Name: 成長円錐の高分解能イメージングのためのアメフラシから神経細胞の培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-20T18:40:00.000+00:00
Duration: 16 min 29 s
Description: 学ぶアメフラシの袋細胞神経細胞の培養と高分解能イメージング法。成長円錐の運動性と細胞骨格動態を解析し、神経発生研究に応用する詳細なプロトコルを解説します。

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我々は、解剖のビデオを編集すると援助のために私たちの手順とロドニーマクフェイル（生物科学科、パデュー大学）の撮影にライアンManeri（ミヤコドリプロダクション、LLC）に感謝したいと思います。スーターのラボでの研究は、パデュー大学のNIH（R01 NS049233）とBindleyバイオサイエンスセンターからDMSへの補助金によってサポートされています

ソリューション<ul><li> L15 - ASWの細胞培養培地（1リットル） <ul><li> L15粉末1袋</li><li> H 2 O超純800mlを追加する</li><li> NaClを400mMの</li><li>し、MgSO 4 27 mMの</li><li>のMgCl 2 28 mMの</li><li> L -グルタミン4 mMの</li><li>ゲンタマイシン50μg/ mlの</li><li> HEPES 5mMの</li><li> pHを7.9に調整する</li><li>ドロップのCaCl 2 9.3 mMの（沈殿物と停止する）ことで、ドロップを追加します。 </li><li> 1リットルにH 2 Oの超高純度を追加</li><li>浸透圧計で浸透圧（950-1000ミリモル/ kg）を確認してください（蒸気圧、Wescor＃5520） </li><li>正圧ろ過ユニット（：ミリポアのSVGV010RSフィルタ）を用いて0.22μmのフィルター</li><li>最大1ヶ月、4℃で保存する</li></ul></li><li>ポリ- L -リジン（70から150 kD）の滅菌H 2 O超純で200μg/ mlのストック溶液は-20 ° Cの保管</li><li> 0.5 M MgCl 2溶液</li></ul> 1日目：アメフラシ腹部神経節の解剖酵素的解離溶液の調製<ol><li>エッペンドルフチュー​​ブに：ディスパーゼ酵素（LS02111ワーシントン、猫）の90〜10 mgを量り</li><li> L15 - ASWの培養液900μlを加え、そして滅菌H 2 O超純100μlの</li><li>室温で混合し、場所（RT） </li></ol>腹部神経節の解剖<ol><li> 0.5 MのMgCl 2溶液と50 mlの注射器を埋める。 </li><li>タンクから一匹を取る、動物のインクの防御反応を避けるために、優しく扱う。 </li><li>右から左に、尾側に解剖基板の側にアメフラシ （発泡スチロールボード）、吻側側に置きます。 </li><li>ちょうど頭の後ろに動物に針を挿入し、体腔内にすべてのMgCl 2溶液を注入する。 </li><li>ゆっくりと体の空洞を通してMgCl 2溶液を分散させるために動物をこすり、完全に麻酔になる動物の数分間待つ。 </li><li> 2本の針で解剖ボードに動物の頭と尾をピン。 </li><li>側に大きな開口部を作るために頭と尾に向かって大きなハサミで皮膚と筋肉の層を切って、皮膚を​​持ち上げるために鉗子を使用してください。 </li><li>ブラシ状卵巣下の腹部神経節を見つける。腹部神経節の前に約1cmの接続の神経を保持するための鉗子を使用して、鉗子保持位置の前で、腹部神経節の後ろに解剖はさみで神経を切断。 </li><li> 22℃15〜16時間ディスパーゼソリューションとインキュベートへの場所の神経節℃の温度制御水浴を使用して。 </li></ol> 2日目：アメフラシの袋細胞のめっきポリ-リジンでコーティングされたカバースリップの準備<ol><li>フローベンチでは、4ミリリットルL15 - ASW媒体それぞれで埋める、神経節の解剖の作業皿として3 35ミリメートルのペトリ皿を準備する。ディスパーゼ溶液から消化の15.5時間後に働く料理の一つに腹部神経節を転送する。 </li><li>鉗子を使用すると、エタノールで保存されている＃1.5カバースリップ（22x22 mm）を酸洗浄を行う、アルコールを削除し、ブンゼンのバーナーを介して簡単にそれらを燃えることによってカバースリップを滅菌する。培養皿にカバースリップを配置する前にそれらを簡潔に冷ます。 </li><li>ブンゼンバーナー（短時間だけ火炎プラスチックの溶融を回避するために！）に黄色の先端を曲げることにより湾曲したメッキの先端を準備。 </li><li>滅菌H 2 O超純で200μg/ mlのストック溶液を希釈し、20μg/ mlのポリ-リジン溶液の適当量を準備します。 </li><li> 20μg/ mlのポリ-リジン、室温で20分間インキュベートの500μlと各カバースリップをカバー。 </li><li> 500μlの滅菌H 2 O超純ごとに各カバースリップ3-5回洗浄する。 </li><li>カバーグラスから水を取り除く。L15 - ASW培地4mlで各皿を埋める。 </li></ol>袋の細胞の解離<ol><li>解剖顕微鏡下で、予め95％エタノール（図1ライン1）で洗浄half使用して解剖ハサミとピンセットで腹部神経節をカット。 </li><li>神経節の半分で、袋の細胞のクラスターとhemiganglion細胞（図1ライン、2）との間で切断し、袋の細胞（図1 3行目）の反対側の残りの神経の拡張子を切り取る。一度に神経節の半分で動作する、最初のクラスタからの細胞が播種されている間に皿に残りの半分を残す。 </li><li> two鉗子を（または1つの鉗子と解剖鋏）を使用して、袋のセルのクラスタを囲む結合組織鞘を脇にプッシュすることでバッグの細胞クラスターを離します。必要に応じて解剖用鋏と結合組織を切り取る。このプロセスの間にあまりにも多くのバッグの細胞クラスターを圧迫し、触れないように注意してください。 </li><li>ほとんどの結合組織のが削除されるとき、bを転送以前の準備曲がった黄色の先端を使用して新しい作業皿にAGの細胞クラスター。袋のセルのクラスタが黄色の先端内に閉じ込めたり、空気/媒質界面で立ち往生するように注意してください。 </li><li>個々の袋の細胞を除去するために黄色の先端を使用してクラスタをひいて粉にする。先端のうちにクラスタをピペッティングすることによって行います。低せん断力から始め、必要に応じて力を増加させる。あまりにも多くの細胞を殺すことなく、神経細胞を除去するために必要な最小の力を常に使用します。 </li><li> 3月5日健康な袋の細胞を収集し、ポリリジンコートしたカバースリップで皿に移す。死細胞（彼らは中央の黒/透明な）と結合組織の破片を拾うことは避けてください。 </li><li>手順6を繰り返します。とそれぞれのカバーの中央に約15-25のライブニューロンを配置。死んだ細胞や破片も同様に転送される場合、それを拾ったり、健康な細胞から、それを吹き飛ばすことによって不要な物質を取り除く。このプロセスは、両方のクラスタのために約2-3時間かかります。 </li><li>一度（不要な振動を避けるために、送風機、フローベンチをオフにしておく）細胞がアタッチできるように室温で少なくとも2時間の流れのベンチ上で培養皿を保つ終えた。 </li><li> 14℃で一晩、またはさらに使用するまでインキュベーターに皿を置きます。成長円錐は、40〜10時間で開発することがあります。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="図1。アメフラシカリフォルニ腹部神経節の概略図。袋のセルクラスタを入手するために切る場所の色の線が示している。" /> 図1。 アメフラシカリフォルニ腹部神経節の概略図。袋のセルクラスタを入手するために切る場所の色の線が示している。 3日目：アメフラシの袋の細胞のライブイメージングのためのチャンバーを設定するイメージングチャンバーの組立<ol><li>ライブセルイメージングの実験のために袋の細胞を使用する前に、低消費電力の顕微鏡で細胞を検査する。細胞が健全な成長円錐を開発していない場合は、新鮮な培地を供給し、1〜2時間室温で残す。 </li><li>新鮮L15 - ASW培地でプレートを供給するため、真空ラインで古い培地の半分（〜2ミリリットル）を削除し、ペトリ皿あたりの新しいL15 - ASW培地2 mlを加える。これはカバースリップからセルを削除するので、完全に、すべてを一度に皿からすべてのメディアを削除しないことが重要です。 </li><li>袋のセルイメージングのために、我々は2つ​​のカバースリップとイメージングチャンバーのようなサンドイッチの2つのプラスチック製スペーサを組み立てます。サンドイッチのトップカバースリップは、培地および試薬の交換が簡単にできるように短くカットされます。組み立て中に、接続されている袋の細胞とカバーガラスを外れから細胞を防止するために常にL15 - ASWの培地に浸漬する必要があります。 </li><li>室を準備するには、カットオフ〜2mmのダイヤモンドペン（ガラスカッター）と定規で第1位カバースリップ22x22 mmの右側から。 </li><li> 1 mlのシリンジを使用して、短いカバーの両側に高真空グリースを適用し、それぞれの側にプラスチック製スペーサを取り付けます。両方スペーサーの上部に真空グリースを塗布してください。 </li><li>カバーガラスの袋の細胞を含むペトリ皿にカバーガラスとスペーサーの組み立て、および場所を反転させる。合わせ、ゆっくりと二つのQ -チップの逆の端と底部カバーに上部カバースリップスティックを押し下げ。 </li><li>鉗子を使用して、静かに漏れる媒体なしペトリ皿のサンドイッチアセンブリを持ち上げます。必要に応じて、二つのカバーグラスを合わせ、キムワイプで余分な培地を拭き取ってください。顕微鏡のスライドホルダーの底部分の上にサンドイッチを置き、クリップを使って慎重にカバーを取り付けます。 </li><li> Q -チップとサンドイッチの上面の中央をきれいにガラスクリーナー（スパークルは、ガラスクリーナーとして使用されている）でdabbed。すぐにストリーク線を避けるために2番目、乾いた綿棒でガラスクリーナーをふいて乾かす。ボトムカバースリップについても同じ操作を行います。ストリークラインの清浄なカバーガラスは、高品質の画像処理のために重要である。 </li></ol>顕微鏡での袋の細胞 アメフラシの袋の細胞ニューロン培養は、低密度であるのであなたの顕微鏡のセットアップは、細胞間の切り替え容易にするために、ステージの位置決め機能を持っている場合、それが最善です。袋の細胞は容易にイメージング実験中にステージ上で数時間室温に保つことができる。蒸発を防ぐために定期的に培地を交換する。

