Name: 赤血球メカノセンシングを調査するための蛍光マイクロピペット吸引アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学ぶ蛍光マイクロピペット吸引法による赤血球のメカノセンシング機構。機械的ストレス下でのカルシウムイオン流入と細胞内シグナル伝達を可視化し、メカノバイオロジー研究の新たな知見を提供します。

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Nurul Aisha Zainal Abidin氏とLaura Moldovan氏には、追加のドナー募集、採血、瀉血のサポートに感謝します。機器と試薬を整理してくれたTomas Anderson氏とArian Nasser氏に感謝します。この研究は、オーストラリア研究評議会(ARC)のディスカバリープロジェクト(DP200101970-L)から資金提供を受けました。A.J.);オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)のアイデア助成金(APP2003904-L。A.J.);NHMRC機器助成金-LAJ;ニューサウスウェールズ州心臓血管能力開発プログラム(初期-中期キャリア研究者助成金-LAJ);NSW CVRN-VCCRI研究イノベーション助成金;Office of Global and Research Engagement(シドニー・グラスゴー・パートナーシップ・コラボレーション・アワード-L.A.J.);L.A.J.は、National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2(105863)およびSnow Medical Research Foundation Fellow(2022SF176)です。

このプロトコルは、シドニー大学のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従い、承認されています。この研究のドナーからインフォームドコンセントが得られました。
1. ヒト赤血球単離
注:ステップ1.1は、治験審査委員会によって承認されたプロトコルを使用して、訓練を受けた瀉血専門医が実行する必要があります。
<ol><li>19 Gのバタフライニードルを使用して、正中肘静脈から5 mLの血液を採取します。</li>
	<li>採取した血液を1:200のエノキサパリンを含む15mLチューブに移し、凝固を防ぎます。</li>
	<li>5 μL のエノキサパリン抗凝固血液を 1 mL の炭酸塩/重炭酸塩緩衝液 (C 緩衝液、pH = 8.5-9; Table of Materialsを参照)。</li>
	<li>希釈した血液サンプルを900 × g で1分間遠心分離し、赤血球を沈殿させます。</li>
	<li>RBCペレットを1 mLのCバッファー(材料表)で2回洗浄し、毎回900 × g で1分間遠心分離します。</li>
	<li>続いて、同じ遠心分離条件で RBC ペレットを 1 mL の Tyrode バッファーで 2 回洗浄し、最終ペレットを 1 mL の Tyrode バッファーに再懸濁して、洗浄したストック RBC 懸濁液を得ます。</li>
</ol>2.カルシウムインジケーターのローディング
<ol><li>自動セルカウンター(材料表)を使用して得られた細胞数に基づいて、洗浄したストックRBC溶液の濃度をTyrodeの緩衝液中で10×106 cells/mLに調整します。</li>
	<li>カルシウム感受性色素である16.67 μM Cal-520 AMとインキュベートし、ロータリーチューブミキサーで1時間撹拌することにより、赤血球内のカルシウムを標識します。</li>
	<li>赤血球を0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むチロードの緩衝液で1:50の比率で希釈します。これで、細胞を実験的に使用する準備が整いました。</li>
</ol>3. マイクロピペットの作製
<ol><li>ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ(外径1mm×内径0.6mm)をP-1000マイクロピペットプーラーに取り付け、プリセットのプルプログラムを使用して、プル部位で先端が閉じた対応するマイクロピペットを2本作製します。このセットアップでは、熱 516、引張 150、速度 75、時間 250、圧力 500 のプル プログラム値を使用します。 注:引っ張りプログラムで設定された加熱および引っ張りパラメータはカスタマイズ可能であり、実験計画12の所望の設定に依存する。 CHECKPOINT ( 補足表 S1 を参照)。</li>
	<li>マイクロピペットカッターに引っ張った後に調達したクローズエンドのマイクロピペットの1つを取り付けて、閉じたチップを開きます。加熱温度を約50〜60°Cに調整します。</li>
