Name: シロイヌナズナとアブラナ属の毛根の変形と再生 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶ アグロバクテリウムを用いたアブラナ属とシロイヌナズナの毛根変形・再生プロトコル。迅速な遺伝子解析と形質転換効率の向上に貢献する植物遺伝学研究手法です。

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我々は、アグロバクテリア株を提供してくれたJiří Macas(Biology Centre CAS, České Budějovice, Czech Republic)に感謝する。CEITEC MUのコアファシリティプラントサイエンスは、その技術サポートで認められています。この作品は、チェコ共和国教育・青年・スポーツ省の欧州地域開発基金プロジェクト「SINGING PLANT」(no.CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446)およびINTER-COSTプロジェクトLTC20004。

アグロバクテリウム媒介性植物の毛根誘導と再生

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</ol>

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係なしに実施されたと宣言しています。

我々は、B. napusとA. thalianaの毛根の形質転換とその後の再生のための簡単なプロトコルを開発しました。このプロセスには、胚軸(B. napus)または一次花序茎(A. thaliana)への注射ベースの毛根誘導が含まれます。胚軸にRiプラスミドを保有するアグロバクテリアC58C1株を注入する方法は、本研究で紹介したアブラナ科のほか、マメ科10,11でも有効であった。
注入ベースの方法の代替として、外植片を細菌懸濁液に浸漬し、その後外植片をアグロバクテリアと共培養する浸漬ベースの形質転換があります。浸漬法に対する注入ベースの方法の利点は、外植片の準備、共培養時間のテスト、および毛むくじゃらの根を誘導するためのホルモンを含む培地での培養など、いくつかのプロトコルステップがないために時間を節約できることです。どちらのアプローチも毛根誘導に有効であるが、植片浸漬法と比較して、注入ベースの方法ではより高い形質転換効率が観察された12,13。さらに、注入ベースの形質転換は、複合植物(トランスジェニック毛根および野生型シュート)の生成にも有用である。形質転換した植物の元の根を切り取った後、毛むくじゃらの根が植物の成長を支え、導入遺伝子を植物全体の文脈で研究することができます。
毛根誘導の重要なステップは、胚軸、または一次花序の茎に接種物を注入することです。 B. napus の胚軸は壊れやすく、胚軸全体を切断することは容易に起こり得る。 A. thaliana でも、花序の茎が細いため、同じことが観察されます。異なる種/品種の形質転換効率の比較が必要な場合は、植物を注入する際の操作とスキルによって引き起こされるエラーを回避するために、1人ですべての実験を行うことをお勧めします。
我々は、B. napus DH12075 と A. thaliana Col-0 の毛根再生に有効なプロトコールを開発しました。再生は非常に可変的なプロセスであるため、選択した種または品種にいくつかのプロトコルの変更を適用することができます。例えば、毛根由来の苗条は、B. oleraceaの異なるオーキシン/サイトカイニン比(1:1)によって誘発され得る14。或いは、サイトカイニンチジアズロンをBAPの代わりに用いることができる、例えば、B. campestris毛根15の場合などである。
植物ゲノムへの Ri プラスミドT-DNAの複数回の挿入は、毛根の形質転換および再生システムの潜在的な限界を表しています。そのような場合、 T1 苗木の分離分析後にRiプラスミド由来のTL/TRを含まない植物は発見されません。したがって、導入遺伝子ごとにいくつかの独立した毛根線を生成することをお勧めします。
毛根培養は、主にその迅速な確立と安価なメンテナンス(培地にホルモンを必要としない)のために、遺伝子機能研究のための非常に強力なツールです。このプロトコルはB .のnapus およびA .のthalianaの毛の根の誘導そして再生のための方法をカバーします、複合植物を使用して全植物において、またはtransgenic植物の再生の後で毛が生えている根文化の興味のtransgeneを直接調査するのに使用することができる。