<ol><li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li>
<li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule%2C+apCAM%2C+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li>
<li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li>
<li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li>
</ol>

アメフラシの袋セルのニューロンは非常に少数の非神経細胞に血清を含まない神経細胞培養系を提供しています。これらのニューロンは、重要な細胞生物学的な質問の数に対応するために適切な非常に大きな成長円錐を形成します。袋のセルのニューロンは、簡単に数時間かけて室温で操作して撮像することができます。蛍光を使用することで、1つは、定量的にF -アクチンと微小管の重合と転座のダイナミクスのさまざまなパラメータを分析することができます顕微鏡（FSM）のスペック。最近リリースされたアメフラシゲノムの情報だけでなく、改善された表現手法と一緒にこれらのイメージングツールは、神経細胞成長円錐の運動性と指導の分子細胞メカニズムを研究するためにこれらのニューロンは、強力なモデルシステムを作る。

<table><tbody><tr><td>#1 ガラスカバーガラス 22x22 mm</td><td>器具</td><td>VWR international</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 ガラスカバーガラス 22x22 mm</td><td>器具</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ペトリ皿</td><td>器具</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>培地ろ過用フィルター</td><td>器具</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGV010RS</td><td></td></tr><tr><td>高真空グリース</td><td>器具</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>オスモメーター</td><td>器具</td><td>Wescor</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックシム</td><td>器具</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>SHSP-200</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4030</td><td></td></tr><tr><td>L15培地</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>41300-039</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>試薬</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>試薬</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6070-12</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リシン (70-150 kD)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>試薬</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7581</td><td></td></tr><tr><td>中性プロテアーゼ (Dispase)</td><td>試薬</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02111</td><td></td></tr></tbody></table>

