Name: 卵に寄生する Trichogramma dendrolimi Matsumura におけるRNA干渉 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 学ぶTrichogramma dendrolimiにおけるRNA干渉法による遺伝子機能解析。微小注射技術を用いて鉄代謝異常や翅変形を誘導し、農業害虫防除に重要な寄生蜂の遺伝制御メカニズムを解明する。

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本研究は、中国国家自然科学基金会(32172476、32102275年)、農業科学技術イノベーションプログラム(CAAS-ZDRW202203、CAAS-ZDRW202108)、地方科学技術開発指導中央基金(XZ202301YD0042C)のプロジェクトから資金提供を受けました。

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、ソフトウェア、および試薬に関する詳細については、 材料表 を参照してください。
1. 昆虫培養物の収集と維持
<ol><li>アラビアガム粉末と水の1:5(v / v)溶液を使用して、9 cm x 16 cmのカードにCorcyra cephalonica(Stainton)の~5,000個の卵のグループを付着させます25,26。 注:過密状態になると、その後の移植および解剖手順が実用的ではなくなるため、カードに宿主卵をあまり多く付着させないでください。</li>
	<li>宿主卵の孵化を防ぐため、宿主卵カードに30分間紫外線(UV)を照射する(図1-i)。続いて、不活化卵の入った紙を厚さ1cm、直径8cmの卵カードに切り、それぞれ約300〜500個の卵を入れます(図1-ii)25,26,27。</li>
	<li>80〜120匹の T.denrolimi スズメバチのコホートを、直径2 cm、長さ8 cmのガラス管に入れます。チューブを綿で密封します。 注意: スズメバチを25±〜1°Cの温度に維持し、明暗サイクルを16時間、暗さ8時間、相対湿度を約75%に維持します。</li>
	<li>寄生のためにスズメバチに宿主の卵カードを提示します(図1-ii)。スズメバチが宿主の卵に卵を6時間預けるのを許し、その後すぐにスズメバチを取り除きます。 注:寄生期間を過度に延長すると、宿主の卵の中でT. denrolimiの子孫が過密になり、子孫のスズメバチの死亡率が増加する可能性があるため、避けてください28,29。</li>
</ol>2. dsRNAの合成
<ol><li>二本鎖RNA(dsRNA)を合成するためのT7プロモーターを含むプライマーセットを設計します。dsRNA合成のために標的遺伝子(Ferhch)から300-400 bpセグメントを選択します。</li>
	<li>ネガティブコントロールとして使用するために、標的遺伝子のdsRNAおよびdsGFP を産生するための市販のプライマーセットを入手します。</li>
	<li>100 T. denrolimi スズメバチから RNA 含有量を抽出し、メーカーのプロトコル9 に従って参照キットを使用します。RNA含有量の品質を確認します。OD260/OD280 の値が 1.8 から 2.0 の範囲であれば、続行します9.</li>
	<li>2 μL の 5x バッファー (1 U/50 μL)、1 μL の DNAse (1 U/50 μL)、6.5 μL の RNA (~100 ng/μL)、0.5 μL の H2O で 42 °C で 2 分間、RNA 含有量を精製します。</li>
	<li>逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行い、精製RNA(~100 ng/μL)10 μL、5xバッファー4 μL(1 U/50 μL)、酵素ミックスI(1 μL/50 μL)1 μL、H2O4 μLでcDNAテンプレートを作製します。 以下の設定を使用してRT-PCRを実施します。 37°Cで15分間、 85°Cで5秒。cDNA産物は、使用するまで-4°Cで保管してください。</li>
	<li>ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、参照したマスターミックス(10 μL の Taq II [1 U/50 μL]、0.8 μL のフォワードプライマー [0.4 μM]、0.8 μL のリバースプライマー [0.4 μM]、0.8 μL の DNA テンプレート [40 ng/μL]、および 7.6 μL の H2O)に従って dsRNA 配列を増幅します。以下の設定を使用してPCRを実施します:94°Cで2分間。94°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで30サイクル。72°Cで2分間</li>
	<li>2.0%アガロースゲル5,9の電気泳動によってPCR産物の品質を評価し、サンガーシーケンシングによって標的配列を確認します。</li>
	<li>メーカーのガイドライン9,23に従って、ゲル抽出キットを使用してPCR産物を精製します。</li>
	<li>RNAiシステムを利用して、10 μLの2xバッファー(0.02 U/μL)、8 μLのDNAテンプレート(75 ng/μL)、および2 μLの酵素ミックス(1 U/50 μL)で、37°Cで30分、70°Cで10分、25°Cで20分の設定で標的遺伝子のdsRNAを合成します。合成したdsRNAを30 μLのヌクレアーゼフリー水で溶出します。</li>
	<li>dsRNA産物の品質を1.0%アガロースゲルで可視化して評価します5,9。dsRNA を 7,000 ng/μL に希釈します。 dsRNA 産物の品質を確認します。OD260/OD280 の値が 1.8 から 2.0 の範囲であれば、続行します9.dsRNA産物は、使用するまで-20°Cで保管してください。</li>