植物の形質転換は、植物生物学における遺伝学的研究のボトルネックです。土壌伝染性細菌であるAgrobacterium tumefaciensは、形質転換体を生成するためのフローラルディップまたは組織培養による遺伝子送達の手段として広く使用されています。A. tumefaciensは、創傷部位の植物に感染し、腫瘍誘導(Ti)プラスミドからのT-DNAが宿主植物のゲノムに導入および組み込まれるため、腫瘍を引き起こします。野生型T-DNAを含まない改変Tiプラスミドと、人工T-DNAと目的遺伝子を挿入するためのクローニング部位を有するバイナリーベクターを用いた遺伝子操作型A. tumefaciens株は、効率的な植物形質転換系として一般的に用いられている1。しかし、多くのモデル種や作物は、花の浸漬やin vitroでの植物再生に抵抗性であったり、成長サイクルが長かったりするため、この形質転換システムの効率に影響を与えます。
アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)は、宿主植物に感染した後、傷口に不定根(毛根)の形成を誘導します。A. tumefaciensと同様に、A. rhizogenesは、根誘導(Ri)プラスミドから宿主植物のゲノムにT-DNAを転移し、トランスジェニック毛根の発達を引き起こします。このプロセスは、主に根の発がん遺伝子座(rol)によって制御されています2,3。毛根培養は、Riプラスミドと目的の遺伝子をコードする人工バイナリーベクターの両方を持つアグロバクテリア株を使用して、組換えタンパク質の産生、プロモーターまたは遺伝子の機能の解析、またはClustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質9(Cas9)4,5,6を使用したゲノムの編集に使用されています。
私たちのプロトコルは、RiプラスミドpRiA4b7を運ぶトランスコンジュガントTi-less A. tumefaciens C58C1を使用します。RiプラスミドのT-DNAは、右と左のT-DNA(それぞれTR-DNAとTL-DNA)の2つの領域で構成されており、これらは独立して植物ゲノムに組み込むことができます8。このシステムを利用して、アブラナ属の品種DH12075の長い外植形質転換プロセスを最適化しました9。以下に詳述されるプロトコルは指定毛が付いている根ラインの再生を可能にし、興味のtransgeneを運ぶそして大体1年のrolの遺伝子の自由のT1植物を得る。注入ベースの毛根形質転換は、シロイヌナズナCol-0の形質転換によって示されるように、他のアブラナ科種で使用できます。 胚軸は B. napus の形質転換に用いられるが、A. thaliana は一次花序の茎に注入される。

<table><tbody><tr><td>1.50 mLチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>125.215</td><td></td></tr>市販<tr><td>の漂白剤の10%溶液&nbsp;</td><td>SAVO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-ナフタレン酢酸(NAA)&nbsp;</td><td>デュチェファ</td><td>N0903</td><td>カルス再生培地</td></tr><tr><td>2.0 mLチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>108.132 / 108.078</td><td></td></tr><tr><td>3Mマイクロポアテープ</td><td>マイクロポア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-ベンジルアミノプリン(BAP)&nbsp;</td><td>デュチェファ</td><td>B0904</td><td>カルス再生培地、シュート伸長培地&nbsp;</td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細菌寒天</td><td>HiMedia</td><td>RM201</td><td>LB中</td></tr><tr><td>細菌学的ペプトン</td><td>オキソイド</td><td>LP0037</td><td>LBおよびYEB media</td></tr><tr><td>牛肉抽出物</td><td>ロス</td><td>X975.1</td><td>YEB中</td></tr><tr><td>ボトル</td><td>デュラン</td><td>L300025</td><td></td></tr><tr><td>セフォタキシムナトリウム</td><td>デュチェファ</td><td>C0111</td><td>毛深い根の成長培地、カルス再生培地、シュート伸長培地、根誘導培地クロ</td></tr><tr><td>ロホルム</td><td>3955301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTABヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化シ</td><td>グマ</td><td>52365</td><td></td></tr><tr><td>dNTPミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-チトリプレックスIII、(エチレンデニニトリロ)四酢酸、二ナトリウム塩、二水和</td><td>物シグマ</td><td>ES134-250G</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エレクトロフェシス寒天、peqGOLD ユニバーサル</td><td>VWR</td><td>732-2789</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動チャンバー</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気泳動ゲルリーダー</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター GenePulser Xcell</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser エレクトロポレーションキュベット、ギャップ 0.2 cm</td><td>BIO-RAD</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Gene Ruler DNA ラダーミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SM0331</td><td></td></tr><tr><td>ジベレリン酸 (GA3)</td><td>Duchefa</td><td>G0907</td><td>シュート伸長培地&nbsp;</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (2-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピレラジニル)-エタンスルホニーク</td><td>メルク</td><td>1101100250</td><td></td></tr><tr><td>インドール-3-酪酸 (IBA)</td><td>Duchefa</td><td>I0902</td><td>根誘導培地</td></tr><tr><td>カナマイシン モノサルフェート</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>マゼンタ GA-7 植物培養ボックス 蓋付き</td><td>植物培地</td><td>V8505-100</td><td></td></tr><tr><td>測定シリンダーMES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一水和物</td><td>デュチェファ</td><td>M1503</td><td>毛深い根成長培地、カルス再生培地、シュート伸長培地、根誘導培地、発芽用培地、植物生育培地</td></tr><tr><td>ムラシゲとスクーグ培地(MS)</td><td>デュチェファ</td><td>M0237</td>発<td>芽用培地、植物生育培地</td></tr><tr><td>ムラシゲとスクーグ培地(MS)+ B5ビタミン&nbsp;</td><td>Duchefa</td><td>M0231</td><td>毛深い根の成長培地、カルス再生培地、シュート伸長培地、根誘導培地針</td></tr><tr><td>アガニ 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td><td>テルモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH メーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィタジェル</td><td>シグマ</td><td>P8169</td><td>カルス再生培地、根誘導培地、発芽用培地</td></tr><tr><td>PVP 40 (ポリビニルピロリドン Mr 40000)</td><td>シグマ</td><td>9003-39-8</td><td></td></tr><tr><td>Redtaq DNAポリメラーゼ、不活性色素によるルーチンPCR用Taq、10Xバッファー付属</td><td>Sigma</td><td>D4309-250UN</td><td></td></tr><tr><td>Retshミル</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Lachner</td><td>30093-APO</td><td>LB 中</td></tr><tr><td>角 ペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>GOSSBP124-05</td><td></td></tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>ペンタ</td><td>24970-31000</td><td>毛深い根の成長媒体、カルス再生媒体、シュート伸長媒体、根誘導媒体、発芽用媒体、植物成長媒体</td></tr>シ<tr><td>リンジフィルター</td>カール<td>ロス</td><td>P666.1</td><td>ロチラボシリンジフィルター0.22&マイクロ;m細孔サイズ</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ティカルシリン 二ナトリウム</td><td>デュチェファ</td><td>T0180</td><td>毛深い根の成長培地</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメサン</td><td>セルバ</td><td>3719003</td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td>ミリポア ミリQ精製水&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>デュチェファ</td><td>Y1333LB</td><td>ミディアム</td></tr></tbody></table>

