Name: B型肝炎ウイルスDNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に基づく検出と定量(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: 学ぶリアルタイムPCRによるB型肝炎ウイルスDNAの検出と定量法。高感度・高特異性のゴールドスタンダード技術で、臨床診断とウイルス量モニタリングに有用です。

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技術支援をしてくれたPraveen氏、Kusum氏、Chandan氏、Isha氏、Rashmi氏、Babli氏、Shivani氏、Ankita氏、Shikha氏に感謝の意を表します。

この研究には、ヒトの参加者や臨床サンプルは含まれていませんでした。使用された唯一の生物学的材料は、核酸検査用のHBV DNAに関する第4回 WHO国際基準(NIBSCコード10/266)でした。この規格は、個人情報や識別可能なデータを含まない、一般に入手可能な参考資料です。そのため、この研究には倫理的な承認は必要ありませんでした。
1. DNA抽出
<ol><li>ヒト血清または血漿サンプルからウイルスDNAを抽出します。抽出したDNAは、PCRでさらに使用するまで-20°Cで保存してください。 注:DNA抽出用の血清または血漿の推奨容量は500 μLで、溶出量は50 μLです。本研究では、ウイルス核酸抽出キット(材料表)を用いてウイルスDNAを抽出した。</li>
</ol>2. リアルタイムPCR
<ol><li>PCRを開始する前に、リアルタイムPCRキットのすべての試薬(表1)を室温(室温;15〜25°C)で解凍します。解凍したら、適度な速度で10秒間パルスボルテックスして成分を混合し、室温で8,000 × g で15秒間遠心分離します。</li>
	<li>反応調製<ol><li>表2に従ってPCRミックスを調製する。添加する試薬の量は、サンプル数、標準試料、テンプレートコントロールなしに基づいて計算します。 注:PCRミックスを調製する際には、各試薬の少なくとも10%の容量を追加する必要があります(例えば、10回の反応が必要な場合は、11回の反応について計算します)。</li>
		<li>上記で調製したPCRミックス15μLを各PCRチューブにピペットでつなぎます。次に、抽出したサンプルDNAを15μL添加します。HBV DNAを検出するためのポジティブコントロール(PC)としてHBV用標準試料(HBV標準試料1-5)の少なくとも1つを15 μL、ネガティブコントロール(NC)としてPCRグレードのヌクレアーゼフリー水15 μLを加えます。HBV DNA の定量に必要な検量線を作成するには、キットに付属の 5 種類の定量標準試料(HBV 標準試料 1-5)をすべて PCR ランごとに使用します。</li>
		<li>チューブを閉じ、中程度の速度で10秒間パルスボルテックスして成分を混合し、室温で8,000 × g で15秒間遠心分離してから、サーマルサイクラーに進みます。反応液中に気泡が入っていないことを確認してください(気泡は蛍光検出に干渉する可能性があるため)。</li>
	</ol></li>
	<li>プログラムのセットアップ<ol><li>サーマルサイクラーは、 表3で推奨されているサイクル条件を使用してプログラムします。</li>
	</ol></li>
	<li>チャンネル/蛍光色素の選択<ol><li>表 4 に示すように、一般的に使用されるリアルタイム PCR プラットホーム用の蛍光色素を選択してください。</li>
	</ol></li>
	<li>データ解析<ol><li>実行が完了したら、線形スケールで増幅プロットを解析します。</li>
		<li>閾値設定<ol><li>PCR反応の指数関数的相内の閾値を設定します。キットの推奨閾値を 表5に示します。しきい値の設定と一致します。アッセイに最適な閾値が決定されたら、特定のPCRマシンのすべてのサンプルに一貫して使用してください。これにより、結果が正確で再現性のあるものになります。 注意: しきい値の設定が低すぎると、信号がノイズレベルを下回る可能性があり、Ct値は信頼できません。閾値の設定が高すぎると、シグナルが反応のプラトー相にあり、増幅効率が悪く、Ct値が不正確になる可能性があります。</li>
		</ol></li>
		<li>期限<ol><li>キットを40回の増幅サイクルで実行します。38サイクルを超える増幅は考慮しないでください。</li>
		</ol></li>
		<li>定性的な結果分析<ol><li>HBV DNAの定性検出にキットをご使用ください。標準 2 を PC として使用し、HBV では 20 ± 2、IC では 24 ± 3 の期待値を使用します。</li>
			<li>テンプレートコントロール(NTC)がHBVと内部コントロール(IC)の両方のターゲットで増幅を示さないことを確認します。NTC反応で増幅反応が起こると、試料のコンタミネーションが起きている可能性があります。</li>
			<li>アッセイのカットオフは 38 であるため、HBV 陽性サンプルとしての HBV ターゲットの 38 Ct より前の増幅を検討してください。すべてのコントロールが上記の要件を満たしている場合は、 表 6 に記載されている解釈に従って標本を検討してください。</li>
		</ol></li>
		<li>定量的な結果分析<ol><li>核酸増幅技術(NAT)20 の HBV DNA に関する 4 番目の WHO 国際標準に照らして較正された、HBV 特異的 DNA の既知の濃度の 5 つの定量標準試料のセットを使用します(表 7)。</li>
			<li>これらの標準を使用して、検量線を生成します。検量線を利用して、未知サンプルのHBV DNAを定量します。 注:リアルタイム PCR ソフトウェアは、5 つの標準試料すべての HBV ターゲットについて得られた Ct 値と、それに対応する国際単位/マイクロリットル(IU/μL)での濃度を使用して、検量線を生成します。</li>
			<li>標準試料の傾きが -3.1 から -3.6 の間にあり、R2 値が 0.99 から 1.0 の間にあり、PCR 効率が 90%-110%(0.9-1.1)の間にあり、ネガティブコントロールに増幅がない場合にのみ、未知のサンプルの値を解釈します。</li>
			<li>ソフトウェアは、各HBV陽性サンプルの濃度をマイクロリットルあたりの国際単位(IU / μL)で計算します。ウイルス量(IU/μLから国際単位/ミリリットル[IU/mL]への変換)を計算するには、次の式を使用します。 結果(IU/mL) = (結果 [IU/μL] x 溶出量 [μL])/サンプル量(mL) 注:HBV DNAに関するWHO国際標準第4回NIBSCコード10/266は、0.5 mLの血漿からウイルスDNA精製用に抽出し、精製したウイルスDNAを50 μLの溶出バッファーに溶出し、5つのHBV標準およびNTCとともにPCRキットとともに参照サンプルとして使用しました。参照サンプル(NIBSC コード 10/266)の HBV ウイルス量は、(6659 IU/μL x 50 μL)/0.5 mL = 6,65,900 IU/mL として計算されました。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

