Name: バイオバンキングと水産養殖をサポートするためのサンゴ精子の凍結保存のための半自動ワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 学ぶサンゴ精子の半自動凍結保存ワークフロー。Makler計数槽を用いた精子評価と、限られた産卵期間中の効率的なバイオバンキング手法を解説します。遺伝的多様性保全とサンゴ礁修復に貢献するスケーラブルな方法です。

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<meta charset="utf8"></head><body>絶滅危惧種のサンゴからのサンゴ精子凍結保存の最適化

<ol><li>Eakin, C. M., Sweatman, H. P. A., Brainard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2014-2017+global-scale+coral+bleaching+event%3A+Insights+and+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">The 2014-2017 global-scale coral bleaching event: Insights and impacts.</a> Coral Reefs. 38 (4), 539-545 (2019).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Ovation ALI-Q 2 VS ピペットコントローラー - 分注ピペット</td><td>Vistalab</td><td>2100-1005</td><td>流体の取り扱い &ndash; 精子量の測定、凍結保護液の添加、クライオバイアルへのサンプルの分注</td></tr><tr><td>5 mL 血清ピペット (バルク)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Nunc 170355</td><td>流体処理 &ndash; 精子量の測定、凍結保護液の添加、凍結バイアルへのサンプルの分注</td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット (バルク)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nunc&nbsp; 170356</td><td>流体処理 &ndash; 精子量の測定、凍結保護液の添加、クライオバイアルへのサンプルの分注</td></tr><tr><td>P2 0.2&ndash;2 &マイクロ;Lピペッター</td><td>ギルソンF144054M</td><td></td><td>集中力と運動評価のための精子活性化溶液と精子サンプルの取り扱い</td></tr>の準備<tr><td>P10 1&ndash;10 &micro;Lピペッター</td><td>ギルソン</td><td>F144055M</td><td>精子活性化溶液の調製と集中力と運動評価のための精子サンプルの取り扱い</td></tr><tr><td>P20 2&ndash;20 &micro;Lピペッター</td><td>ギルソン</td><td>&nbsp;F144056M</td><td>集中力と運動評価のための精子活性化溶液と精子サンプルの取り扱い</td></tr>の準備 <tr><td>P200 20&ndash;200 &micro;Lピペッター</td><td>ギルソン</td><td>F144058M</td><td>精子活性化溶液の調製と集中力と運動評価のための精子サンプルの取り扱い</td></tr><tr><td>P1000 100&ndash;1000 &マイクロ;Lピペッター</td><td>ギルソン</td><td>F144059M</td><td>精子活性化溶液の調製と、濃度および運動評価のための精子サンプルの取り扱い</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>ミリポア</td><td>WP6122050</td><td>溶液調製のためのろ過海水の調製</td></tr><tr><td>再利用可能なボトルトップろ過システム</td><td>Thermo Scientific</td><td>DS0320-5045</td><td>溶液調製</td></tr><tr><td>のためのろ過海水の調製0.22-&マイクロ;mフィルターディスク、混合セルロースエステル&nbsp;</td><td>メルクミリポア</td><td>GSWP04700</td><td>溶液調製のためのろ過された海水の調製</td></tr><tr><td>ろ過された海水</td><td>N/A</td><td>&ndash;</td><td>精子活性化および凍結保護溶液のベース培地</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>精子凍結保存のためにろ過された海水中の最終濃度10% v/vで使用される凍結保護剤</td></tr><tr><td>カフェイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750</td><td>精子の運動性を活性化するために使用されます</td></tr><tr><td>BSA熱ショック画分</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>CASAウェルスライド15mLチューブへの精子の付着を最小限に抑えるために使用されます</td></tr><tr><td></td><td>科学的</td><td>339651</td><td>精子活性化溶液の調製</td></tr><tr><td>50mLチューブラック</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>配偶子束およびろ過された精子サンプルの収集用</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>Thermo Scientific</td><td>Samco 202PK</td><td>水面からの配偶子束の収集を支援するため</td></tr><tr><td>100-&micro;m フィルターバスケット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22363549</td><td>精子サンプルの分離中に卵子を除外するには</td></tr><tr><td>エッペンドルフラック</td><td>インターパス</td><td>511029</td><td>濃縮と運動評価のための精子の希釈と活性化</td></tr><tr><td>エッペンドルフ 