</ol>3. T. denrolimi 蛹の移植
<ol><li>寄生した宿主卵を25±1°Cで約8日間培養し、16時間の明/8時間の暗サイクルと~75%の相対湿度を維持します。寄生された宿主の卵は、5日後に黒くなります30 (図1-iv、v)。</li>
	<li>宿主の卵子カードを解剖顕微鏡に移します。一対のタングステン針(図1-vi)を使用して、宿主の卵から絨毛膜を細心の注意を払って除去し(図1-vii)、内部から蛹を回収します(図1-viii)5,17,18。 注意: 解剖針の先端は0.05mm未満である必要があります。</li>
	<li>基板用のクリーンプレートを準備します。15 g/Lの寒天溶液を10〜15 mL注ぎ、自然冷却します(図2-i)。 注:寒天溶液を0.5gのストレプトマイシンと混合して、 in vitroで汚染物質の増殖を抑制します。</li>
	<li>深さ0.2〜0.3 mm、幅0.4〜0.8 mmの溝をエッチングするために、消毒された彫刻刀を使用します(図2-ii)。</li>
	<li>小さなブラシ(図2-iii)を使用して、解剖した宿主卵から寒天基質の溝の1つに蛹を移植します(図2-iv)。</li>
	<li>手順3.4と3.5を繰り返し、100〜300匹の蛹を1つずつ溝に移植します(図2-v)。</li>
</ol>4. T. denrolimi pupaへのdsRNAのマイクロ注入
<ol><li>ガラスの針引き機を使用して、ガラスの毛細管を引っ張ります(図3-i、ii)。針引き機で、熱を 280 に、速度を 170 に、遅延を 250 に、プルを 30 に設定します(図 3-iii)。マイクロインジェクション用の複数のキャピラリーガラス針を準備します(図3-iv、v)。</li>
	<li>研磨板を使用してガラス針の先端を面取りします(図3-vi)。 注意: 注射針の先端が鋭利なままであることを確認してください。そうしないと、蛹が死亡したり、針を通る試薬の流れが妨げられたりする可能性があります(図3-vii)。</li>
	<li>約2 μLのdsRNA注入液を7,000 ng/μLで、マイクロインジェクションポンプを使用して準備した注射針にロードします(図3-vii)。</li>
	<li>数百匹の蛹を含む寒天基質を複合顕微鏡のプラットフォームに移します(図3-viii)。</li>
	<li>T . denrolimi の蛹の腹部に、レンズの下の腹部に対して~30°の角度で注射針を慎重に挿入します(図3-ix)。</li>
	<li>~5 nL の注入溶液を T. denrolimi の蛹にできるだけ穏やかに徐々に注入します (ステップ 4.3)。 注: T. denrolimi pupa は、dsRNA 溶液を注入するとわずかに膨潤することがあります。蛹に過剰な量の溶液を注入したり、開口部が大きすぎる針を使用したりすると、蛹が早期に死亡する可能性があります。数個から数十個の蛹を注入した後、針が詰まった場合は針を交換してください。</li>
	<li>手順4.5と4.6を繰り返し、600匹の蛹にdsRNAを1匹ずつ注入します。 注:信頼性の高いRT-qPCR分析のためには、少なくとも100匹の蛹からRNA含量を単離する必要があります。dsRNA 処理では 3 回、 dsGFP ネガティブコントロールでは 3 回繰り返し、少なくとも 600 匹の蛹を注入します9。</li>
</ol>5. T. denrolimi 蛹の孵化
<ol><li>注入した蛹を含む基質を、16時間/8時間の明暗サイクルと~75%RHで25±1°Cのインキュベーターに移します。</li>
	<li>処理ごとに約700 T.denrolimi の蛹を24時間または48時間インキュベートします。1回あたり100匹の蛹のグループからRNA含量を抽出します9. 注:収縮した蛹(死んだ蛹)をサンプルから取り除きます。そうしないと、遺伝子発現の検出にエラーが生じる可能性があります。</li>
	<li>スズメバチが羽化するまで、治療ごとに~50 T. denrolimi の蛹を孵化させます(図3-x)。出現率と変形率を記録します。</li>
</ol>6. 標的遺伝子発現の検出
<ol><li>デザインツールを使用して、RT-qPCRの標的遺伝子および参照遺伝子のプライマーセットを設計します。 注:RT-qPCRプライマーの配列がdsRNAの標的領域と重複していないことを確認してください。</li>
	<li>RT-qPCR解析では、 フォークヘッドボックスO (FoxO)遺伝子を参照遺伝子として使用します。 FoxO のプライマーは以前に報告されています9.</li>
	<li>市販のプライマーセットを入手します。10 μL の Taq II (1 U/50 μL)、0.8 μL のフォワードプライマー (0.4 μM)、0.8 μL のリバースプライマー (0.4 μM)、0.8 μL のテンプレート (10 ng/μL)、および 7.6 μL の H2O で RT-qPCR を実行します。 以下の設定を使用して RT-qPCR を実行します。 95 °C で 30 秒間。95°Cで5秒、57°Cで30秒、72°Cで30サイクル。95°Cで10秒。60°Cで5秒、95°Cで5秒。</li>
	<li>2-ΔΔCt法9,25を用いて標的遺伝子の発現値を算出する。</li>
	<li>Kruskal-Wallis検定を用いて、さまざまな治療(dsFerhch、 dsGFP、非注射)の影響下での標的遺伝子の発現を解析します。 注:データの不均一性や非正規性が誤った結論につながる可能性があるため、事後比較にパラメトリック検定( t検定など)を使用することは避けてください25。</li>
</ol>