成長円錐の高分解能イメージングのためのアメフラシから神経細胞の培養

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

神経成長円錐は、環境で指導の手がかりを検出し、適切な標的細胞に向けて方向性に、この情報を伝達することができる軸索の先端に非常に運動性構造です。完全なガイダンス情報が細胞表面から基盤となる動的な細胞骨格ネットワークに送信する方法を理解するためには、高い時間および空間分解能でのタンパク質の動態の生細胞イメージングに適したモデル系が必要です。典型的な脊椎動物の成長円錐は、定量的にF -アクチンと微小管のダイナミクスを分析するには小さすぎます。アメフラシアメフラシカリフォルニから神経細胞は、脊椎動物の神経細胞よりも5〜10倍も大きいです簡単に室温に保つことができるとマイクロマニピュレーションと生物物理学的測定のための非常に堅牢な細胞である。彼らの成長円錐は、非常に細胞質領域とも上述の細胞骨格系を定義している。神経細胞体は、成長円錐の運動性と指導を​​研究するためのプローブの様々なマイクロインジェクションすることができます。現在のプロトコルでは、腹部神経節の郭清のための手順を示す袋の細胞の神経細胞の培養と成長円錐の生細胞イメージングのためのイメージングチャンバーを設定。

アメフラシカリフォルニのニューロンは、成長円錐の運動性と指導の高分解能イメージングのための優れている文化の中で大きな成長円錐を開発する。ここでは、アメフラシの袋の細胞ニューロンの解剖やメッキ用だけでなく、生細胞イメージングのためのチャンバーを設定するためのプロトコルを提示する。

