Name: 造血器官からの間質細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 学ぶ造血器官からの間質細胞単離法。マウス骨髄・胸腺およびヒト胸腺組織からの単離プロトコルを解説。シングルセルマルチオミクス対応により、造血研究の新たな知見獲得に貢献します。

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私たちは、マサチューセッツ総合病院のHSCI-CRMフローサイトメトリー施設とハーバード大学のバウアーコア施設から専門的な技術支援を受けました。T.K.とK.Gはスウェーデン研究評議会、C.M.はドイツ研究財団の支援を受けました。シングルセルRNAシーケンシングデータの解析にご協力いただいたSergey Isaev氏とI-Hsiu Lee氏に感謝いたします。

胸腺および骨髄からの間質細胞単離の最適化

<ol><li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).</li>
<li>Severe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+changes+in+bone+marrow+stromal+cell+populations+revealed+through+single-cell+protein+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).</li>
<li>Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2020+view+of+thymus+stromal+cells+in+t+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development.</a> J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).</li>
<li>Park, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+t+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), (2020).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Lischetti, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+thresholding+and+tissue+dissociation+optimization+for+cite-seq+identifies+differential+surface+protein+abundance+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma.</a> Commun Biol. 6 (1), 830(2023).</li>
<li>Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+perivascular+cells+maintain+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells.</a> Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+sources+of+pleiotrophin+control+hematopoietic+stem+cell+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).</li>
<li>Zhou, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes+promote+the+regeneration+of+stem+cells+and+haematopoiesis+by+secreting+scf%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf.</a> Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).</li>
<li>Steinmann, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+human+thymus+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Pathol%22%5BJournal%5D)">Changes in the human thymus during aging.</a> Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).</li>
<li>Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involution+of+the+ageing+human+thymic+epithelium+is+independent+of+puberty.+A+morphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study.</a> Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).</li>
<li>Ambrosi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+accumulation+in+the+bone+marrow+during+obesity+and+aging+impairs+stem+cell-based+hematopoietic+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).</li>
<li>Ho, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+bone+marrow+hematopoietic+stem+cell+niches+promotes+myeloid+cell+expansion+during+premature+or+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).</li>
<li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myeloid+dendritic+cells+and+epithelial+cells+from+human+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus.</a> J Vis Exp. (79), e50951(2013).</li>
<li>Gustafsson, K., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+thymus+stromal+cells+from+human+and+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue.</a> Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).</li>
<li>Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html">Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html</a> (2023).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> J Vis Exp. (110), e53936(2016).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+beta-catenin+mutation+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li>
<li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+niche-specific+expression+of+cxcl12+controls+quiescence+of+treatment-resistant+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).</li>
<li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+aml%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li>
<li>O'flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+rna-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biol. 20 (1), 210(2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biol. 19 (1), 224(2018).</li>
</ol>

DTSは、Agios TherapeuticsおよびEditas Medicinesの取締役および株主です。Magenta TherapeuticsおよびLifeVault Bioの創設者、取締役、株主、科学諮問委員会のメンバー、Fate TherapeuticsおよびGaruda Therapeuticsの株主および創設者、Clear Creek Bioの取締役、創設者、株主、FOG Pharma、Inzen Therapeutics、VCanBioのコンサルタント、および住友ダイアニポンからのスポンサー付き研究資金の受領者。D.T.SとK.Gは特許US20220143099A1の発明者です。

