Name: ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学ぶ4Dライトシートイメージングを用いたゼブラフィッシュ幼生の心臓収縮動態解析。単一細胞レベルで心臓機能を可視化し、心臓発生と疾患メカニズムの理解を深める革新的な手法です。

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ボストン小児病院のキャロライン・バーンズ博士には、トランスジェニックゼブラフィッシュを惜しみなく共有していただき、感謝の意を表します。エリザベス・アイバニェスさんには、UTダラスでのゼブラフィッシュの飼育を手伝っていただき、感謝しています。また、UTダラスのD-インキュベーターメンバーから建設的なコメントをいただいたことにも感謝します。この研究は、NIH R00HL148493(Y.D.)、R01HL162635(Y.D.)、およびUT Dallas STARSプログラム(Y.D.)の支援を受けました。

バーチャルリアリティインタラクションによるゼブラフィッシュ心収縮の解析

<ol><li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circ. Res. 110 (6), 870(2012).</li>
<li>Ding, Y., Bu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+inherited+cardiomyopathies+in+adult+zebrafish+for+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine.</a> Front. Physiol. 11, 599244(2020).</li>
<li>Giardoglou, P., Beis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+zebrafish+disease+models+and+matters+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">On zebrafish disease models and matters of the heart.</a> Biomedicines. 7 (1), 15(2019).</li>
<li>Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+cardiac+contractile+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Cardiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of cardiac contractile function.</a> Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).</li>
<li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cardiac+development+and+function+in+zebrafish+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Med.+Wkly%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy.</a> Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227(2015).</li>
<li>Vedula, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+quantify+mechanobiologic+forces+during+zebrafish+cardiac+development+using+4-D+light+sheet+imaging+and+computational+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling.</a> PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828(2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+function+and+hemodynamic+analysis+for+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).</li>
<li>Baek, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+microscopy+to+elucidate+cardiovascular+injury+and+regeneration%3A+4D+light-sheet+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).</li>
<li>Salman, H. E., Yalcin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+blood+flow+assessment+in+Zebrafish+via+experimental+digital+particle+image+velocimetry+and+computational+fluid+dynamics+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling.</a> Micron. 130, 102801(2020).</li>
<li>Sodimu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+and+interactive+analysis+of+the+cardiac+structure+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice.</a> J. Biophotonics. 16 (5), e202200278(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+light-sheet+imaging+and+interactive+analysis+of+cardiac+contractility+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae.</a> APL Bioeng. 7 (2), 026112(2023).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22Eugene%22">Eugene</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. 25, e1115(2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> J. Opt. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>Gualda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSpinMicroscopy%3A+an+open-source+integrated+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform.</a> Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).</li>
<li>Messerschmidt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+to+capture+4-dimensional+images+of+the+effects+of+modulating+shear+stress+on+the+developing+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart.</a> J Vis Exp. 138, e57763(2018).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+light-sheet+imaging+and+interactive+analysis+of+cardiac+contractility+in+Zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae.</a> Zenodo. , (2023).</li>
<li>Wen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3deecelltracker%2C+a+deep+learning-based+pipeline+for+segmenting+and+tracking+cells+in+3d+time+lapse+images%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images.</a> Elife. 10, e59187(2021).</li>
<li>Yushkevich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((User-guided+3D+active+contour+segmentation+of+anatomical+structures%3A+significantly+improved+efficiency+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability.</a> Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).</li>
<li>Fedorov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Slicer+as+an+image+computing+platform+for+the+quantitative+imaging+network%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network.</a> Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).</li>
<li>Naderi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+framework+for+cardiac+function+assessment+in+embryonic+zebrafish+from+heart+beating+videos%5BTitle%5D)+AND+%22Comput.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos.</a> Comput. Biol. Med. 135, 104565(2021).</li>
<li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+light-sheet+for+rapid+imaging+of+cardiopulmonary+system%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system.</a> JCI Insight. 3 (16), e121396(2018).</li>
<li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).</li>
<li>Coelho-Filho, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cardiomyocyte+hypertrophy+by+cardiac+magnetic+resonance%3A+implications+on+early+cardiac+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling.</a> Circulation. 128 (11), 1225(2013).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+segmentation+and+cardiac+mechanics+analysis+of+evolving+zebrafish+using+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cardiovasc.+Med%22%5BJournal%5D)">Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning.</a> Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291(2021).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), e97180(2017).</li>
<li>Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+reality+for+interactive+medical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Virtual+Real%22%5BJournal%5D)">Virtual reality for interactive medical analysis.</a> Front. Virtual Real. 3, 782854(2022).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+reality+for+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Methods+Prim%22%5BJournal%5D)">Extended reality for biomedicine.</a> Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).</li>
</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