1.5mLチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30120086</td><td>濃縮と運動評価のための精子の希釈と活性化</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ 18x18 mm</td><td>ブランド</td><td>4700 45</td><td>位相顕微鏡を用いた精子の濃度と運動性の評価</td></tr><tr><td>プレーンガラススライド、洗浄済み、75x25 mm</td><td>コーニング</td><td>2947</td><td>位相顕微鏡を用いた精子の濃度と運動性の評価</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td>位相顕微鏡を用いた精子の濃度と運動性の評価</td></tr><tr><td>CASAスライド (Leja 20-&micro;m 4 chamber, SC-20-01-04-B)</td><td>IMV Technologies</td><td>025107</td><td>Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)</td></tr><tr><td>Makler sperm counting chamber (CASA)</td><td>IVFStore</td><td>SM-373</td><td>Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)</td></tr><tr><td>accu-bead&reg; counting beads</td><td>Hamilton-Thorne</td><td>710111</td><td>Computer Assisted Sperm Analysis(CASA)を使用した精子の濃度と運動性の評価CASA</td></tr><tr><td>システム+ラップトップ</td><td>Hamilton Thorne</td><td>Ceros II</td>は<td>、Computer Assisted Sperm Analysis(CASA)を使用した精子の濃度と運動性の評価です。</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>DMSOおよび液体窒素を取り扱うときに使用するための個人用保護具</td></tr><tr><td>白衣 長</td><td>袖、全長</td><td>&ndash;</td><td>DMSOおよび液体窒素を取り扱う際に使用する個人用保護具</td></tr><tr><td>クライオグローブ(ペア)</td><td>Tempshield</td><td>Mid-Arm</td><td>DMSOおよび液体窒素を取り扱う際に使用する個人用保護具</td></tr><tr><td>中型鉗子</td><td>汎用</td><td>&ndash;</td><td>凍結保存されたサンプルをクライオラックから取り出し、液体窒素中のサンプルを操作するため</td></tr><tr><td>バーコードスキャナー(2D対応)</td><td>Zebra</td><td>DS2278</td><td>サンプル管理用のクライオバイアル上の1Dおよび2Dバーコードの読み取り用</td></tr><tr><td>2.0 mL CryoStorage Vial、外部スレッド、キャップ済み、2D SafeCode(DataMatrix/ECC200)、線形および人間が読める</td><td>Eppendorf</td><td>30079434</td><td>精子サンプルの凍結保存のためのバーコード付きクライオバイアル</td></tr><tr><td></td><td>Simport</td><td>T315</td><td>凍結バイアルを保持するラック、ロックベース付き、片手でデキャッピング</td></tr>、<tr><td>キャッピング 冷凍ラック</td><td>カスタム</td><td>&ndash;</td><td>サンゴの精子用にカスタム設計された凍結保存システムで、3Dプリントされたすぐに入手できるコンポーネントを利用しています。部品リストと組み立て説明書は、Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)</td></tr><tr><td>Freezing rack lid</td><td>Custom</td><td>&ndash;</td><td>サンゴの精子用にカスタム設計された凍結保存システムで、3Dプリントされたすぐに入手できるコンポーネントを利用しています。部品リストと組み立て説明書は、Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)</td></tr><tr><td>Freezing Thermos &ndash; 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container</td><td>Isosteel</td><td>&nbsp;VA-9683&nbsp;</td><td>サンゴの精子用にカスタム設計された凍結保存システムで、3Dプリントされたすぐに入手できるコンポーネントを利用しています。部品リストと組み立て説明書は、Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)</td></tr><tr><td>Lab timers</td><td>Generic</td><td>&ndash;</td><td>凍結保存前の凍結保護剤の平衡化のタイミングに</td></tr><tr><td>窒素浴 9L</td><td>BelArt</td><td>M16807-9104</td><td>凍結保存中にサンプルを急冷し、選別および取り扱い中にサンプルを保持するため</td></tr><tr><td>熱電対データロガー-マルチチャンネル</td><td>オメガ</td><td>HH520</td><td>凍結速度とエンドポイントを決定するための凍結保存中の温度監視</td></tr><tr><td>熱電対プローブ &ndash;タイプK</td><td>オメガ</td><td>5SC-TT-K-30-36</td><td>凍結速度と終点を決定するための凍結保存中の温度監視</td></tr><tr><td>クライオペン/カラーパーマネントペン</td><td>ステッドラー ルモ</td><td>カラー318</td><td>サンプル管理を支援するためにクライオバイアルの蓋をマーキングするためのオプション</td></tr><tr><td>ドライシッパー-充電された</td><td>テイラーウォートン</td><td>CXR100、またはCX500</td><td>凍結保存されたサンプルをフィールド/収集サイトからバイオレポジトリに移すため貯蔵</td></tr></tbody></table>

