</a> Cell. 161 (5), 988-997 (2015).</li>
<li>Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flowing+biofilms+as+a+transport+mechanism+for+biomass+through+porous+media+under+laminar+and+turbulent+conditions+in+a+laboratory+reactor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system.</a> Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).</li>
<li>Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+changes+in+the+bacterial+community+structure+along+a+vertical+oxygen+gradient+in+flooded+paddy+soil+cores%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).</li>
<li>Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+intestinal+bacteria+with+components+of+the+intestinal+mucus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387(2017).</li>
<li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The skin microbiome.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (4), 244-253 (2011).</li>
<li>Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+translocation%3A+Overview+of+mechanisms+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).</li>
<li>Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellum+in+bacterial+pathogens%3A+For+motility+and+a+whole+lot+more%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).</li>
<li>Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+in+the+gut+compress+the+colonic+mucus+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).</li>
<li>Harman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneous+motility+of+the+Lyme+disease+spirochete+in+gelatin+mimics+dissemination+through+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).</li>
<li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li>
<li>Siitonen, A., Nurminen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility+is+a+colonization+factor+in+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection.</a> Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).</li>
<li>Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+and+chemotaxis+in+tissue+penetration+of+oral+epithelial+cell+layers+by+Treponema+denticola%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola.</a> Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).</li>
<li>O’Neil, H. S., Marquis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+flagella+are+used+for+motility%2C+not+as+adhesins%2C+to+increase+host+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion.</a> Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).</li>
<li>Gill, C. O., Penney, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+bacteria+into+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Penetration of bacteria into meat.</a> Applied and Environmental Microbiology. 33 (6), 1284-1286 (1977).</li>
<li>Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+aerobic+bacteria+into+meat%3A+A+mechanistic+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Engineering%22%5BJournal%5D)">Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding.</a> Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).</li>
<li>Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+enhancement+of+bacterial+motility+increases+tumor+penetration%3A+Motility+enhances+bacterial+tumor+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).</li>
<li>Toley, B. J., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+is+critical+for+effective+distribution+and+accumulation+of+bacteria+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue.</a> Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).</li>
<li>Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydration-controlled+bacterial+motility+and+dispersal+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).</li>
<li>de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+bacteria+as+inoculants+in+agricultural+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils.</a> Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).</li>
<li>Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+motility+in+the+survival+and+spread+of+Pseudomonas+fluorescens+in+soil+and+in+the+attachment+and+colonisation+of+wheat+roots%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots.</a> FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).</li>
<li>Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizosphere+biology+and+crop+productivity%E2%80%94a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Research%22%5BJournal%5D)">Rhizosphere biology and crop productivity—a review.</a> Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).</li>
<li>Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+Increases+the+Retention+of+Bacteria+in+Porous+Media+with+Residual+NAPL+Entrapment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment.</a> Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).</li>
<li>Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+Increases+the+Residence+Time+of+Bacteria+in+Granular+Media+Containing+Distributed+Contaminant+Sources%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources.</a> Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).</li>
<li>Ford, R. M., Harvey, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemotaxis+in+the+transport+of+bacteria+through+saturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).</li>
<li>Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+effect+of+chemotaxis+and+growth+on+microbial+distributions+in+organic-amended+aquifer+sediments%3A+Observations+from+laboratory+and+field+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies.</a> Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).</li>
<li>Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+confinement+on+the+spreading+of+bacterial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of confinement on the spreading of bacterial populations.</a> PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063(2022).</li>
<li>Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biophysical+threshold+for+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A biophysical threshold for biofilm formation.</a> eLife. 11, e76380(2022).</li>
<li>Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+semi-solid+agar+for+the+detection+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).</li>
<li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+scaling+laws+for+microgel+yielding+near+jamming%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming.</a> Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+and+activity+regulate+bacterial+motion+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media.</a> Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075(2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+migration+of+bacteria+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chemotactic migration of bacteria in porous media.</a> Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+smoothing+of+collective+migration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chemotactic smoothing of collective migration.</a> eLife. 11, e71226(2022).</li>
<li>Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+open-source+syringe+extruder+optimized+for+extrusion+and+retraction+during+FRESH+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting.</a> HardwareX. 9, e00170(2021).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
<li>Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+growth+kinetics+of+Vibrio+cholerae+in+presence+of+gold+nanoparticles%3A+Effect+of+size+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9671(2017).</li>
<li>Martínez-Calvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+instability+and+roughening+of+growing+3D+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119(2022).</li>
<li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Straightforward+approach+for+3D+bacterial+printing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Straightforward approach for 3D bacterial printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+cell+ordering+in+confined+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118(2021).</li>
</ol>