	<li>10倍接眼レンズを使用してマイクロピペットの位置を確認します。マイクロピペットをホウケイ酸ガラスビーズに近づけて、ノブを使って調整します。</li>
	<li>接眼レンズを30倍に交換してから、ピペットの先端を曲げずにマイクロピペットをホウケイ酸ガラスビーズにできるだけ近づけます。</li>
	<li>加熱ペダルを踏んで、熱を使用してホウケイ酸ガラスビーズを柔らかくします。未加工の閉じたマイクロピペットチップを、目的の終点である開口部の直径に達するまで、柔らかくしたビーズにそっと挿入します。</li>
	<li>フットペダルを放し、ガラスビーズを冷まします。マイクロピペットの先端が常にビーズの内側に残っていることを確認してください。 注意: チップをさらに挿入すると、開口部の直径が大きくなります。</li>
	<li>マイクロピペットを静かに引き抜くと、閉じたマイクロピペットがまっすぐに切り取られます。キャピラリーの最終直径が1μmであることを確認します。 注: チェックポイント ( 補足表S1を参照)</li>
</ol>4. 細胞室の準備
<ol><li>ダイヤモンドペンシルを使用して、標準的な40 mm x 22 mm x 0.17 mmのガラスカバーガラスを3等分します。</li>
	<li>カットしたガラスカバーガラスの1枚を、自家製のチャンバーホルダーの底に真空グリースで接着します。 注意: チャンバーホルダーは、湾曲したハンドルでリンクされた2つの金属(銅/アルミニウム)の正方形で構成されています。金属ブロック間の距離は、カットカバーガラスがホルダーに付着して平行チャンバーを形成するために40mm未満に及ぶ必要があります。</li>
	<li>カットしたガラスカバーガラスの2枚目を、自家製のチャンバーホルダーの上部に真空グリースで接着します。 注: チェックポイント ( 補足表S1を参照)</li>
	<li>200 μLのピペットガンを使用して、200 μLの標識RBC懸濁液を2枚のカバーガラスの間に注入します(図1)。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig01.jpg"> 図1:細胞室の図。 40 mm x 22 mm x 0.17 mmのガラスカバースリップの2つのカットピースをグリースを使用してチャンバーホルダーに接着します。2枚のカットガラスカバーガラスの間に、Tyrodeの緩衝液中の約200 μLの細胞溶液を播種します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
5. マイクロピペット吸引アセンブリ
<ol><li>細胞チャンバーを顕微鏡プラットフォームにあるホルダーステージに取り付けます。細胞室が対物レンズの真上になるように位置を調整します(図2B)。</li>
	<li>マイクロピペットホルダーを、接続されている貯水槽の液面より下まで下げます。</li>
	<li>脱塩水またはTyrodeの緩衝液を作製したマイクロピペットに注入し、34 Gの針と組み合わせたシリンジを使用して、すべての気泡を慎重に除去します(材料表を参照)。</li>
	<li>マイクロピペットホルダーの端を半分ほど緩め、マイクロピペットホルダーから数秒間水が滴り落ちるのを待ちます。 注: チェックポイント ( 補足表S1を参照)</li>
	<li>マイクロピペットをホルダーチップに挿入します。ホルダーのネジを締めて、マイクロピペットが固定されていることを確認します。</li>
	<li>マイクロピペットを細胞チャンバーに挿入し、顕微鏡下でマイクロピペットと赤血球の位置を確認します。マイクロマニピュレーターを使用して位置を調整します。</li>
	<li>マイクロピペットチップをさらに下げて、チップが配置されたRBCと水平になるようにします。 注: チェックポイント ( 補足表S1を参照)</li>
	<li>貯水槽の高さを調整して、マイクロピペットチップの油圧をゼロにします。次に、貯水槽を少し上げて、先端に微妙な陽圧を発生させます。</li>
</ol>6. 蛍光結合マイクロピペット吸引アッセイの実施
<ol><li>488 nmの蛍光励起光源をオンにします。この段階では、光退色を避けるために蛍光シャッターをオンにしないでください(図2C)。蛍光カメラと透過カメラの電源を入れます。 注意: 両方のカメラは、適切なソフトウェアを使用して操作されます( 材料表を参照)。</li>
	<li>ソフトウェアで、両方のカメラに必要な 露光時間 (この研究では両方のカメラで100ミリ秒 )、関心領域(ROI)、ビニングサイズ(この研究ではなし)を設定します。 多次元取得パネル を開き 、取得フレーム番号(このスタディでは2,000)、および保存ディレクトリを設定します。 注:アクイジションフレーム番号は、記録する吸引イベントの数によって異なります。1つの吸引イベントの場合、取得数の範囲は100〜500、つまり約10〜50秒の範囲で設定する必要があります。</li>