造血器官の間質細胞は正常な血液産生に不可欠であり、造血間質の摂動は造血の維持とストレスに対する応答に深刻な障害をもたらす可能性があります9,23,24。造血間質細胞への洞察は、血液疾患7,9,10,24を理解し、それらに対抗する治療法を開発する能力25,26に不可欠です。しかし、造血間質を実質から再現性よく分離することは、特にシングルセルマルチオミクスの出現により、間質細胞の収量と多様性を最大化しながら高品質のサンプル調製を必要とする課題となっています。ここで説明するプロトコルは、ほとんどのダウンストリームマルチオミクスアプリケーションと互換性を持つように最適化されており、造血間質細胞1,2,19の単離という課題に対応しています。
造血間質細胞の単離で考慮すべき最初の問題は、解離条件です。組織から間質細胞を放出して間質コンパートメント1,2の完全な不均一性を反映するためには、最適な解離が重要です。適切な解離ミックスの選択は、実験範囲とダウンストリームプロトコルによって異なります。解離ミックスはできるだけ新鮮に調製し、使用するまで氷上に保管することをお勧めします。ディスパーゼなど、一部の成分は溶解しにくく、ピペット混合に時間がかかる場合があります。ボルテックスは、消化酵素の本来のコンフォメーションを乱し、最終的に消化酵素の不活性化につながる可能性があるため、推奨されません。重要なことに、EDTAは酵素活性を阻害するため、活発な消化ステップでは避けるべきですが、酵素を含むバッファーを迅速に除去できない場合は、反応を止めるために使用できます。酵素混合物自体に加えて、組織の効率的な解離には、(1)表面積を増やすための徹底的な粉砕と切断、および(2)消化酵素との十分なインキュベーション時間という2つのポイントが重要です。例えば、ヒトの胸腺組織はマウス組織よりも解離が著しく困難であり、したがって消化時間は長くなければなりません。ヒト組織に対して調整を行わないと、間質の収量と細胞の種類が減少します(図2A)。解離酵素は、必然的に遺伝子発現に影響を与える37°Cの最適温度を必要とする27。細胞状態を保存するためには、低温または低温の解離が望ましいが、現在、骨と骨髄に適した市販の低温活性解離酵素の組み合わせはない。消化が必要な組織では、異なる細胞タイプから得られる不均一性と寄与の割合は、消化時間、酵素カクテルの組成、および処理によって常に変化します。これらの最初のステップの下流では、選別中のノズルサイズや困難な細胞タイプ(間質由来の脂肪細胞など)の捕捉、流体デバイスチャネルの直径などのろ過ステップにより、不均一性と表現がさらに制限されます。したがって、データセットを比較する際には、これらのプロトコルの違いが部分母集団の表現に影響を与える可能性があることに注意する必要があります。論理的には、間質系の摂動の影響を測定する際には、処理ステップを等しく保つことに注意する必要があります。
シーケンシングのコストは減少していますが、シングルセルテクノロジーは、解析できる細胞の数によって制限されることがよくあります。各試薬キットの容量を最適化するために、可能な限り造血細胞の磁気破壊が採用されました。これにより、骨髄と胸腺のサンプル画分の両方で間質よりもはるかに多い多数の汚染物質細胞を回避できます。しかし、移植後の胸腺組織の場合のように、出発物質が限られている場合、磁気枯渇戦略が必ず引き起こす細胞の非特異的な損失の増加により、これは望ましくない可能性があります。さらに、組織の調製および消化中に、細胞外マトリックス成分の粉砕、切断、および酵素放出により、大量の破片が生成されます。このタイプの汚染物質は、分析のためにサンプルに残しておくと、下流の処理で目詰まりの問題を引き起こし、シングルセルインデックスのソーティングでウェルが陰性になり、分析で親ゲートの割合が大幅に膨らむ可能性があります。カルセイン染色は、細胞/生細胞に対して陽性をゲートするために使用されました。カルセインにはさまざまな色があり、染色マトリックスに非常に適応性があります。カルセインを取り扱うときは、染料を凍結融解サイクルにさらさないように注意してください(つまり、常に新鮮なものを準備し、溶解後は室温で保管してください)。
DNAオリゴ28 でバーコード化された抗体に基づくサンプルをマルチプレックス化する機能により、10x Genomicsなどのプラットフォームでのシングルセルシーケンシング反応の有用性を高めることができます。サンプルマルチプレックス用に設計されたハッシュタグ付け抗体は、細胞表面分子または核膜およびマウスとヒトの両方で異なるターゲットを備えています。細胞ハッシュタグシステムは複数の組織で成功裏に使用されてきましたが、消化酵素ミックスとその後のハッシュタグの使用を組み合わせた実験では、回復率が大幅に低下する可能性があります。解離後に追加の洗浄ステップを含めることを試み、消化酵素の活性を阻害するためにEDTAを追加しました。ただし、これらの手順を実行しても、造血細胞よりもハッシュタグの同定が少なくなることが予想されます。酵素消化プロトコルでは、ハッシュタグの捕捉率は30%〜70%であることがわかりました。これは、同じ集団の間質細胞の>90%を標識した蛍光色素コンジュゲートを持つ同じ抗体クローンが存在するという事実にもかかわらず発生します。組織の酵素消化とハッシュタグ付けを組み合わせた実験デザインは、試験的に実施し、酵素阻害を確実にするために注意を払う必要があります。