本書で細菌群集の3Dプリントと画像化に使用されている実験プラットフォームは、Tapomoy BhattacharjeeとS.S.D.に代わってプリンストン大学が出願した特許出願の対象です(PCT出願番号PCT/US/2020/030213)。

プロトコルの重要なステップ 各ヒドロゲルマトリックスを調製する際には、マトリックスが無菌環境で作られていることを確認することが重要です。そうでない場合は、コンタミネーションが発生する可能性があり、数日後にマトリックス内のマイクロコロニー(小さなスフェロイド)などとして現れます。混合プロセス中に、すべての乾燥粒状ヒドロゲル粒子が溶解することが重要です。さらに、各ハイドロゲルマトリックスのpHをNaOHで調整すると、顆粒が膨潤し始め、ハイドロゲルマトリックスの粘度が上昇し、混合が困難になります。スタンドミキサーを使用すると、NaOHがハイドロゲルマトリックスに十分に混合されます。各細菌懸濁液の装填中に、針にエアポケットが形成される可能性があります。この問題を回避するには、針先がチューブの底部や上面付近ではなく、常に遠心チューブ内の細菌懸濁液に収まっていることを確認してください。この問題を克服する別の方法は、大量の細胞を増殖させ、印刷用の細菌懸濁液を大量に持つことです。
制限 現在、印刷中、細菌懸濁液の粘度が低いため、印刷できる形状が制限され、微量細胞によるヒドロゲルマトリックス表面の上部でのバイオフィルム形成および成長につながることがよくあります。この制限を克服するには、バクテリア懸濁液の粘度を上げたり、3Dプリンターの設定をさらに最適化したりするなど、いくつかの方法が考えられます。バクテリア懸濁液の粘度を上昇させるために、バクテリア懸濁液を別のポリマー、例えば、平らな表面へのバクテリアの3Dプリントに以前に使用されていたアルギン酸塩と混合することができる38。顆粒状ヒドロゲルマトリックスから針を回収する際にシリンジプランジャーを引っ込めることができるように、プリンタの設定をさらに最適化することができ、これにより、ヒドロゲルマトリックスから針が除去される間に細胞が沈着するのを止める可能性がある。
既存/代替法に対する方法の重要性 ここで説明する方法は、細菌コロニーを顆粒状のハイドロゲルマトリックスに印刷することを可能にします。粒状ハイドロゲルマトリックスは、細菌の運動性と増殖に対する外部環境要因(細孔径、マトリックス変形性など)の影響を研究することができます。さらに、この研究では、ヒドロゲルマトリックスを膨潤させるための液体増殖培地としてLBが使用されていますが、ヒドロゲルマトリックスは、抗生物質を含む培地を含む他の液体増殖培地で膨潤させることができます。限られた環境でバクテリアを研究する以前の方法は、実験時間の長さ、ポリマーメッシュサイズ、および周囲のハイドロゲルマトリックスの剛性37,38によって制限されていました。さまざまなポリマーから粒状ハイドロゲルマトリックスを製造するためのプロトコルはすでに存在するため、さまざまな環境条件が細菌の運動性と増殖に与える影響を研究する可能性は膨大です。この方法により、宿主の粘液や土壌など、細菌が現実世界で生息する環境をより容易に再現する制御環境で細菌を研究することができます。他の多くの方法のもう一つの制限は、周囲の行列の不透明度です。しかし、光学的に透明な材料を用いたこのアプローチは、例えば、光遺伝学的制御やバクテリアの3Dでのパターニングを探索する能力を提供します。
ここで説明する3Dプリンティング法は、運動性と成長を研究するだけでなく、基材上にバイオインクを堆積させる必要があるため、製造できる人工生体材料の高さが制限される他の多くのバイオプリンティング方法の限界を克服しています。将来的には、このバイオプリンティングプロトコルをさらに拡張して、ポリマーとバイオフィルム形成細胞を混合することにより、バイオハイブリッド材料を製造することができます。粒状ハイドロゲルマトリックスは、現在の他の多くのバクテリアバイオプリンティング法よりも、より厚く、より大規模な人工生体材料とより複雑な形状の3Dプリンティングをサポートします。この研究はコ レラ菌 と 大腸菌 のみを使用したが、 緑膿菌 などの他の種も3Dプリントに成功している37。印刷だけでなく、例えば、遺伝子の変化があったかどうかを確認するために、増殖後に細菌の制御されたサンプリングを行うようにプリンターを適応させることができます。