遺伝子機能解析のための Trichogramma dendrolimi におけるRNAi技術の進歩

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<li>Flanders, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notes+on+the+life+history+and+anatomy+of+Trichogramma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Entomol+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Notes on the life history and anatomy of Trichogramma.</a> Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).</li>
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著者らは、利益相反がないことを宣言します。

トリコグラマバチは、効果的な生物学的防除剤として認識されており、特に農業および林業におけるさまざまな鱗翅目害虫を標的としています1。これらの小さなスズメバチは、宿主の卵の中で未熟な段階を経るため、RNAi実験を行う上で課題となる特徴があります5,18。この研究は、T. denrolimiのRNAi実験を実施するための包括的な視覚的ガイドを提供します。トリコグラマ種間で共有される生物学的形質を考えると、この手順は、いくつかの調整を行うことで、他のトリコグラマ種および内部寄生種でのRNAi研究またはマイクロインジェクションに容易に適応できます。
この手順では、dsRNA含有量の効率的なマイクロインジェクションの促進、T. denrolimiのRT-qPCRプロセスの合理化、T. denrolimiの蛹の移植と...

Trichogramma spp.は、世界中の農業および森林生態系において、広範囲の鱗翅目害虫に対する高効率の生物学的防除剤として広く利用されている卵寄生虫のグループです1,2,3,4。大量飼育されたTrichogrammaの適用は、害虫5,6,7の持続可能な管理のための環境に優しいアプローチを提供します。トリコグラマバチの分子生物学を理解することは、遺伝子制御とゲノム編集の方法論を調査することにより、これらの生物学的防除剤の大量飼育効率と圃場性能を向上させるための貴重な洞察を提供します8,910。
1998年に線虫類における二本鎖RNA(dsRNA)を介した特異的遺伝的干渉が発見されて以来、RNA干渉(RNAi)法は、標的遺伝子の発現を抑制することにより、生物の調節メカニズムを探求するための重要な遺伝的ツールキットに進化しました11。RNAi実験は、多くの昆虫種の遺伝子機能を研究するために広く適用されている標準的な方法論となっています12,13。それにもかかわらず、RNAiの操作は、多くの寄生生物種、特に内部寄生性Chalcidoidea科に属する種において手ごわい課題を提示します14,15,16。RNAi法は、少なくとも13の寄生生物種(14、15、16、17、18、19)で文書化されています。このうち、RNAiアプローチはナソニアスズメバチで包括的に行われており、胚、幼虫、蛹、成虫を含む発生段階全体に適用できます14,15,16。注目すべきは、ナソニアスズメバチは外部寄生虫であり、その子孫は宿主の蛹と蛹の間の間質空間で発達するため、試験管内での培養が可能になり、マイクロ注射などの特定の治療に耐えられるようになることです。ナソニアスズメバチとは異なり、トリコグラマの個体は、胚、幼虫、および蛹の全体の発生を宿主の卵の中で受けます。胚および幼虫期の層(dsRNAの透過性を妨げる可能性がある)、損傷に対する脆弱性、およびin vitroでの生存の難しさは、手ごわい障害を提示します20,21,22。さらに、Trichogramma個体は、成体または蛹体長が約~0.5mmと小柄なため、20,21,22を操作するのは非常に複雑です。
本研究では、Trichogramma denrolimi MatsumuraにおけるRNA干渉(RNAi)実験を実施するための包括的な手順を概説する。この手順には、(1)二本鎖RNA(dsRNA)の設計と合成、(2)T. denrolimiの蛹のマイクロインジェクション、(3)これらの蛹の移植とin vitroインキュベーション、(4)RT-qPCR解析による標的遺伝子ノックダウンの検出が含まれます。RNAi実験で選択された標的遺伝子は、フェリチン重鎖相同性(Ferhch)です。鉄結合タンパク質であるFerHCHは、抗酸化能を備えたフェロキシダーゼ中心を含み、Fe2+からFe3+への酸化を促進します。酸化還元平衡と鉄の恒常性を維持することにより、さまざまな生物の成長と発達に不可欠な役割を果たしています。FerHCHの枯渇は、鉄の過剰蓄積をもたらし、不可逆的な組織損傷を引き起こし、多くの場合、成長欠陥、奇形、死亡率などの重大な表現型の変化で最高潮に達する可能性があります23,24。この研究は、T. denrolimiでRNAiを実施するためのステップバイステップのガイドを提供し、Trichogramma wasphのより広い文脈の中で遺伝子機能を調査するために非常に貴重です。