シロイヌナズナとアブラナ属の毛根の変形と再生

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

毛根の形質転換は、さまざまな種の植物バイオテクノロジーのための汎用性の高いツールです。根誘導(Ri)プラスミドを持つアグロバクテリウム株による感染は、Riプラスミドから植物ゲノムへのT-DNAの転写後、創傷部位に毛根の形成を誘導します。プロトコルはBrassicaのnapusのDH12075およびArabidopsisのthaliana Col-0の注入基づかせていた毛根誘導のプロシージャを詳しく記述する。毛むくじゃらの根は、目的の導入遺伝子を分析するために使用したり、トランスジェニック植物の生成のために処理したりすることができます。サイトカイニン 6-ベンジルアミノプリン (5 mg/L) およびオーキシン 1-ナフタレン酢酸 (8 mg/L) を含む再生培地は、両種でシュート形成をうまく誘導します。プロトコルは興味のtransgeneを運ぶ植物を得るために再生剤およびT1植物のgenotypingそして選択をカバーし、RiのプラスミドからのTDNAの自由。複合プラントの形成につながる代替プロセスも描かれています。この場合、毛むくじゃらの根は(自然の根の代わりに)シュートに保持され、植物全体の文脈で毛むくじゃらの根の培養における導入遺伝子の研究が可能になります。