バクテリアは、腸や肺の粘膜ゲルから地面の土壌まで、多様で複雑な3D多孔質環境に生息することがよくあります1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25。これらの環境では、運動性または増殖による細菌の移動は、ポリマーネットワークや固体ミネラル粒子のパッキンなどの周囲の障害物によって妨げられる可能性があり、細胞が環境中に広がり26、栄養源にアクセスし、新しい地形にコロニーを形成し、保護バイオフィルムコミュニティを形成する能力に影響を与えます27.しかし、従来のラボ研究では、液体培養や平らな表面の細胞に焦点を当て、非常に単純化された形状が採用されているのが一般的です。これらのアプローチは、微生物学に関する重要な洞察をもたらすが、自然生息地の複雑さを完全には再現しておらず、現実世界の環境で行われた測定と比較して、成長率と運動行動に劇的な違いをもたらしている。したがって、細菌のコロニーを定義し、多くの自然生息地に類似した3D多孔質環境での細菌の運動性と成長を研究する方法が決定的に必要とされています。
細胞を寒天ゲルに接種し、その肉眼的な広がりを目視またはカメラで視覚化することは、1936年にTittslerとSandholzerによって最初に提案されたように、これを達成するための1つの簡単な方法を提供します28。しかし、このアプローチには多くの重要な技術的課題があります:(1)原理的には、アガロース濃度を変化させることで細孔径を変えることができますが、そのようなゲルの細孔構造は十分に定義されていません。(2)光散乱により、これらのゲルが濁り、特に大きなサンプルでは、個々のスケールで細胞を高解像度と忠実度で可視化することが困難になります。(3)寒天濃度が大きすぎると、細胞の移動がゲルの上部の平らな表面に制限されます。(4)このようなゲルの複雑なレオロジーは、明確に定義された形状を持つ接種物の導入を困難にします。
これらの制限に対処するために、Datta氏の研究室では、以前の研究で、顆粒状のハイドロゲルマトリックス(液体細菌培養で膨潤した詰まった生体適合性のハイドロゲル粒子で構成される)を「多孔質ペトリ皿」として使用して、細胞を3Dに閉じ込める別のアプローチを開発しました。これらのマトリックスは、柔らかく、自己修復性があり、降伏応力の固体です。したがって、他のバイオプリンティングプロセスで使用される架橋ゲルとは異なり、注入マイクロノズルは、ヒドロゲル粒子29を局所的に再配置することによって、任意の所定の3D経路に沿ってマトリックス内を自由に移動することができる。その後、これらの粒子は急速に再高密度化し、注入されたバクテリアの周りで自己修復し、追加の有害な処理を行うことなく細胞を所定の位置にサポートします。したがって、このプロセスは、調整可能な物理化学的特性を持つ多孔質マトリックス内に、細菌細胞を目的の3D構造で、定義されたコミュニティ組成で配置できるようにする3Dプリンティングの一形態です。さらに、ハイドロゲルマトリックスは完全に透明であるため、イメージングを使用して細胞を直接可視化できます。
このアプローチの有用性は、以前に 2 つの方法で実証されています。ある一連の研究では、希薄な細胞がハイドロゲルマトリックス全体に分散し、個々の細菌の運動性の研究が可能になりました30,31。別の一連の研究では、プログラム可能な顕微鏡ステージに取り付けられた注入ノズルを使用して、多細胞コミュニティをセンチメートルスケールのゲルに3Dプリントし、周囲への細菌集団の拡散の研究を可能にしました32,33。いずれの場合も、多孔質環境に生息する細菌の拡散特性に、液体培養や平坦面に生息する細菌と比較して、これまで知られていなかった違いが明らかになりました。しかし、顕微鏡ステージに取り付けられていたため、これらの先行研究は少量のサンプル(~1 mL)に限定されていたため、実験時間スケールが短かったのです。また、高い空間分解能で接種形状を定義する能力にも限界がありました。
ここでは、両方の制限に対処する次世代の実験プラットフォームについて説明します。具体的には、シリンジ押出機を取り付けた改造3Dプリンターを使用して、細菌コロニーを大規模に3Dプリントおよび画像化するためのプロトコルが提供されています。さらに、代表的なデータは、バイオフィルム形成コ レラ菌 とプランクトン性 大腸菌 を例に、このアプローチが細菌の運動性と増殖の研究にどのように役立つかを示しています。このアプローチにより、細菌のコロニーを長期間にわたって維持し、さまざまなイメージング技術を使用して視覚化することができます。したがって、3D多孔質生息地の細菌群集を研究するこのアプローチの能力は、腸、皮膚、肺、土壌の微生物の処理と研究に影響を与える、非常に大きな研究と応用の可能性を秘めています。さらに、このアプローチは、将来的には、バクテリアベースの人工生体材料をより複雑な自立型形状に3Dプリントするために使用できる可能性があります。