<table><tbody><tr><td>2x ES Taq MasterMix (染料)</td><td>Cowin Biotech、中国</td><td>CW0690H</td><td>dsRNA配列を増幅するには</td></tr><tr><td>20x PBSバッファー、DEPC処理 (7.2-7.6)</td><td>Sangon Biotech、中国</td><td>B540627-0500</td><td>dsRNA</td></tr><tr><td>寒天ストリップ</td>を希釈するには <td>Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China</td><td>n/a</td><td>培養液を作るには</td></tr><tr><td>Ampicillin sodium</td><td>Sangon Biotech, 中国</td><td>A610028</td><td>作る培地</td></tr><tr><td>Bioer 恒温金属浴 </td><td>BIOER、中国</td><td>MB-102</td><td>dsRNA</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細血管の合成 </td><td>WPI, USA</td><td>1B100-4</td><td>キャピラリーガラスニードルを引っ張る</td></tr><tr><td>クリーンベンチ </td><td>エアテック、中国</td><td>SW-CJ-1FD</td><td>RNAを抽出するには</td></tr><tr><td>二重蒸留水</td><td>サンゴンバイオテクノロジー、中国</td><td>A500197-0500</td><td>cDNAを希釈するには</td></tr><tr><td>環境試験チャンバー </td><td>パナソニック</td><td>MLR-352H-PC</td><td>培養へ T. denrolimi</td></tr><tr><td>&gt;Eppendorf Centrifuge </td><td>エッペンドロフ、ドイツ</td><td>5418R</td><td>RNA含有量を保存するには</td></tr><tr><td>エッペンドルフ FemtoJet 4i</td> エ<td>ッペンドロフ、ドイツ</td><td>FemtoJet 4i</td><td>注射するには T. denrolimi</td></tr><tr><td>Eppendorf 冷蔵遠心分離機 </td><td>エッペンドロフ、ドイツ</td><td>5810R</td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>エタノール溶液 (75%、RNase-フリー)</td><td>アラジン、中国</td><td>M052131-500ml</td><td>RNAゲル</td></tr><tr><td>抽出キット</td><td>オメガ、米国</td><td>D25000-02</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>GUM アラビア</td><td>Solarbio、中国</td><td>CG5991-500g</td><td>卵カードを作るには</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>アラジン、中国</td><td>80109218</td><td>RNAを抽出するには</td></tr><tr><td>レーザーベースのマイクロピペットプーラー </td><td>米国SUTTER</td><td>P-2000</td><td>キャピラリーガラスニードルを引っ張る</td></tr><tr><td>マイクロローダー </td><td>エッペンドロフ、ドイツ</td><td>20 µL</td><td>dsRNAをロードするには</td></tr><tr><td>マルチサンプルティッシュグラインダー </td><td>地衣類、中国</td><td>LC-TG-24</td><td>T. denrolimi</td></tr><tr><td>ニードルグラインダー </td><td>SUTTER, USA</td><td>BV-10-E</td><td>キャピラリーガラス針を挽くには</td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Sangon Biotech, China</td><td></td><td>RNAを希釈するには</td></tr><tr><td>OLYMPUS顕微鏡</td><td>OLYMPUS, Japan</td><td>XZX16</td><td>T. denrolimi</td></tr><tr><td>PCRマシンを観察するには </td><td>Bio-rad, USA</td><td>S-1000</td><td>For DNA Amplification</td></tr><tr><td>PowerPac Basic</td><td>Bio-rad, USA</td><td>PowerPacTM Basic</td><td>dsRNAの品質を検出するには </td></tr><tr><td>dsGFP (フォワード)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA</td></tr><tr><td>dsGFP (Reverse)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG</td></tr><tr><td>Ferhch の qPCR の入門書 (フォワード)</td><td></td><td></td><td>TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCTCGCT</td></tr><tr><td>Ferhch