ヒト血清中のB型肝炎ウイルスDNAの検出と定量

<ol><li>Ryu, W. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRyu%2C+W-S+%22Molecular+Virology+of+Human+Pathogenic+Viruses%22">Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses</a>. , Elsevier, Academic Press. (2016).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hepatitis+b+virus+infection+in+the+Asia-Pacific+region+and+Africa%3A+Review+of+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).</li>
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<li>Guvenir, M., Arikan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus%3A+From+diagnosis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Polish+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment.</a> Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).</li>
</ol>

著者らは、この研究で使用されたHBVウイルス量キットの製造元であるKilpest India Limitedと関係があります。

NIBSC コード 10/266 には、サプライヤー情報21 に従って 9,55,000 mL のヌクレアーゼフリー水に再構成した場合、0.5 IU/mL の単位が割り当てられています。これは、高負荷のHBV陽性サンプルと見なすことができます。この研究で使用したウイルス量キットで測定したHBVウイルス量は6,65,900 IU/mLでした(図4)。DNA抽出キットのDNA抽出効率は100%ではないため、精製プロセス中に一部のDNAが失われることがよくあります。キットによって決定されたウイルス量は、試薬(NIBSCコード10/266)サプライヤーの割り当て値よりもわずかに低いですが、2つの値の間のlog10の差はわずか0.157であり、カットオフ値(0.5)22よりも小さいため、データは満足のいくものです。
このプロトコルで使用されるウイルス量キットは、 図7に示すように...

B型肝炎ウイルス(HBV)は、オルソヘパドナウイルス属およびヘパドナウイルス科1に属する部分二本鎖DNAウイルスです。生涯にわたって持続する慢性感染症を引き起こし、肝硬変や肝細胞癌を引き起こす可能性があります2,3,4。世界保健機関(WHO)によると、2019年には推定2億9,600万人が慢性B型肝炎に感染し、毎年150万人が新たに感染しています5。
血清または血漿サンプル中のHBV DNAの同定と測定は、進行中のB型肝炎感染患者を検出し、抗ウイルス治療の有効性を評価し、治療の成功確率を予測するための貴重な方法として機能します6,7,8,9,10,11。ウイルス量が多いと、肝硬変や肝がんなどの肝疾患の進行リスクが高まります12,13。したがって、ウイルス量の正確な測定は、HBV感染の進行を追跡し、治療に関する決定に情報を提供するために重要です。
定量的リアルタイムPCRアッセイは、従来のPCR技術よりも感度が高く、ダイナミックレンジが広く、HBV DNAの定量精度が高い14,15,16,17。血清または血漿サンプル中のHBV DNAを定量するための市販のリアルタイムPCRベースの分子診断キットがいくつか市場に出回っています。ここでは、市販のIVDマーク付きリアルタイムPCRベースキットを使用して、ヒト血清または血漿中のHBV DNAを検出および定量するための詳細なワークフローについて説明します。このキットは、広く使用されている18,19、低コストでありながら高感度のアッセイであり、その性能特性は、他の市販のCEマーク付きキットに匹敵します18。HBV標的領域の増幅とは別に、内在性内部制御遺伝子もキットに含まれており、サンプルの品質、抽出されたDNAの品質、PCR増幅、およびPCR阻害の可能性を検証します。