<table><tbody><tr><td>1 mLキュベット</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>1 mL ルアーロックシリンジ</td><td>BH サプライ</td><td>BH1LL</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>100 nm カルボキシル化蛍光ポリスチレンナノ粒子 (FluoSpheres)&nbsp;</td><td>&nbsp;Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)</td><td> F8803</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離管</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-237</td><td></td></tr><tr><td>20 G 鈍針</td><td>McMaster Carr</td><td>75165A252</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 組織培養フラスコ</td><td>VWR</td><td>10861-566</td><td></td></tr><tr><td>3D プリンター</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot Mini 2</td><td></td></tr><tr><td>3D プリント ソフトウェア</td><td>Cura</td><td>Cura-Lulzbot</td><td></td></tr><tr><td>50 mL遠心分離管</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-239</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>カルボマー粒状ヒドロゲル粒子</td><td>Lubrizol&nbsp;</td><td>架橋アクリル酸/アクリル酸アルキル共重合体の</td><td>Carbopol 980NF</td>乾燥顆粒</tr><tr><td>遠心分離機(2 mLチューブ容量)</td><td>VWR</td><td>2405-37</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機(50 mLチューブ容量)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75007200</td><td>Sorvall(ブランド)ST 8(モデル)</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>A1R +倒立レーザー走査 共焦点顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底ペトリ皿</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB (Lubria Broth)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>M8 &times; 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap</td><td>McMaster Carr</td><td>91290A478</td><td></td></tr><tr><td>M8 &times; 1.25 mm, 真鍮 細い六角ナット</td><td>McMaster Carr</td><td>93187A300</td><td></td></tr><tr><td>オープンソース シリンジ ポンプ</td><td>カスタムメイド</td><td>Replistruder 4</td><td>https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791</td></tr><tr><td>シャーレ(丸型60mm)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>せん断レオメーター</td><td>Anton Paar</td><td>MCR 501</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>VWR</td><td>97043-992</td><td></td></tr></tbody></table>

複雑な3d多孔質媒体の運動性と増殖を研究するための3dプリンティングバクテリア

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

バクテリアは、生体組織やゲル、地下の土壌や堆積物など、複雑な3次元(3D)多孔質環境に遍在しています。しかし、これまでの研究の大部分は、バルク液体や平らな表面の細胞の研究に焦点を当てており、多くの天然の細菌生息地の複雑さを完全には再現していません。ここでは、バクテリアの密集したコロニーを詰まった粒状ハイドロゲルマトリックスに3Dプリントする方法の開発を説明することで、この知識のギャップに対処します。これらのマトリックスは、調整可能な細孔サイズと機械的特性を備えています。細胞を物理的に閉じ込め、3Dで支えます。光学的に透明であるため、イメージングを使用して周囲に広がる細菌を直接視覚化できます。この原理の証拠として、ここでは、このプロトコルの能力を、さまざまな間質細孔サイズを持つ詰まった粒状ヒドロゲルマトリックス中の非運動性および運動性 コレラ菌、および非運動性 大腸菌 の3D印刷およびイメージングによって実証されています。

このプロトコルは慣習的な液体培養かペトリ皿より自然な生息地に類似している複雑な3D多孔質のヒドロゲルのマトリックスの運動性そして成長を調査する細菌のコロニーの三次元(3D)印刷のためのプロシージャを記述する。

複雑な3D多孔質媒体の運動性と増殖を研究するための3Dプリンティングバクテリア

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. ...

バクテリアは、生体組織やゲル、地下の土壌や堆積物など、複雑で立体的な多孔質環境に遍在しています。ここでは、バクテリアの高密度コロニーを詰まった粒状ハイドロゲルマトリックスに3Dプリントする方法を開発し、複雑な環境下でのバクテリアの増殖と運動性を研究しています。研究により、多孔質環境に生息するバクテリアの拡散特性は、平坦な表面での液体培養のバクテリアと比較して、これまで知られていなかった違いが明らかになりました。液体細菌培養で膨潤した生体適合性ハイドロゲル粒子を詰まらせた顆粒状ハイドロゲルマトリックスを多孔質ペトリ皿として用い、細胞を3次元に閉じ込める開発。これまでの研究は、1ml程度の少量のサンプルに限定されていたため、実験時間スケールが短く、また、高い空間分解能で接種体の形状を定義する能力にも限界がありました。私たちは、細菌の細胞拡散特性が細胞の細孔サイズと運動性に依存することを立証しました。

3d-printing-bacteria-to-study-motility-growth-complex-3d-porous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: Scheidweiler, D., 他 流体装置と顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを超えた多孔質培地内の微生物輸送を研究すること。 J. Vis.

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複雑な3D多孔質媒体の運動性と増殖を研究するための3Dプリンティングバクテリア

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