ゼブラフィッシュモデルと工学的手法の統合は、心筋梗塞、不整脈、先天性心疾患のin vivo探索に大きな可能性を秘めています。ゼブラフィッシュの胚や幼生は、その光透過性、再生能力、ヒトとの遺伝的・生理学的類似性を活かして、研究に広く利用されています1,2,4。優れた時空間分解能、最小限の光損傷、およびライトシートイメージングの光学セクショニング機能は、ゼブラフィッシュの幼生12,26,27,28の心臓の形態と収縮機能の4D調査に際立っています。このプロトコルは、ライトシートイメージング、レトロスペクティブ同期、3D細胞追跡、および定量的評価のためのインタラクティブなバーチャルリアリティ(VR)プラットフォームを統合する包括的なアプローチを導入しています。心臓の収縮を捉えて再構築し、細胞の動態を追跡・定量化し、心臓の発達と再生における構造的、機能的、機械的変化を評価するためのエントリーポイントを提供します。この方法は、細胞の不均一性や細胞間相互作用を調査するために、さまざまな細胞タイプや系統を追跡するためのマルチチャンネル蛍光イメージングによって強化することもできます。ゼブラフィッシュモデルは哺乳類系との二分法と急性モデルとしての限界があるため、慎重に検討する必要があるが、遺伝子工学の進歩により、ヒトの病態により近いトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の開発が可能になり、それによってゼブラフィッシュ研究から得られた知見の翻訳価値が高まる可能性がある29。
周期的な心周期を仮定したこのレトロスペクティブ同期は、収縮するゼブラフィッシュの心臓のライトシート画像を再構築するために使用されます。この手法をライトシートイメージングに実装することで、収縮する心臓を毎秒200体積以上で可視化し、分析することができます。今回の解析では、データ量が多いという課題に対して、マルチコアCPUとGPUによる並列計算を用いることで、画像再構成効率を10倍以上向上させました。レトロスペクティブ同期中、心筋細胞は心拍ごとにベースライン位置に戻ることを前提としていました。図4Cに示されているように、ゼブラフィッシュ26に見られる心拍の変動性が低いことを考えると、この仮定は比較的安全ですが、すべての生物学的ニュアンスを説明できない単純化にとどまっています。圧縮蛍光や明視野顕微鏡などのイメージングの革新は、スライスの冗長性を低下させることで、この仮定から生じる影響を軽減できる可能性があります。
複雑な4D心臓モデルでの詳細な分析を可能にするために、3DeeCellTrackerベースの細胞セグメンテーションとユーザー主導の調査のためのVRプラットフォームの両方を含む計算フレームワークが開発されました。高効率やインタラクティブな操作など、このフレームワークの固有の機能により、細胞速度の変化を定量化し、細胞間相互作用を調査し、分数短縮、駆出率、局所ひずみなどの局所的および全体的な心筋力学を評価することができます30(図4).既存の文献には、7 dpf でのゼブラフィッシュの心機能の事前評価がないことが指摘されています。しかし、他の研究者によって提供された3 dpfのデータと比較すると、現在の結果は、3 dpfから7 dpfまでの間隔で駆出率(EF)とフラクショナル短縮(FS)の両方が低下したという以前の兆候と一致しています25,31。これらの分析法は、ゼブラフィッシュの心損傷モデルにおける心臓動態を解明する大きな可能性を秘めている12,25。
VR技術とソフトウェアには、立体視や細胞位置の自動登録などの独自の機能が含まれているため、このプラットフォームでは、特定の細胞を選択し、心周期全体の軌跡を分析するための没入型で合理化された方法が可能になります。VRの利用は、細胞のセグメンテーションやアノテーションなどの複雑なタスクを、より高い効率と精度で直感的に実行する方法を提供します32,33,34。また、複数のユーザーが大規模で複雑なデータセットで共同作業する際に独自のツールを利用することもサポートしています34。VRを長時間使用すると、めまいなどの副作用を引き起こす可能性がありますが、これは人間工学に基づいたデザインの改善とテザーなしのヘッドセットによって軽減できます。さらに、複雑な生体構造をリアルタイムでレンダリングするために必要な膨大な計算能力に対処するために、瞬時に処理できるようにソフトウェアを最適化し、クラウドベースのコンピューティングソリューションを活用することで、複雑な視覚化を管理するシステムの能力を高めることができます。
ハードウェアデバイスと計算能力が進歩し続ける中、この戦略は、細胞レベルと組織レベルの両方で心筋の不整脈を調べるために拡張され、最終的には心臓の形態形成の根本的なメカニズムを解明し、治療介入の開発を進める可能性を秘めています。