<table><tbody><tr><td>4th WHOB型肝炎ウイルス国際標準 DNAの</td>DNA<td>のNIBSC</td><td>コード:10/266</td><td>B型肝炎ウイルス(HBV)DNAの第4回WHO国際標準は、HBV核酸増幅技術(NAT)で使用される二次参照試薬の校正に使用することを目的としています。</td></tr><tr><td>ABIリアルタイムPCR装置&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ABI 7500;QuantStudio 5</td><td>リアルタイムPCRマシンです&nbsp;</td></tr><tr><td>HBV、HCV、HIVマルチプレックス 14/198</td><td>NIBSC</td><td>NIBSCコード:14/198</td><td>これは、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、およびヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)を含むNATアッセイ用の非常に低い陽性トリプレックス試薬です</td></tr><tr><td>QIAGENリアルタイムPCRマシン</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Q</td><td>これはリアルタイムPCRマシン&nbsp;</td></tr><tr><td>TRUPCR HBVウイルス負荷キット&nbsp;</td><td>Kilpest India Limited</td><td>3B294</td><td>これは、HBV DNA検出およびウイルス量決定のためにこの研究で使用されるリアルタイムPCRベースのキットです</td></tr><tr><td>TRUPCRウイルス核酸抽出キット</td><td>Kilpest India Limited</td><td>3B214</td><td>これは、NIBSC:10/266およびNIBSC:14/198からHBVウイルスDNAを抽出するために使用されるDNA抽出キットです</td></tr></tbody></table>

b型肝炎ウイルスdnaのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に基づく検出と定量(英語)

Real-Time Polymerase Chain Reaction-Based Detection and Quantification of Hepatitis B Virus DNA

B型肝炎ウイルス(HBV)は、世界中の肝疾患の重要な原因です。急性または慢性感染症を引き起こす可能性があり、致命的な肝硬変や肝臓がんに非常にかかりやすくなります。血液中のHBV DNAの正確な検出と定量は、HBV感染の診断とモニタリングに不可欠です。HBV DNAを検出する最も一般的な方法はリアルタイムPCRであり、ウイルスを検出し、ウイルス量を評価して抗ウイルス療法への反応をモニターするために使用できます。ここでは、IVDマーク付きリアルタイムPCRベースのキットを使用して、ヒト血清または血漿中のHBV DNAを検出および定量するための詳細なプロトコルについて説明します。このキットは、HBVゲノムの高度に保存されたコア領域を標的とするプライマーとプローブを使用しており、すべてのHBV遺伝子型(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J)を正確に定量できます。このキットには、PCR阻害の可能性を監視するための内因性内部コントロールも含まれています。このアッセイは 40 サイクル実行され、カットオフは 38 カラットです。 臨床サンプル中の HBV DNA を定量するために、5 種類の定量標準試料がキットに付属しています。この標準物質には、核酸検査用のHBV DNAに関するWHO第4国際 規格(NIBSCコード10/266)に照らして校正されたHBV特異的DNAの既知の濃度が含まれています。この標準試料は、HBV特異的DNA増幅の機能を検証し、検量線を作成するために使用され、サンプル中のHBV DNAの定量を可能にします。2.5 IU/mLという低濃度のHBV DNAをPCRキットを用いて検出しました。このキットは感度と再現性が高いため、臨床検査室での強力なツールとなり、医療従事者がHBV感染症を効果的に診断・管理するのに役立ちます。

ヒト血漿/血清からHBV DNAを検出および定量するワークフローの概略図を 図1に示します。 図2に、HBVとICの両方について、標準2(PCとして使用)とNTCの増幅プロットを示します。 図3 は、HBV陽性サンプル、HBV陰性サンプル、およびPCR阻害サンプルの増幅曲線を示しています。NIBSCコード10/266の増幅曲線、HBVのCt値、および得られたHBV濃度(国際単位/マイクロリットル(IU/μL))を 図4に示します。キットの 5 つの HBV 標準試料すべての HBV ターゲットの増幅曲線と、その代表的な標準曲線を 図 5 に示します。検量線の傾きは-3.361、R2 は0.99996、効率は0.98です。5つのHBV規格すべてのICターゲットの増幅曲線を 図6</...