健康な成人では、血液細胞のde novo産生は骨髄と胸腺で起こります。これらの部位にある間質細胞は造血の維持に必須であるが、間質は組織の1,2,3,4の1%未満を構成する。したがって、間質を支える造血の純粋な分離株を得ることは、特に高品質のサンプルを得るために適切な処理を必要とするシングルセルマルチオミクスにとって、大きな課題となります。異なる消化カクテルの成分は、マルチオミクス解析の特定のステップを妨げる可能性があります5,6。ここで紹介するプロトコルは、骨髄および胸腺組織からの多種多様な間質細胞の単離を詳述しています。
骨髄と胸腺の両方における間質成分の摂動は、血球の発達に深刻な混乱をもたらし、悪性腫瘍を引き起こす可能性があります7,8,9。間質を支える造血は、細胞傷害性コンディショニングおよび骨髄移植後に損傷を受け、その結果、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)を維持するサイトカインおよび成長因子の分泌が減少します2,10,11。さらに、老化は骨髄と胸腺間質細胞に影響を及ぼし、老化した造血表現型に寄与する可能性があります。胸腺は、加齢に伴う広範な退縮を経験する最初の臓器です。脂肪と線維性組織は、思春期の発症という早い時期にT細胞支持間質に置き換わり始めます12,13。骨髄では、脂肪細胞含有量は年齢とともに増加し、血管および骨内膜のニッチは大幅に再構築されます14,15,16。
複数のストレス状態にわたる造血支持間質の研究を可能にするため、またヒト組織とマウス組織の両方の胸腺の場合、以前に発表された消化プロトコル 1,2,8,17,18 を最適化しました。これらのプロトコルは、細胞の効率的で再現性のある単離を保証し、シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)やその他のタイプのマルチオミクスと互換性があります。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>7AAD (7-アミノアクチノマイシン D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>643510</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 マウス</td><td>ジャクソン</td><td>664</td><td>男性または女性、8-12生後数週間</td></tr><tr><td>のカルセイン&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>65-0853-78</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>コーニング滅菌細胞ストレーナー、白、メッシュサイズ:70&マイクロ;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ II</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DNA I ソリューション</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>90083</td><td>&nbsp;2500 U/mL</td></tr><tr><td>Easysep マウス ストレプトアビジン RapidSpheres アイソレーション キット</td><td>StemCell Technologies</td><td>19860</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Gibco</td><td>A31605-01</td><td>ワンショット</td></tr><tr><td>ヒト FC ブロック</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>リベラーゼ TM&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>5401127001</td><td>研究グレード</td></tr><tr><td>ミディアム 199</td><td>Gibco</td><td>12350</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD235a-BV77</td><td>BD Biosciences</td><td>740785</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD31-PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>303130</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD45-BV77</td><td>Biolegend</td><td>304050</td><td></td></tr> マウス<tr><td>抗ヒト CD4-BV605</td><td>BDBiosciences</td><td>562658</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD66b-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD8-APC/Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557760</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒト EpCam-BV421</td><td>Biolegend</td><td>324220</td><td></td></tr><tr><td>プロテクター RNase 阻害剤</td><td>ミリポアシグマ</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD105-PE /dazzle594</td><td>バイオレジェンド</td><td>120424</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD11b-ビオチン</td><td>バイオレジェンド</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD140a-APC</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>17-1401-81</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD16/CD32 (マウスBD FC ブロック)</td> <td>BD バイオサイエンス</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD31-BUV737</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>612802</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD31-BV421</td><td>バイオレジェンド</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD3-ビオチン</td><td>バイオレジェンド</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD45.2-ビオチン</td><td>バイオレジェンド</td><td>109804</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD45-PE/Cy7</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>103114</td>ラット抗マウスCD45-PE/Cy7バイオレジェンド103114<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD45-PE/Cy7</td><td>バイオレジェンド</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD45R/B220-ビオチン</td><td>バイオレジェンド</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD51-PE</td><td>バイオレジェン</td><td>ド104106</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス EpCam-BV711</td><td>BDバイオサイエンス563134</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス Ly-6A/E(Sca-1)-AF700</td><td>バイオレジェン</td>ド<td>108142</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-ビオチン</td><td>バイオレジェンド</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスTer119-ビオチン</td><td>バイオレジェンド</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスTer119-PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>116208</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスTer119-PE/Cy7</td><td>バイオレジェンド</td><td>116222</td><td></td></tr><tr><td>ステムキシム&nbsp;</td><td>ワージントン生化学</td><td>LS004107</td><td></td></tr></tbody></table>