	<li>マイクロマニピュレーターを使用して、視野の下にあるマイクロピペットを見つけます。</li>
	<li>コントロールボックスとクランプシステムを含む空気圧クランプをオンにします(図2A)。 コントロールボックス が EXTRNLモードになっていることを確認してください。ノブをゆっくりと回転させることにより、システム内のオフセット圧力を補正します。</li>
	<li>空気圧クランプを制御する別のソフトウェアをオンにします。このソフトウェアには、クランプシステムへのディスクリートアナログ入力を制御するための電気制御パネルがあります。圧力は20mV/mmHgの変換係数で制御されます。</li>
	<li>システム内の圧力をゼロにします。マイクロピペットを慎重に赤血球に近づけ、マイクロピペットの先端に微妙な陽圧がかかるまで貯水池の位置を調整します。</li>
	<li>カメラ操作ソフトウェアで撮影を開始します。 蛍光シャッターのスイッチを入れます。</li>
	<li>計算した電圧の大きさをコントロールパネルに入力してRBCを吸引し、目的の圧力に到達します。 注:RBCを吸引するための圧力は、通常、Δp = -5〜-40mmHg の範囲です。マイクロピペットチップ内に顕著な舌の伸びがあるはずです(図2D)。</li>
	<li>あらかじめ設定された期間、圧力を保持します。次に、圧力を解放します。</li>
	<li>マイクロピペットを動かして次の細胞を拾い上げ、実験を繰り返します。</li>
</ol>7. 蛍光強度分析
<ol><li>保存した蛍光画像を解析ソフトウェアに読み込みます。</li>
	<li>ディスプレイ調整タブを使用して、強度しきい値を調整します。これを行うには、値を手動で入力するか、スライダーを使用して、解析ソフトウェアで蛍光画像に細胞の明確なコントラストが表示されるようにします(補足ファイル1-補足図S1を参照)。</li>
	<li>ソフトウェアの下部にあるタイムラインまでスクロールします。指定されたアスピレーションイベントを見つけます。</li>
	<li>Add new surfacesをクリックします。解析 ROI を定義します。 メモ: このソフトウェアでは、セグメンテーションを調整して完了するためのガイド付きの 5 ステップのプロセスが用意されています( 補足ファイル 1 - 補足図 S2 および補足 図 S3 を参照)。 注: 計算リソースを節約するために、ROI をできるだけ小さくしてください。</li>
	<li>背景の減算スライダーを使用し、スライダーを使用してセグメンテーションの閾値を調整し、最適なセグメンテーション結果を得ることができます。 注:これは、吸引イベントとは別に、背景を可能な限り正確にセグメント化する必要があることを意味します( 補足ファイル1-補足図S4 および 補足図S5を参照)。</li>
	<li>バックグラウンドノイズを除外する エリア フィルターを追加します( 補足ファイル1-補足図S6を参照)。 注: これは、ポスト プロセスの段階で完了します。</li>
	<li>[統計情報] タブを選択します。 |詳細タブ |「平均値」タブ。スクロールして強度平均を見つけて選択します(補足ファイル1-補足図S7を参照)。</li>
	<li>経時的な蛍光シグナルトレースを.csvファイルにエクスポートします。</li>
	<li>エクスポートした csv ファイルを開きます。すべての測定値からバックグラウンド信号 Fb を減算します。</li>
	<li>式(1)を使用して、カルシウム強度の変化ΔFmaxを計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66265/66265eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 但し、ΔFmaxは最大カルシウム強度変化量、FBはバックグラウンド強度、F0は静止強度である。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig02.jpg"> 図2:蛍光結合マイクロピペット吸引アセンブリ。 (A)倒立顕微鏡と明視野カメラおよび蛍光カメラを組み合わせたfMPAハードウェアシステムの概要。画像の左側は、自家製の水圧計と、空気圧ポンプの圧力を正確に調整できるコントロールボックスを示しています。(B)1本のマイクロピペットで実験細胞室とマイクロマニピュレーターシステムを描いた顕微鏡ステージ。(C) fMPAシステムのセットアップの概略図。2つのダイクロイックミラーを使用して明視野(黄色)と蛍光(青色発光、緑色励起)信号を同時にイメージングし、蛍光光源(青)からターゲットに光路を導き、次にイメージング用のカメラ(緑)に光路を向けます。(D)上段は明視野画像、下段は蛍光画像です。左は、赤血球が安静時の吸引前のマイクロピペットの位置です。中央の列は、赤血球が-40 mmHgの陰圧を受ける吸引プロセスのスナップショットです。右図は、負の吸引圧を受けた後の細胞の形態を示しています。スケールバー = 5 μm。略語: fMPA = Fluorescence-coupled Micropipette Aspiration;DM = ダイクロイックミラー;RBC = 赤血球。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