私達は前に Brassica napusの3つの品種、即ちDH12075、Topas DH4079およびWestar9の注入基づかせていた毛根の誘導のためのプロトコルを最大限に活用した。この形質転換プロトコルをモデル種A . thalianaに適用するために、生後1ヶ月の植物体の一次花序茎にアグロバクテリア接種を注入しました。毛むくじゃらの根は、2〜4週間後に注射部位に現れました。毛むくじゃらの根を切除し、固体培地で栽培した。これら 2 つの種における方法の比較を 図 1 に示します。
選択された毛状根線を再生培地に移し、シュート形成を誘導した。 A. thalianaでは、試験した10本の毛根系統すべてで14日以内に黄色いカリが誘導されました。濃い緑色の斑点として見える最初のシュート原基は、再生培地に移行してから3週間以内に現れました(図2)。4週間の培養後、新芽は10本の毛根線のうち9本の毛根を覆った(再生効率90%)。いくつかのケースでは、カルスから不定根が誘発されました(図2H)。1本のラインは、再生培地で3ヶ月経っても再生しませんでした(4週間ごとに、毛根を新しい培地に移しました)。したがって、 A. thaliana の毛むくじゃらの根の再生効率は、 B. napus DH120759の効率に類似している。
B. napusとA. thalianaの毛根再生剤は矮性表現型(図3)を示し、毛根由来植物の典型的な特徴である2。また、密集した根系、しわの寄った葉、開花時期の変化も観察しました。このいわゆる毛根(またはRi)表現型は、植物ゲノムに挿入されたRiプラスミドからのrol遺伝子によって引き起こされます。バイナリベクター上にコードされたRi T−DNAおよび導入遺伝子の挿入は、独立していてもよく、連結されていてもよい。したがって、自家受粉によって作製されたT1子孫の分離分析は、目的の導入遺伝子を発現するロールフリー植物の同定に役立ちます。T1植物のジェノタイピングは、TLおよびTRのORFおよび目的の導入遺伝子に特異的なPCRプライマーによって行われます。アグロバクテリア汚染の不在は、virCプライマーのPCR産物の不在によって検証されます(図1)。
<img alt="形質転換図、PCR、毛根誘導、T1植物ジェノタイピング、機能導入遺伝子解析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1: A. thaliana と B. napusの手順の概要。 胚軸または一次花序の茎に アグロバクテリウム 菌を注入すると、毛根の発達が誘発されます。毛むくじゃらの根は、在来の根に取って代わって、遺伝子型決定および分析される複合植物を生成することができます(青い矢印)。培養された毛根は、T0植物に再生され、T1植物で繁殖し、遺伝子型決定することができます(緑の矢印)。毛むくじゃらの根は、機能分析のために継代培養することもできます(黒矢印)。ジェノタイピングの結果の例を紹介します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="植物組織培養の成長段階;形態学的変化を示す4週間にわたる顕微鏡画像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2: A. thalianaの毛根の再生。 (A)プレートへの移し替えから1日後の毛根培養。(B、C)Calliは、再生培地で培養してから2週間以内に発症しました。(D、E)シュート原基は、培養の3週間後に出現しました。(G、H)芽は4週間後に形成されます。(H)カルスから発達した不定根。(C、F、I)再生しない毛むくじゃらの根線。スケールバーは 1 cm を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="シロイヌナズナとアブラナ属のナップスの再生比較。野生型と毛むくじゃらの根由来の植物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:野生型植物 B.napus と A.thaliana の代表的な写真と毛根由来の再生剤(T0植物)。 再生剤のRi表現型に注意してください。スケールバーは 2 cm を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

プロトコルは シロイヌナズ ナの第一次花序の茎および Brassicaのnapusの hypocotylsを使用して毛が付いている根の誘導を記述する。毛むくじゃらの根は培養され、トランスジェニック植物を再生するための外植片として使用できます。

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

私たちの研究は、アブラナ科の効率的な形質転換のためのプロトコルを開発することを目的としていました。毛根をベースとした形質転換により、研究に不可欠なアブラナ属の形質転換効率を飛躍的に向上させました。また、モデル種であるシロイヌナズナでもプロトコルをテストしました。アブラナ属の春品種DH12075のプロトコルを最適化しました。次の課題は、アブラナ属の冬品種、アブラナ属のラパ、アブラナ属のオレラセア属の冬品種の形質転換と再生のプロトコルを最適化することです。毛むくじゃらの根は容易に繁殖することができ、その急速な成長により、形質転換後すぐに目的の遺伝子を迅速に解析することができます。その結果、所望の形質を示す特定の毛根線を選択的に再生することが可能となる。例えば、CRISPR-Casによって導入された遺伝子変異。

hairy-root-transformation-regeneration-arabidopsis-thaliana-brassica

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我々は、資源を多く消費する無菌組織培養手技を用いず、無性生両生のアブラナ科植物Rorippa...

無性両生アブラナ科植物Rorippa aquaticaの効率的な再生ベースのアグロバクテリア媒介形質転換

このビデオでは、シロイヌナズナの14日齢の実生の組織から無傷のプロトプラストを単離するための手順を示しています。分離されたプロトプラストは、少なくとも96時間のためにそのまま残るし、代わりに一ヶ月の成熟植物の苗から分離されていることを考えると、この手順は、無傷プロトプラストを必要とするアッセイを迅速に処理されます。...

の14日齢の苗の組織からのプロトプラストの単離シロイヌナズナ</em

空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。...

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

この記事はのフローラルディップ法を示しています。...

フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2：：β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

極性脂質抽出物の組成と個々のグリセロ脂質の脂肪酸組成は、シンプルで堅牢な脂質プロファイリング実験で決定されます。この目的のために、グリセロ脂質は薄層クロマトグラフィーによって分離されているとそのアシル基のメチル基移転を行った。脂肪酸アシルメチルエステルをガス -...

気-液クロマトグラフィー（GLC）とあいまって薄層クロマトグラフィー（TLC）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング

我々は、より開発の初期段階で胚を単離するための効率的で簡単な方法を報告する...

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

学ぶ アグロバクテリウムを用いたアブラナ属とシロイヌナズナの毛根変形・再生プロトコル。迅速な遺伝子解析と形質転換効率の向上に貢献する植物遺伝学研究手法です。

シロイヌナズナとアブラナ属の毛根の変形と再生

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