造血器官からの間質細胞の単離

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

シングルセルシーケンシングにより、造血器官の間質における不均一な細胞集団のマッピングが可能になりました。これらの方法論は、定常状態でのこれまで未解決の不均一性、および外因性ストレスまたは老化中に誘発される細胞タイプの表現の変化を研究するためのレンズを提供します。ここでは、マウスとヒトの胸腺、およびマウスの骨と骨髄から高品質の間質細胞集団を単離するための段階的なプロトコルを紹介します。これらのプロトコルで単離された細胞は、高品質のシングルセルマルチオミクスデータセットの生成に適しています。ここでは、サンプル消化、造血系数の枯渇、FACS解析/ソーティングの影響、およびこれらの要因がシングルセルシーケンシングとの適合性にどのように影響するかについて説明します。シーケンシング後の解析における解離の成功と非効率性、および下流の間質細胞収量を示すFACSプロファイルの例を用いて、ユーザーにとって認識可能なポインタを提供します。間質細胞の特定の要件を考慮することは、この分野の知識を進歩させる高品質で再現性のある結果を得るために重要です。

これらのプロトコルは、フローサイトメトリー解析に適した胸腺および骨髄からの再現性のある間質細胞の変種、およびscRNAシーケンシングなどのシングルセルマルチオミクスをもたらします。マウスの胸腺組織は、骨髄移植に先行する細胞傷害性条件付けや自然な老化プロセスなどのストレッサーに応答して、大幅なリモデリングを受けます。その結果、胸腺細胞性はこれらの両方の環境で大幅に減少します(図1A)。8週齢の野生型マウスの胸腺には約1億個の細胞が含まれていますが、2歳マウスの細胞性はその半分であると予想でき、放射線照射と骨髄移植の4日後の胸腺は5,00,000個の細胞まで低くなる可能性があります(図1A)。
細胞傷害性コンディショニングは造血細胞を優先的に切除するため、間質コンパートメントは比例して濃縮されます(図1B)。しかし、全体的に細胞性が低いため、十分な数の胸腺間質細胞を単離することが困難になります。したがって、ダウンストリームのマルチオミクスアプリケーションに適合した細胞数を得るために動物をプールし、可能な限り材料の損失を最小限に抑える必要があるかもしれません。胸腺間質細胞でマルチオミクスを行うには、CD45-Ter119-細胞(図1C)の単一細胞(図1C)の蛍光活性化セルソーティング(FACS)により、ほとんどのストレス条件から十分な数の細胞をソーティングできます。
間質コンパートメントの不均一性を維持するために、通常、単一の陽性間質マーカーで選別するのではなく、造血細胞をゲートアウトします。ポジティブ間質細胞マーカーを含めることは、適切な組織解離が達成されたことを確認するための分析に引き続き推奨されます。しかし、FACS単離は不完全であり、scRNAseqによって決定されるように、選別された細胞の30%〜50%が造血起源のものとなる(図1D、E)。これは、FACSの前にCD45+細胞を磁気的に枯渇させることで改善できます。ただし、胸腺の細胞性が低下している条件(図1A)では、磁気の枯渇に伴う余分な処理に伴う材料の損失により、間質の収量が下流のアプリケーションに対して低すぎるため、これは推奨されません。
ヒト胸腺間質の単離にとって、最も重要なステップは酵素消化です。解離ステップを急ぐと、間質細胞の全体的な収量と間質細胞のサブタイプの表現が大幅に減少します(図2A)。また、造血マーカーを単にゲーティングネガティブにするだけでは実際の間質細胞の放出を測定するのに十分ではないため、組織の消化が最適であることを確認するために、胸腺内皮と上皮のマーカーを常に含めることをお勧めします。これは 図2Aに例示されており、造血マーカーが陰性の細胞の割合は、90分間インキュベートしたサンプルと比較して、30分間消化したサンプルの方が高くなっています。しかし、連続ゲートに見られるように、内皮細胞および上皮細胞の収量は、短い消化プロトコルでは非常に劣ります(図2A)。