蛍光マイクロピペット吸引を用いたシングルセルメカノバイオロジー

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</ol>

著者らは、本研究に関して報告する競合する利害関係がないことを宣言する。

マイクロピペット吸引アッセイは、細胞バイオメカニクスの深遠な複雑さを探るために、実質的な圧力調節、正確な空間オーケストレーション、信頼性の高い時間的識別力を駆使して、洗練された方法論を具現化しています。この研究は、さまざまな刺激下で赤血球が示す微妙な機械感受性反応を明らかにするための重要なツールとしてのfMPAの適用に特に重点を置きます。明視野信号と蛍光信号を同時に使用することで、細胞現象の多面的な調査が可能になり、細胞内カルシウム流入のリアルタイムでのモニタリングと検出が進みました。このアプローチは、赤血球の複雑なメカノセンシング反応に関する統合的な洞察を提供します。
重要なことは、fMPA技術の適用性は、血小板やニューロンなど、高い機械的感受性を欠く他の細胞タイプにも適用できるため、RBCにとどまらないことです9。さらに、fMPAは、実験中の細胞の完全性への影響が最小限に抑えられるため、細胞の自然な状態の維持を保証し、初代細胞での使用に非常に適しています1。さらに、fMPA法は、マイクロピペットの形状を調整できるため、特定の研究課題に合わせた幅広い実験計画や、さまざまな機械的条件の効果的な探索が可能になります。
さらに、多蛍光イメージングの同時使用を強化する光経路の改善により、fMPAシステムは吸引時の細胞内カルシウム濃度のリアルタイム検出を可能にします。この能力は、外部環境からの機械的手がかりを媒介し、知覚することが示されている機械感受性イオンチャネルPIEZO1などのカルシウム関連分子を探索する機会を開きます7,14。最近の文献では、膜張力の上昇がPIEZO1チャネル活性を刺激し、その後Ca2+の流入を促進する重要な要因であることが強調されています6。これは、膜張力、PIEZO1、カルシウム流入の相互作用を研究し、細胞内の複雑なメカノセンシングプロセスに光を当てるというfMPAの重要な用途を強調しています。
技術的な観点からは、吸引力(機械的刺激)の生成とリアルタイムの蛍光イメージングを行うfMPAシステムの2つの主要コンポーネントは、それぞれ空気圧ポンプと蛍光カメラであることに言及する価値があります。システムに適したポンプとカメラの選択は、研究中の特定の細胞タイプと生物学的プロセスに基づいて行う必要があります。当社のシステムに採用されているポンプは、定常状態の圧力範囲±200mmHgで動作し、±200mmHgの圧力変化のコマンドに応答できます。圧力上昇時間と下降時間は、6 mmHgステップで8〜20 ms、200 mmHgステップで15〜20 msを超えてはなりません。力の分解能を確保するには、HSPCシステムのノイズレベルをピークtoピークで±0.5mmHg未満にする必要があります。これらの要件は、このセットアップに適用されます。しかしながら、40mmHg±の範囲は、実験プロトコル15に対する応答を達成するのに十分である。蛍光カメラについては、量子効率95%、画素サイズ11μm×11μmのチップを採用しました。この高感度センサー構成により、蛍光シグナルを高速で効率的に捕捉します。さらに、イメージング中に適切なS/N比を得るためには、読み取りノイズの中央値を1.6e- に維持することが重要です16。
手続きの観点から見ると、fMPAの実行には一連の高度なスキルが必要です。例えば、マイクロピペットカッターを使ったマイクロピペットの製作には、精度と器用さが求められるほか、温度や位置決めの細心の制御も求められます。マイクロピペットを顕微鏡の視野内に配置するには、マイクロピペットの先端と細胞チャンバーの両方に損傷を与えないように細心の注意を払う必要があります。さらに、蛍光イメージングに関連する一般的な課題の1つは、光退色です。この問題を軽減するには、照明システムへのサンプルの露光時間を最小限に抑えることが重要です。「蛍光結合マイクロピペット吸引アッセイ」プロトコルでは、すべてのパラメータがカメラ操作ソフトウェアを介して入力され、吸引システムが実験の準備が整うまで、励起光源の蛍光シャッターはオフのままになります。その後、蛍光シャッターをオンにしてイメージングを開始します。光退色をさらに低減するには、サンプル中に十分な蛍光発現が得られる最小の光源強度を使用することをお勧めします。