バイオバンキングと水産養殖をサポートするためのサンゴ精子の凍結保存のための半自動ワークフロー

A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture

このプロトコルで概説されている手順は、Hagedornら4 によって記述されたサンゴ精子凍結保存の元の方法と、その後のZuchowiczら6による改良に基づいており、凍結保存とバイオバンキングのための精子処理の効率を高めるための主要な改善を提供します。バーコード付きのクライオバイアルと分注オートピペッターを使用すると、クライオバイアルの印刷や手作業によるラベル付けが不要になり、精子の包装手順が簡素化され、大量のサンプルをハンドピペッティングする負担が軽減されます。重要なことに、これらの改善により、凍結保存のためのサンプル調製に必要な時間も約8〜10分から5分未満に短縮されます。CASAの使用と合わせて、これらの改善により、サンゴの精子の効率的なバイオバンクに必要な人員の数が、元の方法では4人から6人になり、現在のプロトコルでは2人にまで減少します。さらに、バーコード付きのクライオバイアルを使用すると、各チューブが一意の識別子を持つため、バッチ印刷されたラベルを使用して以前の方法よりも高い解像度でデータベース内で各チューブを追跡できます。
2022年にオーストラリアで開催されたグレートバリアリーフの産卵期に行われた2つの産卵イベントにわたるプロトコルのフィールドテストにより、2人のオペレーター(CASAに1人、凍結保存に1人)が5種、57のコロニーから389のサンプルを凍結保存とバイオバンク化し、必要に応じてさらに1人が束の分解と精子の分離を支援することができました。2022年11月にオーストラリアのクイーンズランド州コノミー(ノースケッペル島)で行われた産卵イベントでは、24のコロニーから採取した アクロポラ・ミレポラ の150サンプルを2人のオペレーターが2時間かけて凍結保存しました。このような多数のサンゴコロニーから採取されたこの量のサンプルを効率的に処理し、凍結保存できたのは、主にサンプル調製時間の効率化とワークステーション間でのメタデータの転送の簡素化によるものです。
2023年12月の産卵時のワークフローをさらにテストしたところ、サンゴの精子については、CASAシステムで一般的に使用される市販の固定カバースリップシングルユースチャンバースライドと比較して、Makler計数チャンバーがより正確な運動性と濃度のデータを提供することがわかりました。Makler計数チャンバーは、市販のラテックスマイクロビーズを使用して、既知の濃度で4μLのサンプル容量とサンゴの精子に使用された標準のCASA設定17 を使用してCASAについて検証されました。これらの分析では、メーカーが提供した予想濃度範囲(46.0 ±± 700万mL)内に収まる、ばらつきの少ない(44.5 700万/mL)一貫したカウントが示されました(図 2)。Makler 計数チャンバーと固定カバースリップチャンバースライドを使用して収集された Acropora millepora の CASA データの比較では、2 つのチャンバータイプ間で精子濃度カウントに有意差があることがわかりました (P = 0.002; 図2)、固定カバースリップチャンバースライドは、Makler計数チャンバーを使用して決定された濃度の半分未満を記録します。この傾向は、他の2つのサンゴ種の精子サンプルでも観察されました(データは示されていません)。また、2023年12月の試験では、1:1希釈で20%DMSOまたは1:2希釈(精子:クライオ希釈液)で30%DMSOを使用して凍結保存されたサンプルでは、融解後の総精子、運動性精子、または進行性精子の融解後濃度に有意差は見られませんでした(図3)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66233/66233fig01.jpg"> 図1:凍結保存のためのサンゴ精子の半自動処理に使用されたワークフローと、野外で使用された移動機器の例(A)サンゴ配偶子束は、FSWの5mLに対して5mLの束の割合で収集され、卵子と精子を分離するために分割されます(i)。コロニーのメタデータは自動データシートに入力され(ii)、分離された精子サンプルはコンピューター支援精子分析(CASA)(iii)を使用して評価されます。精子の品質パラメータを自動データシートに追加して、FSWに20%または30%のDMSOを添加するかを計算し(iv)、希釈したサンプルをバーコード付きのクライオバイアル(v)に分注します。クライオバイアルはクライオラックにロードされ、自動データシート(vi)にスキャンされ、-20°C/分から-80°C(vii)の速度で冷却されます。その後、サンプルは液体窒素で急冷され、乾燥荷送人に移送されてTaronga CryoDiversity Bank(viii)に輸送されます。(B)近江環境教育センターの教室内の遠隔地に設置されたCASA(左)と凍結保存ステーション(右)の例。(C)オーストラリア海洋科学研究所の国立海シミュレータで複数のクライオラックを実行するために設置された実験室ベースの大容量凍結保存ステーションの例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/66233fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66233/66233fig02.jpg"> 図2:サンゴの精子濃度を測定するための2つの異なるチャンバースライドオプションの比較 (A)Maklerカウンティングチャンバーと市販の固定カバースリップチャンバースライドを使用した Acropora millepora (n = 3個体)の総精子濃度測定値の比較。列は平均±SEMを示しています。アスタリスクは有意差を示します(P = 0.002)。(B)既知の濃度で市販のラテックスマイクロビーズを使用したMakler計数チャンバーと、サンゴ精子の標準CASA設定の検証。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/66233fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66233/66233fig03.jpg"> 図3:凍結保存されたサンプル中の総精子、運動性精子、または進行性運動精子の融解後の濃度。 FSWで20%または30%のDMSOを使用して、凍結保存のための最終的な10%のDMSO濃度を達成するための、総、運動性、および進行的に運動する精子の濃度の融解後の比較。n = 3個体からのサンプルをそれぞれ2つのアリコートに分割し、1つのアリコートを20%DMSOを1:1添加して凍結保存し、2番目のアリコートを&lt;2×109/mLに希釈してFSWを使用して凍結保存し、30%DMSOを1:2添加(精子:凍結希釈液)しました。列は平均±SEMを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/66233fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:コーラルバイオバンキング自動データシートファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/Coral%20biobanking%20auto%20datasheets_TEMPLATE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Coral reefs are facing a crisis as the frequency of bleaching events caused by ocean warming increases, resulting in the death of corals on reefs around ...