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、その光透過性、遺伝的トラクタビリティ、および再生能力により、心臓の発達、生理機能、および修復を研究するために広く使用されているモデル生物です1,2,3,4。心筋梗塞では、構造的および機能的な変化が心臓駆出と血行動態に影響を与えますが、技術的な制限により、高い時空間分解能で心臓再生中の動的プロセスを調査する能力が引き続き妨げられています。例えば、共焦点顕微鏡などの従来のイメージング法では、複数の心臓周期における動的変化を捉え、心収縮機能を評価するためのイメージング深度、時間分解能、または光毒性の点で限界があります5。
ライトシート顕微鏡は、心臓の心室と心房にレーザーを素早く照射することで、これらの問題にうまく対処し、時空間分解能を高め、光退色や光毒性の影響を無視できる詳細な画像を実現する最先端のイメージング法です6,7,8,9,10,11。
このプロトコルは、LSMシステムの構築、4D画像再構築、3D細胞追跡、および複数の心臓周期12の間に心臓全体の心筋細胞の動態をキャプチャおよび分析するためのインタラクティブな分析を含む包括的なイメージング戦略を導入します。カスタマイズされたイメージングシステムと計算方法論により、トランスジェニック Tg(myl7:nucGFP) ゼブラフィッシュ幼生の心筋の微細構造と収縮機能を単一細胞レベルで追跡できます。さらに、低分子化合物をマイクロインジェクションを用いて胚に送達し、薬物誘発性心障害とその後の再生を評価しました。このホリスティックな戦略は、心臓の発生と再生における心筋の構造的、機能的、機械的特性を単一細胞レベルでin vivo で調査するためのエントリーポイントを提供します。