マルチオミクスアプリケーションのためのヒト胸腺間質細胞のFACS単離では、汎造血マーカーCD45および赤血球マーカーCD235a(図2B)に加えて、造血系系抗体カクテル、ならびにCD4およびCD8抗体による染色が提案され、間質細胞の濃縮を改善することが提案されます。したがって、胸腺間質のヒトマルチオミクス解析では、生細胞、単一細胞、CD45-CD235a-系統-CD4-CD8-細胞をFACSで選別する必要があります(図2B)。マウスサンプルのscRNAseqで見られるように、これは依然として30%〜50%の造血細胞の汚染をもたらしますが、それでもヒト胸腺間質コンパートメントの許容可能な分解能が得られます(図2C、D)。
骨間質とBM間質については、胸腺組織と同じ戦略が使用されました。間質細胞は、造血マーカーが陰性の細胞にゲーティングすることにより単離され、さらに間質細胞マーカーが消化コントロールとして含まれます(図3)。骨のような石灰化した組織が解離すると、破片が大量に蓄積します。生存率色素としてカルセインを添加すると、この破片のほとんどを排除できるようになり、そうしないと、選別された数が誤って膨らみ、ゲートされた集団の頻度が減少します(図3)。これは、すべての細胞でのゲーティングとCalcein+でのゲーティングのみを比較したFACSプロットに例示されています(図3)。ヒト胸腺間質細胞に見られるように、造血マーカー陰性細胞の割合は、骨およびBM組織の解離効率の信頼できる測定値ではありません(図3)。CD45-Ter119-ゲートは、消化ステップが失敗したサンプルに大量の細胞を含むことができますが、典型的な骨およびBM間質細胞マーカーCD31、CD140a、およびCD51のさらなる分析では、間質の放出が不十分であることが明確に示されています(図3 および 図4)。
マウス骨およびBM間質細胞のFACS単離には、 図3のようにゲーティング戦略を使用することが提案されており、CD45-Ter119-Calcein+のみを選別しますが、選別された集団の前方および側方散乱特性および間質細胞マーカーの発現をモニターして、最適な消化を確保します(図3A)。FACSに先立つ骨髄の造血系系陽性磁気細胞の枯渇と、示されたゲートでのソーティングの組み合わせにより、間質が&gt;90%の細胞のシングルセルシーケンシングが可能となります。このようなscRNA配列ランの例(図5A、B)は、分析された細胞のトランスクリプトームベースのアノテーション後のこの低い造血コンタミネーションを示しています(造血マーカー遺伝子の例図 5C)。これは、移植後の胸腺組織の出発物質が限られているために、選別ステップの前に磁気細胞の枯渇が行われなかった胸腺間質製剤とはまったく対照的です(図1F)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig01.jpg"> 図1:マウス胸腺間質のフローサイトメトリーおよびシングルセルRNAシーケンシング解析 (A)8週齢マウス(対照)、4日前に致死放射線を照射して移植した8週齢マウス(移植)、および2歳マウス(老化)の胸腺細胞数の定量化。(B)致死的照射および移植の4日後における間質細胞サブタイプの濃縮を示す代表的なフローサイトメトリープロット。(C)シングルセルマルチオミクス解析のためのマウス胸腺間質を選別するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。(D)間質を示すマウス胸腺のUMAP(青)と造血細胞(赤)。(E)胸腺サンプル中のマウス造血マーカー遺伝子を示すUMAP。