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

これは、ゼブラフィッシュのためのハイスループット精子の凍結保存プロトコルです。精子は、このプロトコルを使用すると、その後の体外受精で25％の肥沃度の平均値を持ち、長年にわたって安定な凍結保存。...

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I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復

修正されたMicroSecureガラス化：人間の胚盤胞のための、安全なシンプルで非常に効果的な凍結保存手順

ここでは、イルカの精子コレクション、凍結、卵子を使用して異種の体外受精パフォーマンスに正常に使用されているプロトコルを提案する.

バンドウイルカ イルカ (バンドウイルカ) 精子: 異種には体外受精、凍結保存、コレクション

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この議定書は、精子のコンピューター支援型分析を使用して、デバイスを冷却魚精子評価の手順を説明します。ソフトウェアは、迅速、正確なと養殖業の再生の成功を改善するために便利なツールをすることができます、精子運動に基づく魚の精子の質の定量分析を与えます。...

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ヨーロッパのウナギの成熟と精子の凍結保存のためのプロトコルは、最後の年にわたって改善されています。この資料では、成熟と保護剤の検討としてメタノールを誘発するひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG)...

処理と治療の男性欧州ウナギ (アンギラ) ホルモンの成熟、精子凍結保存

サンゴは、人間と海洋生物の両方にとって重要な生物多様性生態系を作り出します。しかし、多くのサンゴ細胞の可能性と機能をまだ理解していません。ここでは、石のサンゴ細胞集団の単離、標識、分離のために開発されたプロトコルを紹介する。...

スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別

このプロトコルでは、サンゴのホロビオントの生理学的特徴を調査するために使用できるマイクロスピロメトリーシステムのセットアップと実行について説明します。...

新しいマイクロスピロメトリーツールを用いたサンゴホロビオントの生理学的特性評価

ここでは、ガスクロマトグラフィー質量分析のために、サンゴのホロビオントからの極性および半極性代謝産物の抽出と調製、ならびに分離されたサンゴの宿主組織とSymbiodiniaceae細胞分画を紹介します。...

ガスクロマトグラフィー-質量分析に基づくハードコーラル試料のターゲットメタボロミクス

学ぶサンゴ精子の半自動凍結保存ワークフロー。Makler計数槽を用いた精子評価と、限られた産卵期間中の効率的なバイオバンキング手法を解説します。遺伝的多様性保全とサンゴ礁修復に貢献するスケーラブルな方法です。

バイオバンキングと水産養殖をサポートするためのサンゴ精子の凍結保存のための半自動ワークフロー

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