初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。

ミュラー細胞は網膜の主要なグリア細胞です。それらは、網膜の代謝活性の高いニューロンを維持するために非常に重要な役割を果たします。私たちの研究室は、マウスの目からミュラー細胞を単離する技術を確立しました。この技術により、さまざまな網膜疾患におけるミュラー細胞の役割を研究し、疾患の病因を理解し、治療標的の開発が可能になります。

[ナレーター]あなたの機関が承認した方法に従って、マウスを倫理的に安楽死させてください。眼球突出を誘発するために眼窩領域を5/45スタイルのピンセットを押して眼を摘出し、続いてピンセットの腕を眼の後部に配置して眼を摘出し、続いて眼眶領域からそっと引っ張ります。目を10mLのミュラー細胞眼液に入れ、一晩、または室温で約18時間放置します。18時間後、廃棄するチューブから注いでアイ溶液をデカントします。温めたリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで目を洗います。PBSを廃棄するチューブから注ぎ、PBSを再度デカントします。次に、10 mLのトリプシン溶液を含む100ミリメートルのペトリ皿に目を置きます。皿をインキュベーターに入れ、摂氏37度、CO2%5%で1.5〜2時間インキュベートします。インキュベート後、約5mLの完全な初代ミュラー細胞増殖培地を含む60ミリメートルのペトリ皿に眼を移します。視認性と明確なデモンストレーションのために、ビデオがボンネットの外側で録画されたことは注目に値します。実際の実験では、図のように層流フードで実施する必要があります。眼を解剖顕微鏡下に置き、解剖を開始します。M5Sスタイルのピンセットとヴァンナスハサミを使用して、結合組織、外眼筋、視神経を除去します。ここでは、視神経をヴァンナはさみで切断します。M5Sスタイルのピンセットで目をつかみ、バナスハサミまたは注射器の針で鋸歯部を切開します。2本のM5Sスタイルのピンセットで切開部をつかみ、目の後部から角膜を引っ張ったり引き裂いたりし始めます。網膜の完全性が損なわれないように、少しずつ引っ張ります。ここでは、アイカップの後部から角膜を取り除く方法のデモンストレーションを示します。水晶体と神経網膜が露出したら、虹彩が付着している可能性が高い目の色素沈着層を取り除きます。次に、レンズから神経網膜を取り除きます。神経網膜から色素沈着組織を除去して、分離の純度を高めます。神経網膜の粘着性を考えると、色素沈着組織をすべて除去する可能性は低いでしょう。すべての神経網膜を集めて、それらを細かく引き裂きます。4 mLの完全な初代ミュラー細胞増殖培地を含むT25フラスコに神経網膜をプレートします。最後に、フラスコをインキュベーターに入れ、摂氏37度、CO2 5%でインキュベートします。パネルAは、継代0と継代1での健康なミュラー細胞培養を示しています。色素の欠如は、単離における主要な汚染物質であるRPE細胞が存在しないことを示しています。これは、RP 特異的マーカーである RP65 を使用してパネル B で強化されています。