(F)胸腺scRNAseqサンプル中のマウス間質細胞および造血細胞の定量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig02.jpg"> 図2:ヒト胸腺間質のフローサイトメトリーおよびシングルセルRNAシーケンシング解析。 (A)ヒト胸腺間質細胞集団の放出に対する異なる消化時間の影響の代表的な結果を示すFACSプロット。(B)シングルセルマルチオミクス解析のためのヒト胸腺間質を選別するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。(C)間質を示すヒト胸腺のUMAP(青)と造血細胞(赤)。(D)胸腺サンプル中のヒト造血マーカー遺伝子を示すUMAP。(E)胸腺scRNAseqサンプル中のヒト間質細胞および造血細胞の定量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig03.jpg"> 図3:マウス骨髄間質マーカーとカルセインは、解離効率を推定するのに役立ちます。(A)すべての細胞とカルセイン+細胞にゲートしたCD45-Ter119-マウス骨髄間質細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。その後のCD31-ゲーティングでは、Calcein+細胞を選択する際にCD140a+CD51+細胞の割合が高いことが示されています。(B)CD140a + CD51 +細胞が欠落している骨消化の失敗を代表するフローサイトメトリー分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig04.jpg"> 図4:骨髄間質ゲーティング戦略 (A)シングルセルマルチオミクス用のマウス骨髄間質を選別するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。(B)CD140a + CD51 +細胞が欠落している骨髄消化の失敗を代表するフローサイトメトリー分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig05.jpg"> 図5:間質細胞および造血細胞組成による骨髄シングルセルRNAシーケンシング(A)間質を示すマウスの骨および骨髄のUMAP(青)および造血細胞(赤)。(B)マウスの骨および骨髄サンプルにおける間質細胞および造血細胞の定量化。(C)マウス骨髄サンプル中の造血マーカー遺伝子のUMAP。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、マウスの骨、骨髄、胸腺、およびヒト胸腺組織から間質細胞を単離することを可能にするプロトコルを紹介します。

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

骨髄および胸腺における血液細胞の発達は、支持のために間質細胞に大きく依存しています。造血間質細胞機能の摂動は、非効率的または悪性の血液産生につながる可能性があります。私たちの研究室では、造血の間質細胞の制御と、それを治療効果のためにどのように操作できるかを理解することに焦点を当てています。シングルセルシーケンシングの出現は、多くの研究分野で近年の進歩の連鎖を牽引しています。これは、シングルセルの分解能により、これまで知られていなかった造血器官の不均一な間質細胞集団の同定を可能にした私たちの分野でも同様です。私たちのプロトコルはこれに対処するために最適化されており、この分野での重要な問題に取り組むための間質細胞に関するより多くの研究を可能にすることを願っています。

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