神経細胞の成長円錐は、軸索の先端に位置する非常に可動性の高い構造であり、環境中のガイダンスキューを検出し、この情報を変換して……

疑似ラボでは、海洋軟体動物のPlegia californicaから神経細胞を培養します。これらのニューロンは非常に大きな成長円錐を伸長させるため、成長円錐の運動性とガイダンス、特に細胞骨格のダイナミクスを高解像度で研究するための非常に優れたモデルシステムとなります。このビデオでは、Plegiaの解剖と神経細胞培養の手順を実演します。こんにちは。パデュー大学生物科学科のDaniel Suterです。本日は、大脳皮質ニューロンの解離、培養、およびイメージングの手順について解説します。Cerebral cortex由来のニューロンは、学習と記憶の研究に広く利用されてきました。Apiaは単純な神経系を持ち、電気生理学に適した大きなニューロンを有しています。当研究室では、これらのニューロンの成長円錐が大きく、成長円錐の運動性とガイダンスに関連するタンパク質ダイナミクスの高解像度イメージングに非常に適しているため、使用しています。全手順は以下のステップで構成されます。1日目に動物を犠牲にし、解剖して腹部神経節を採取します。2日目に培養プレートを準備します。背側の細胞クラスターを解剖し、個々のニューロンを播種します。3日目には、DIC微分干渉コントラスト顕微鏡を用いた細胞のタイムラプスイメージング用のイメージングチャンバーを構築し、その手順を実演しながら解説します。本日の手順は、私の研究室の大学院生であるiTune Leeが担当します。彼女が、背側細胞ニューロンの調製方法について説明します。それでは始めましょう。bag cellニューロンは、plegia神経系の腹側神経節の一部であるため、酵素消化に向けて腹側神経節全体を摘出します。その後、2つのbag cellクラスターを神経節の残りの部分から分離します。結節神経節をこのフェーズ2溶液中で15〜16時間消化し、結合組織を緩ませます。次に、動物の安楽死に用いる0.5 Mの塩化マグネシウムを満たした60 mLの大型シリンジと、解剖器具（ピンセット1本、解剖用はさみ、大型はさみ）を用意します。使用する個体はカリフォルニア沿岸産の *Pleurobranchus californicus* で、体重は約150 gです。動物はロブスタータンク内で最大3〜4週間維持します。塩化マグネシウム溶液を、動物の頭部付近から体腔内に注入します。動物を軽く揉むことで、溶液の拡散を促し、筋肉の収縮を防ぎます。注射針を用いて、動物の頭部と尾部をスタイロフォームボードに固定します。ピンセットで体壁筋をかき上げ、大きなはさみで体腔を切開します。次に、頭部から尾部にかけて側面の体壁を切り開き、筋肉をボードにピンで固定します。次に、ブラシ状の黄色い器官である卵巣の下にある腹神経節を探します。腹神経節が見つかったら、解剖用ハサミで神経節の前方および後方の神経を切断し、神経節を切り離します。次に、神経節を1 mLの置換液が入った試験管に移し、22 °Cのウォーターバスで15.5時間放置します。このインキュベーションにより、結合組織が緩み、後方細胞クラスターを容易に除去できるようになります。後方細胞の培養を開始する前に、ニューロンを培養するためのカバーガラスを準備します。私たちは、35 mmのペトリ皿内のリジンコーティングされたカバーガラス上で、後根細胞ニューロンを培養します。その後、高塩濃度培養液であるL 15 A SW培地を満たします。この種の細胞の場合、通常、動物1匹につきカバーガラスを入れたペトリ皿を8〜10枚準備します。次に、バッグ細胞ニューロンの播種に使用する器具について説明します。バッグ細胞クラスターの解離には、L 15 A SWを満たしたカバーガラスなしのペトリ皿3枚、アルコール滅菌済みの微細ピンセットおよび剪刀、そしてP 20ピペットに取り付けた曲げ加工済みのイエローチップが必要です。イエローチップは、ブンゼンバーナーの炎にかつて速やかに通過させて加熱し、ピンセットを用いて曲げることで作製します。曲げ部分を押し潰さないように注意してください。そうしないと、後でバッグ細胞クラスターがそこに詰まる可能性があります。プレギアバッグ細胞の解剖と播種は、解剖顕微鏡下で室温にて行います。15.5時間の酵素インキュベーションが終了したので、腹神経節をディスクスペースからL 15 A SW培地が入ったワーキングディッシュのいずれかに移します。バッグ細胞の単離方法を示す前に、まず模式図を確認しましょう。腹神経節をどのように解剖するかを視覚化するため、まず腹神経節を中央で切断します。この線でわかるように、次に後方の前後に2箇所切開を入れます。すると、ここで見られるようにクラスターが形成されます。実体顕微鏡で観察すると、腹神経節が中央で切断されており、背側細胞クラスターの前後に2つの切り込みが入っていることが確認できます。次に、ピンセットで結合組織の隙間を見つけ、袋細胞クラスターを囲む結合組織鞘をそっと押し下げます。解剖用ハサミを用いて、可能であれば結合組織をクラスターから一塊として取り除きます。ただし、バッグ細胞クラスターを損傷させないように注意してください。曲げたチップで培地を吸い込み、バッグ細胞クラスターを別の作業用ディッシュに慎重に移します。イエローチップを用いてバッグ細胞クラスターを軽く叩き、クラスターから個々のバッグ細胞を分離させます。