<table><tbody><tr><td>RESOURCE<</td><td>strong>SOURCE/Reference</td><td>IDENTIFIER</td><td></td></tr><tr><td>Animal models</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish</td><td>Burns Lab in Boston Children's Hospital</td><td>ZDB-TGCONSTRCT-070117-49</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェアとアルゴリズム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks Inc.</td><td>R2023a</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>ナショナルインスツルメンツコーポレーション</td><td>2017 SP1</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>浜松ホトニクス</td><td>4.6.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python Software Foundation</td><td>3.9.0</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>Schneider et al.18</td><td>1.54f</td><td></td></tr><tr><td>3DeeCellTracker</td><td>Chentao Wen et al.15</td><td>v0.5.2</td><td></td></tr><tr><td>ユニティ</td><td>・ユニティ・ソフトウェア株式会社</td><td>2020.3.2f1</td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2021.2</td><td></td></tr><tr><td>3Dスライサー</td><td>Andriy Fedorov et al.17</td><td>5.2.1</td><td></td></tr><tr><td>ITK SNAP</td><td>Paul A Yushkevich et al.16</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>Light-sheet system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cylindrical lens</td><td>Thorlabs</td><td>ACY254-050-A</td><td></td></tr><tr><td>4倍イルミネーション対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>MRH00045</td><td></td></tr><tr><td>20倍検出対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>1-U2M585</td><td></td></tr><tr><td>sCMOSカメラ</td><td>浜松</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>電動XYZステージ</td><td>Thorlabs</td><td>PT3/M-Z8</td><td></td></tr><tr><td>2軸チルトステージ</td><td>Thorlabs</td><td>GN2/M</td><td></td></tr><tr><td>回転ステッピングモーター</td><td>Pololu</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>蛍光ビーズ</td><td>Spherotech</td><td>FP-0556-2</td><td></td></tr><tr><td>473nm DPSS</td><td>レーザーLaserglow</td><td>R471003GX</td><td></td></tr><tr><td>532nm DPSS</td><td>レーザーLaserglow</td><td>R531003FX</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクターおよび真空ポンプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>WPI</td><td>PV850</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>ウェルチ</td><td>2522B-01</td><td></td></tr><tr><td>プルドガラスピペット</td><td>WPI</td><td>TIP10LT</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディング用キャピラリーチップ</td><td>バイオ・ラッド</td><td>2239912</td><td></td></tr><tr><td>バーチャルリアリティハードウェア</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VRヘッドセット</td><td>Meta</td><td>Quest 2</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>30mg/L PTUソリューション</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>1X E3 ワーキングソリューション</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr> <tr><td>1% アガロース</ストロング></td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr> <tr><td>低溶融アガロー</td>ス <td>サーモフィッシャー</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- <ストロング>10g/L トリカイン原液</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリカイン</td><td>シンデル</td><td>SYNC-M-GR-US02</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>150mg / Lトリカイン作業溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10g / Lトリカインストック溶液</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>脱イオン水</td><td></td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>60X E3 ストック溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>実験動物資源センター(LARC)、テキサス大学ダラス</td><td>校 NaCl</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>-</td><td>KCL</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>-</td><td>CaCL<サブ>2 </サブ>x 2H<サブ>2</サブ>O</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>-</td><td>MgSO4 x 7H2O</td><td></td></tr><tr><td>RO 水</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X E3 working solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60X E3 ストック ソリューション</td><td>ラボ アニマル リソース センター(LARC)、テキサス大学ダラス</td><td>校-</td><td></td></tr><tr><td>RO水</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>1%メチレンブルー(オプション)&nbsp;</td><td>●</td><td>C16H18ClN3S</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4dライトシートイメージング

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

ゼブラフィッシュは、その驚くべき心臓再生能力で知られる興味深いモデル生物です。収縮する心臓を in vivo で研究することは、損傷に応答する構造的および機能的変化に関する洞察を得るために不可欠です。しかし、ゼブラフィッシュの心臓の高解像度・高速4次元画像(4D、3D空間+1D時間)画像を取得し、心臓の構造や収縮性を評価することは依然として困難です。これに関連して、社内のライトシート顕微鏡(LSM)とカスタマイズされた計算分析を使用して、これらの技術的制限を克服します。LSMシステムの構築、レトロスペクティブ同期、シングルセルトラッキング、およびユーザー指向の解析を含むこの戦略により、トランスジェニック Tg(myl7:nucGFP) ゼブラフィッシュ幼生の単一細胞分解能で心臓全体の微細構造と収縮機能を調べることができます。さらに、低分子化合物のマイクロインジェクションをさらに取り入れて、正確かつ制御された方法で心臓障害を誘発することができます。全体として、このフレームワークにより、心臓の形態形成と再生中の単一細胞レベルでの生理学的および病態生理学的変化、および局所力学を追跡できます。