の qPCR のプライマー (逆)</td><td></td><td></td><td>CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT</td></tr><tr><td>Ferhch for RNAi (Reverse)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC</td></tr><tr><td>Ferhch for RNAi(フォワード</td><td></td>&gt;&lt;&gt;&lt;&gt;&lt;)<td></td><td></td>の入門剤</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>CTACGCCGATCTCATAACGC</td></tr><tr><td>FoxOのqPCR用プライマー(逆)</td><td></td><td></td><td>TGCTGTCGCCCTTGTCCT</td></tr><tr><td>PrimeScript RT試薬キットとgDNA消去剤(パーフェクトリアルタイム)</td><td>TaKaRa、日本</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>定量的リアルタイムPCR </td><td>バイオ・ラッド、米国</td><td>CFX 96 Touch</td><td>To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) </td></tr><tr><td>リアルタイム PCR (TaqMan) プライマーおよびプローブ設計ツール</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ T7 RiBoMAX Express RNAi System</td><td>Promega, USA</td><td>P1700</td><td>dsRNA の合成へ  in vitro </td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex TaqTM <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66250/66250eq01.jpg" style="margin: auto;"> (Til RnaseH Plus)</td><td>TaKaRa, Japan</td><td>RR820A</td><td>To perform RT-qPCR</td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>KESHI, China</td><td>GB/T682-2002</td><td>To extract RNA</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion, USA</td><td>15596018</td><td>To extract total RNA content from samples</td></tr><tr><td>Ultra-low Temperature Freezer </td><td>Thermo, USA</td><td>Forma 911</td><td></td></tr></tbody></table> (英語)

卵に寄生する trichogramma dendrolimi matsumura におけるrna干渉

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

卵寄生虫であるTrichogramma sppは、農業や森林におけるさまざまな鱗翅目の害虫に対する効率的な生物学的防除剤として認識されています。トリコグラマの子孫の未熟期は宿主卵内で発生し、顕著な小ささ(成体長約0.5mm)を示します。RNA干渉(RNAi)法は、多くの生物の遺伝子機能を解明するための重要なツールとして浮上しています。しかし、トリコグラムマなどの特定の小さな寄生生物種におけるRNAiの操作は、一般的に大きな課題を提起してきました。本研究では、Trichogramma denrolimiにおける効率的なRNAi法について紹介する。概説されている手順には、宿主卵からの個々のT.dendrolimi標本の取得と分離、二本鎖RNA(dsRNA)の設計と合成、T. dendrolimiの蛹のin vitro移植と培養、dsRNAのマイクロインジェクション、およびその後のRT-qPCR分析による標的遺伝子ノックダウンの評価が含まれます。この研究は、T. dendrolimiのRNAi実験を実施するための包括的で視覚的に詳細な手順を提供し、それによって研究者がこの種の遺伝子制御を調べることを可能にします。さらに、この方法論は、微調整を行うことで、他のトリコグラマ種におけるRNAi研究やマイクロインジェクションに適応可能であり、他の内部寄生種におけるRNAi実験を実施するための貴重な参考資料となります。

dsFerhchを注射したT. denrolimiの蛹の出現率は、dsGFPを注射した蛹や注射しなかった蛹よりも有意に低かった(表1)。羽化したスズメバチのうち、dsFerhchに曝露されたスズメバチの51.85%は変形した小さな翅を発達させた。変形したスズメバチは、dsGFPを注射したスズメバチまたは注射なしで観察されませんでした(表1)。さらに、dsFerhchを注射したT. denrolimi pupaeの腹部は、鉄代謝異常の表現型であるメラニズムを示した23。dsGFPを注射したT. denrolimiの蛹や注射を打たなかった蛹にはメラニズムは認められませんでした(図4)。
RT-qPCR解析では、dsFerhch<...