この操作を行うには、クラスターをピペットチップで吸い上げ、気泡が入らないように押し出します。クラスターから生細胞を、polyコーティングしたカバーガラスが入ったディッシュに転移させます。死細胞は中心部が黒く見え、生細胞は白く見えます。顕微鏡観察のために、細胞をカバーガラスの中央に配置し、細胞の破片や死細胞をできるだけ早く除去することが重要です。不要な物質を吸い取るか吹き飛ばすことで、健康な細胞がポリリシンコートプレートに速やかに接着します。各カバーガラスに約 15 〜 25 個の細胞を配置してください。最初のクラスターのすべての細胞を配置した後、2番目のクラスターの結合組織を取り除き、同様の細胞播種手順を続けます。すべてのプレートが完了したら、細胞が適切に接着するように、振動を避けながらフロアベンチの室温で少なくとも2時間静置します。その後、ディッシュをスチロール製またはプラスチック製のトレイに乗せ、次に使用するまで14 °Cのインキュベーターに移します。通常、播種から1〜2日後に神経成長円錐のイメージングを行います。神経成長円錐のダイナミクスのタイムラプスイメージングでは、プラスチック製のスペーサーで隔てた2枚のカバーガラスを用いて、小さなイメージングチャンバーを作成します。下側のカバーガラスにはニューロンが付着しています。培地の交換を容易にするため、上のカバーガラスはダイヤモンドペンで短くカットします。次に、顕微鏡ステージ上で、カバーガラスで挟んだサンプルを顕微鏡に固定するための特製ホルダーに配置します。培地の漏出を防ぎつつチャンバーの各要素を固定するために、ステージ用高真空グリースを使用します。小さなシリンジを用いて高真空グリースを上部カバーガラスに塗布し、ピンセットでスペーサーを配置した後、その上にさらに真空グリースを塗布します。次に、アセンブリ全体を持ち上げて反転させ、細胞が浸漬されたままのディッシュ内のカバーガラス上にゆっくりと押し当てます。綿棒を使用してカバーガラスの位置を合わせ、上のカバーガラスを割らないように注意しながら押し下げます。その後、サンドイッチ状になったものをディッシュから慎重に取り出し、余分な培地を拭き取って、ホルダーのベースに設置します。カバーガラスに圧力をかけて割らないように注意しながら、サンドイッチをホルダーに設置します。綿棒にSparkleガラスクリーナーを含ませ、両方のカバーガラスを洗浄します。ガラスに残る拭き跡が少ないため、Sparkleの使用を推奨します。カバーガラスの中央から円を描くように洗浄し、すぐに乾いた綿棒で拭き取ることで、拭き跡を防ぎます。高品質なイメージング、特にDIC光学系を用いる場合には、カバーガラスの洗浄が非常に重要です。脊髄後角細胞の神経細胞培養は低密度であるため、顕微鏡にステージポジショニング機能が備わっていれば、異なる細胞間の切り替えが容易になり非常に便利です。これで、成長円錐の形態と運動性を観察する準備が整いました。高解像度の微分干渉コントラスト（DIC）タイムラプスイメージングを用いて、形態および運動性の増殖を可視化します。この60倍のDICタイムラプス動画において、DICイメージングは成長円錐構造の表面視を提供するため、このアプリケーションに有用です。典型的な成長円錐の3つの領域を明確に観察することができます。周辺領域は、affect enrich la mela podiaおよびop podiaで構成されています。移行帯はラフリング活性によって特徴づけられ、中心領域には主に微小管と細胞小器官が含まれています。成長円錐の操舵メカニズムを研究するため、私たちはこの拘束ビーズ相互作用（RBI）アッセイを開発しました。細胞標的基質の模倣として、アルテシアンタンパク質でコーティングされたマイクロビーズを用います。DICタイムラプス動画では、マイクロニードルを用いてビーズを成長円錐の周辺領域に配置しています。中心領域において、逆行性に移動する波による逆行効果とフローが観察できます。オルガネラは微小管上を移動します。顕著な変化が見られない初期期間の後、中心領域の境界が拘束されたビーズに向かって急激に前方へ移動するのが観察されます。また、先端成長と張力の増加に伴い、特にビーズとの相互作用軸に沿って、流れの減衰と微小管の伸長が観察されます。成長円錐における細胞骨格のダイナミクスを解析するため、蛍光スペックル顕微鏡法を用います。蛍光標識したチューブリンおよびアクチンプローブを神経細胞体に微量注入し、タイムラプス動画を撮影します。細胞骨格の動的な動きの中で、赤色で示されたアクチンは前縁に沿って組み立てられ、逆行流によって後方に輸送され、移行帯でリサイクルされます。緑色で示された動的な微小管が、構築と転位挙動の組み合わせによって成長円錐の辺縁部の伸長を探索しています。ラベル化量を少なくすることで斑点状のパターンとなり、細胞骨格ダイナミクスのさまざまなパラメータを定量的に分析することが可能になります。神経成長円錐の高解像度イメージングを行いたい方のために、背根神経節細胞の解剖、培養、およびイメージングの手法を解説しました。成長円錐のサイズが大きく、細胞質領域が明確に定義されており、細胞骨格についても十分に記述されているため、このシステムを利用することが非常に有効です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っております。

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