現在のプロトコルは、ゼブラフィッシュの調製とマイクロインジェクション、ライトシートイメージングと4D画像再構成、細胞追跡とVRインタラクションの3つの主要なステップで構成されています。ゼブラフィッシュの成体を交尾させ、受精卵を採取し、必要に応じてマイクロインジェクションを行い、実験を行いました(図1)。このステップは、心臓の発達と再生の研究におけるゼブラフィッシュの応用を探るための入り口となり、その後のイメージングと分析においても重要な役割を果たします。収縮する心臓は、特注のLSMシステムを使用してさまざまな段階(3 dpfから7 dpf)で画像化され、画像シーケンスをz軸に沿って位置合わせして、4Dゼブラフィッシュの心臓モデルを再構築しました(図2 および 図3)。これらのモデルは、深い表現型特性評価の基礎を提供し、発生タイムライン全体にわたる心臓の形態と機能のダイナミクスを明らかにする上で極めて重要です。ゼブラフィッシュの心臓の個々の細胞を追跡し、カスタマイズされたVRプラットフォームを使用して、その動きと相互作用を定量化しました。また、心房と心室の1回の心周期において、選択した細胞の速度と相対距離の変化を比較し、局所的な収縮性を評価し、局所的なひずみを調査しました(図4)。局所ひずみは、関心領域内の2つの隣接する心筋細胞間の変位の変動に基づいて決定されました。フラクショナルショートニング(FS)および駆出率(EF)は、公開された文献25に記載されている方法論を使用して推定されました。FS と EF の式は次のとおりです。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66263/66263eq01.jpg" style="margin: auto;">
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66263/66263eq02.jpg" style="margin: auto;">
ここで、Dd およびDs は、それぞれ拡張末期および収縮末期の心室径(異なる心室細胞間の距離によって測定される短軸)であり、Vd およびVs は、それぞれ拡張末期および収縮末期の心室容積(心室の長軸および短軸の直径によって計算される)である。
まとめると、これらの結果は、ゼブラフィッシュモデルにおける体積イメージングとデータ解釈を容易にするために生理学と工学の両方を統合した新しい戦略を示しており、心臓の形態形成と力学の探求を前進させる上で大きな期待を寄せています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66263/66263fig01.jpg"> 図1:ゼブラフィッシュの採卵とマイクロインジェクションのプロセス。 このプロセスには、成体のゼブラフィッシュを交配させ、受精卵を採取し、オプションのマイクロインジェクションを実行することが含まれます。マイクロインジェクションでは、事前に引き出されたガラスピペットに目的の材料が装填されます。受精卵は、アガロースモールドのスリット内に一列に並び、針に対して垂直に配置されます。マイクロインジェクションは、卵子と針先の両方を常に顕微鏡で観察して行います。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66263/66263fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66263/66236fig02v2.jpg"> 図2:ライトシートイメージングプロセスと4D画像再構成。 (A)自社ライトシートイメージングシステム構成の概略図。CL:シリンドリカルレンズ。EO:励起対物レンズ。DO:検出目標。TL:チューブレンズ。FL:フィルター。CAM:sCMOSカメラ。(B)FEPチューブに装着し、アガロースで包埋したゼブラフィッシュの模式図。(C)4 dpf のゼブラフィッシュの幼生からキャプチャされた生の 2D 画像シーケンス。各フレームの左上の時計は、収縮期末期から始まる心相を示します。(D)4Dゼブラフィッシュ画像レジストレーションのためのレトロスペクティブ同期の図。画像シーケンスは、z軸に沿った特定の深さでの連続記録を示します。画像シーケンスの各フレームは赤い点で表され、拡張末期から収縮期末までの開始段階と終了段階が黄色のボックスで強調表示されています。(E)2D画像シーケンスから4D再構成された心臓モデル。Dpf:受精後日数。この図は、Zhang et al.12 からの引用です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66263/66236fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66263/66263fig03.jpg"> 図3:LabVIEW制御パネル (A)コントロールパネルで使用される設定には、レーザー、カメラ、画像経路、およびモーターパターンの構成が含まれます。(B)LabVIEWプログラムで撮影したゼブラフィッシュの心臓の生画像の例。スケールバー:30 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66263/66263fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66263/66263fig04.jpg"> 図4:細胞追跡とVR相互作用は、ゼブラフィッシュの心臓の収縮性を明らかにするのに役立ちます。 (A)ゼブラフィッシュの心臓 Tg(myl7:nucGFP) の3 dpfで追跡した細胞。(B)VRプラットフォームは、4Dゼブラフィッシュの心臓モデルの没入型表示とインタラクティブな体験をユーザーに提供し、ユーザー定義の分析を通じて経時的な心臓機能を視覚化できるようにします。