RNA干渉(RNAi)の操作は、 トリコグラマ スズメバチなど、サイズが小さい多くの寄生生物種において手ごわい課題となっています。この研究は、 Trichogramma denrolimiにおける効率的なRNAi法を明らかにしました。本手法は、 トリコグラマ バチの遺伝子制御を調査するための堅牢なモデルを提供します。

卵に寄生する Trichogramma dendrolimi Matsumura におけるRNA干渉

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and ...

トリコグラマバチは、農業で鱗翅目の害虫を防除するために使用される卵寄生虫のグループです。細胞内細菌ボルバキアは、一部のトリコグラマバチに単為生殖を誘導します。私たちは、ボルバキアのメカニズムとトリコグラマバチの性決定システムについて解明しようとしています。我々は、トリコグラマバチにおけるRNA干渉法を開発した。この方法は、トリコグラマの遺伝子機能を調べるための重要な遺伝的ツールキットです。トリコグラマの子孫の未熟な段階は、宿主の卵の中で発達します。トリコグラマの体の大きさは非常に小さく、成体の長さは約0.5ミリメートルです。RNA干渉やゲノム編集などの遺伝的ツールの操作は、これらの小さな寄生バチにとって手ごわい課題となっています。何十年もの間、トリコグラマ属全体の遺伝子機能はめったに調査されていませんでした。本方法論は、スズメバチの発生および生理学的活動中の遺伝子制御を調査するための堅牢なモデルを提供します。

rna-interference-egg-parasitoid-trichogramma-dendrolimi

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子ノックダウン技術は、 コクヌスト研究の中核にあるベース。ここでは、 コクヌストにおける当社の幼虫のRNAi技術の概要を説明します。幼虫RNAiは、研究者が多様な文脈で遺伝子機能を研究することができ、機能喪失型の表現型への迅速なアクセスを提供する単純な、しかし強力な技術である。...

レッドフラワービートル幼虫RNA干渉、コクヌストモドキ

このプロトコルは、卵除去実験を実行するためのガイドラインを提供します:...

表現型の勾配に沿って卵除去実験を用いた卵認識の限界を探る

このプロトコルでは、ant Vollenhovia...

誘導と近親交配アリ、 Vollenhovia Emeryiを使用しての評価

4 ′、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 受精率を決定して haplodiploid...

細胞遺伝学的手法を用いたタバココナジラミの卵の受精率を決定します。

我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電...

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

私たちは、青い尾のダムを使用して、オーダーオドナタ(トンボとダムリー)の昆虫に対するエレクトロポレーション媒介性RNA干渉(イシュヌラ・セネガルシス:コエナゴロ科:ツィゴプテラ)とパイドスキマートンボ(プセミソナタ:リベルリドエ:アネリスラプテ)を使用して詳細なプロトコルを提供します。...

オドナタにおけるエレクトロポレーション媒介性RNA干渉法

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera...

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

本議定書は、実験室におけるトルトリシッド害虫昆虫の飼育方法を記載する。昆虫の性別を区別し、ハイスループットシーケンシングのために核酸を抽出する手順は、2つのトルトリシッド害虫を使用して確立されています。...

トルトリシダ科害虫の大量飼育と分子研究

このプロトコルはC .のelegansのRNAi誘導されたサイレンシングおよび準のchromatinの修正のエピジェネティックな遺伝を調査するRNAの干渉およびChIPの試金を記述する。...

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

ここでは、ポリエチレンフィルムとアミノ酸溶液で作成した人工宿主を用いて、 Trichogramma dendrolimi...

人工宿主を用いた寄生バチ Trichogramma dendrolimi からの毒液抽出

学ぶTrichogramma dendrolimiにおけるRNA干渉法による遺伝子機能解析。微小注射技術を用いて鉄代謝異常や翅変形を誘導し、農業害虫防除に重要な寄生蜂の遺伝制御メカニズムを解明する。

卵に寄生する Trichogramma dendrolimi Matsumura におけるRNA干渉

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