B型肝炎ウイルス(HBV)DNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの検出および定量は、HBV感染を診断およびモニタリングするための高感度で正確な方法です。ここでは、HBV DNA検出とサンプルのウイルス量測定のプロトコルを紹介します。

B型肝炎ウイルスDNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に基づく検出と定量(英語)

Hepatitis B virus (HBV) is a significant cause of liver disease worldwide. It can lead to acute or chronic infections, making individuals highly ...

このビデオでは、PCR HBVウイルス量キットを介して、体外診断用IVD承認のリアルタイムPCR廃棄物を使用して、HBV DNAを検出し、そのウイルス量を定量するためのステップバイステップのプロトコルを紹介します。HBV診断研究は、リアルタイムPCR、デジタルPCR、NGS、血清学的検査を使用します。リアルタイムPCRは、HBV DNA検出とウイルス量定量のゴールドスタンダードです。デジタルPCRは、ウイルスの絶対量を定量化します。NGSは新しい変異を特定し、血清学的検査は抗原または抗体を検出します。低ウイルス量症例と潜伏性HBV感染の検出には、いくつかの実験上の課題があります。一部のアッセイは、すべてのHBV遺伝子型でうまく評価されない可能性があり、新たな変異が偽陰性の結果につながる可能性があります。他の技術と比較して、リアルタイムPCRベースのプロトコルは、HBV検出に利用できる最も感度が高く、特異的で定量的な方法です。また、比較的高速な技術であるため、臨床使用に最適です。

real-time-polymerase-chain-reaction-based-detection-quantification

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

C型肝炎ウイルス(HCV)は、肝硬変や癌を含む肝障害を引き起こす主要なヒト病原体です。HCV感染性細胞培養システムは、HCV複製の分子メカニズムを理解し、新しい治療法を開発するために不可欠です。ここでは、HCV複製サイクルのさまざまな段階を調査するためのプロトコルについて説明します。...

C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

ここでは、HBVのライフサイクルの初期段階をモニターするために新たに開発されたB型肝炎ウイルス（HBV）レポーター系を記載します。 インビトロ系簡略化これは、高スループットの戦略を用いて、抗HBV薬のスクリーニングに役立ちます。...

複製サイクルの初期段階を監視するためにB型肝炎ウイルスのレポーターシステムの開発

我々 はここで B 型肝炎ウイルス感染システムを介して HBV DNA の体外生成を記述して、逆行列を用いて、(1-2 コピー) 統合の高感度検出に PCR...

低コピーの検出数は B 型肝炎感染培養によって形成された統合ウイルス DNA

このプロトコルの目標は、B 型肝炎ウイルスと 3-D「肝臓-オン-チップ」感染実験を実行するステップ バイ ステップ...

初代肝細胞とクッパー細胞 B 型肝炎ウイルス感染の「肝臓-オン-チップ」文化

逆のトランスクリプション (RT qPCR) と組み合わせてリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応分析は、RNA ウイルス感染のレベルを測定するため広く使用されています。デング熱ウイルスを含むいくつかの RNA ウイルスの定量化のために開発、RNA の精製ステップを必要としない直接 RT qPCR...

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染細胞の培養上清中のデング ウイルス RNA を測定

本稿では、新たに設計された293T細胞(293T-NE-3RS、ヒトNTCP、HNF4α、RXRαおよびPPARα)および伝統的な肝細胞(HepG2-NE、ヒトNTCPを発現する)におけるB型肝炎ウイルス(HBV)感染の詳細なプロトコルについて説明する。...

非肝細胞293T-NE-3NRs細胞におけるB型肝炎ウイルス感染のモデル化

等温滴定熱量測定を使用して、ウイルス侵入前後のライフサイクル段階を標的とする抗B型肝炎ウイルス(HBV)化合物をスクリーニングするためのプロトコルを提示し、宿主タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドとの結合親和性(KD)を測定します。抗ウイルス効果は、ウイルスライフサイクルマーカー(cccDNA形成、転写、およびウイルス集合)の抑制によって決定されました。...

治療標的としてのタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドを介したB型肝炎ウイルス侵入を調べるコンピテント肝細胞モデル

我々は将来の核酸ベースの治療のために均一とカスタマイズ可能なpolyplexesのよりよい制御および合成を提供することが期待される高分子電解質polyplexes、の形成を調査するナノフォトニクス（QD -...

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

本研究では、特定のタンパク質のグリコシル化プロファイリングに使用することができるレクチン検出法による多重化、ハイスループット抗体マイクロアレイのための改良プロトコルを記述します。このプロトコルは、新しい信頼性の高い試薬を備えており、前の手順に比べて大幅に時間、コスト、およびラボ機器の要件を軽減します。...

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

学ぶリアルタイムPCRによるB型肝炎ウイルスDNAの検出と定量法。高感度・高特異性のゴールドスタンダード技術で、臨床診断とウイルス量モニタリングに有用です。

B型肝炎ウイルスDNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に基づく検出と定量(英語)

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