(C)VRプラットフォームから測定値を収集した後、3dpfと7dpfで選択した細胞間の1つの心臓周期中の速度と相対距離の変化を比較しました。最初の2つの図は、5つの心室細胞と5つの心房細胞の平均速度変化を示し、他の図は、3つの細胞群、すなわち、2つの心室細胞、心室細胞と心房細胞、および2つの心房細胞間の相対的な距離変化を示しています。(D)ゼブラフィッシュの心臓3dpfおよび7dpfの心機能評価。ゼブラフィッシュの心臓では合計370個の細胞を3 dpfで追跡し、580個の細胞を7 dpfで追跡しました。この図は、Zhang et al.12 からの引用です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66263/66263fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>名前</td>
			<td colspan="2">使い</td>
			<td>識別子</td>
		</tr><tr><td colspan="4">カスタマイズされたプログラムとアルゴリズム</td>
		</tr><tr><td>PSF.m(シーエフエム)</td>
			<td colspan="2">蛍光ビーズの半値幅測定結果からPSFを算出する。</td>
			<td>MATLABプログラム</td>
		</tr><tr><td>4Dゼブラフィッシュ Imaging.vi</td>
			<td colspan="2">LSM システム内のハードウェアを制御および同期します。</td>
			<td>LabVIEWプログラム</td>
		</tr><tr><td>test_Parallel.mなど</td>
			<td colspan="2">2D イメージ シーケンスから 4D イメージを再構成します。</td>
			<td>MATLABプログラム</td>
		</tr><tr><td>imageDimConverter.m (英語)</td>
			<td colspan="2">画像データをセルトラッキング用に指定した形式に変換すること。</td>
			<td>MATLABプログラム</td>
		</tr><tr><td>separateTrackingResults.py</td>
			<td colspan="2">同じラベルを持つ細胞を分離するための細胞追跡結果を後処理します。</td>
			<td>Pythonプログラム</td>
		</tr><tr><td>cellTracking_All.py</td>
			<td colspan="2">すべてのボリュームで一貫した画像強度を持つセルを選択します。</td>
			<td>Pythonプログラム</td>
		</tr><tr><td>cellLabelsToObj.ipynb</td>
			<td colspan="2">3D スライサーを使用して個々のセルのサーフェス メッシュを生成します。</td>
			<td>Pythonプログラム</td>
		</tr><tr><td>DynamicHeartModel.csなど</td>
			<td colspan="2">VR 環境を作成し、オブジェクトと対話します。</td>
			<td>C# プログラム</td>
		</tr><tr><td colspan="4">カスタマイズされたハードウェア設計</td>
		</tr><tr><td>3Dプリントされたサンプルチャンバー</td>
			<td colspan="2">水浸対物レンズで使用します。</td>
			<td>SolidWorksの設計</td>
		</tr><tr><td>3Dプリントしたサンプルホルダー</td>
			<td colspan="2">サンプルステージに適応し、サンプルを保持します。</td>
			<td>SolidWorksの設計</td>
		</tr></tbody></table>表 1: カスタマイズされたリソース テーブル。サンプルコードとデータがZenodo21にアップロードされます。

このプロトコルはゼブラフィッシュの幼虫の心臓収縮機能を調査し、細胞追跡および相互分析によって心臓力学に洞察を得るのにライトシートイメージ投射を利用する。

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

本研究では、4次元ライトシートイメージングを用いてゼブラフィッシュの心臓収縮機能を探索し、単一細胞レベルでの心臓収縮の動態の理解を目指しています。実験における最も重要な課題の1つは、自然な心拍リズムを観察しながら、高い空間末端分解能、心機能の動的イメージングを実現することです。私たちの研究は、複雑な4D心臓動態を単一細胞の分解能で解析する際のギャップを埋めるものです。GPUベースの並列計算、仮想現実、および高度な細胞追跡を利用して、ライトシートイメージングデータを解釈します。当社の斬新なバーチャルリアリティプラットフォームは、局所的な心臓収縮を評価するためのインタラクティブなアプローチを提供し、より詳細な分析のための操作機能を提供します。心臓収縮のユーザー主導の分析を容易にすることにより、私たちのプロトコルは心臓の発達と疾患の理解を深めることにつながる可能性があります。

4d-light-sheet-imaging-of-zebrafish-cardiac-contraction

Research

JoVE Journal

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ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

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