さらに、fMPAアッセイには現在手作業が必要なため、この手法は労働集約的です。その結果、このアッセイで発生する可能性のある不整合は、主にオペレーターに依存する変数、およびフィラメントの予熱とキャピラリーガラス特性の変動に関連する要因に起因します。将来的には、この手法のパフォーマンスを最適化するために、潜在的なタンデム実装を検討する必要があります。例えば、マイクロ流体デバイスと組み合わせると、マイクロピペット吸引をハイスループットプラットフォームに変えることができ、実験速度を毎時約20細胞から約1,000細胞/時間に大幅に向上させることができます17,18。この組み込みにより、データの再現性も向上します。さらに、自動化および画像解析システム19を組み込むことによって、特定の手段が首尾よく探求されてきた。特に、有限要素解析(FEA)は、マイクロピペット吸引アッセイのモデル化に一般的に使用される計算ツールです。FEAは、機械的刺激に対する細胞の応答を予測し、その機械的特性を特徴付けることができます。マイクロピペットの設計を最適化し、実験結果をさらに検証する可能性を秘めています19。
結論として、fMPAアプローチは、機械的刺激に応答する赤血球の機械感受性行動に関する貴重な洞察を提供します。この研究は、赤血球内およびより広範な生物学的システムにわたるメカノトランスダクションの複雑なメカニズムに関する将来の研究のための基礎的な枠組みを確立します。このような研究は、これらのメカニズムの理解を深め、さまざまな生理学的状況における広範な意味を解明する上で大きな期待を寄せています。

細胞挙動の世界で次々と発見が明らかになり、接着、移動、分化などの動的な細胞活動を決定する上で、張力、流体せん断応力、圧縮、基質の剛性などの機械的刺激が果たす役割が強調されています。これらの機械生物学的側面は、細胞が生理学的環境とどのように相互作用し、応答し、さまざまな生物学的プロセスに影響を与えるかを解明する上で最も重要です1,2。
過去10年間、マイクロピペットベースの吸引アッセイは、機械的刺激に対する多様な細胞応答を研究するための汎用性の高いツールとして際立っています。この手法は、細胞の弾性率、剛性、皮質張力など、単一細胞レベルでの生細胞の本質的な機械的特性に関する貴重な洞察を提供します。これらのアッセイにより、細胞膜の張力、細胞膜にかかる圧力、皮質の張力など、さまざまな機械的パラメータを測定できます(表1に要約)。野心的な力を研究することで、特に断片化、伸長、出芽などの膜動態の領域において、それらが細胞の機能とプロセスにどのように影響するかについての理解が深まりました3,4。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>機械的パラメータ</td>
			<td>形容</td>
			<td>独創的なアプローチ</td>
		</tr><tr><td>セルの剛性(Cell Stiffness)</td>
			<td>細胞の機械的剛性と弾性の測定。</td>
			<td>細胞膜の吸引と陰圧に対する変形応答の解析20,21.</td>
		</tr><tr><td>接着強度</td>
			<td>細胞が表面にどれだけ強く接着するかの評価。</td>
			<td>付着した細胞を基質から剥離するための制御された吸引の適用2,22。</td>
		</tr><tr><td>膜張力</td>
			<td>細胞膜内の張力またはストレスの評価。</td>
			<td>加えられた圧力23,24に応答する膜変形の測定。</td>
		</tr><tr><td>粘 弾性</td>
			<td>細胞の粘性と弾性を組み合わせた挙動の特性評価。</td>
			<td>吸引に対する時間依存変形応答の解析23,25.</td>
		</tr><tr><td>変形 能</td>
			<td>細胞の形状がどれだけ簡単に変化できるかの決定。</td>
			<td>制御された吸引下での変形の程度の評価20,24。</td>
		</tr><tr><td>表面張力</td>
			<td>細胞表面の張力の測定。</td>
			<td>マイクロピペット膜突起部26を形成するのに必要な圧力の評価。</td>
		</tr><tr><td>細胞-材料相互作用</td>
			<td>細胞と材料または基質との相互作用の研究。</td>
			<td>異種物質と接触する細胞の吸引と相互作用の観察2,24.</td>
		</tr><tr><td>細胞間相互作用</td>
			<td>隣接細胞間の相互作用の検討</td>
			<td>細胞群の吸引と細胞間力の解析27.</td>
		</tr></tbody></table>表1:マイクロピペット吸引アッセイによって特徴付けられる機械的パラメータ。
マイクロピペットベースの吸引技術は、赤血球(RBC)の研究に広く使用されており、循環器系における赤血球の機能を理解するために不可欠な赤血球の変形性やさまざまな機械的特性を評価しています。赤血球は驚くべき適応性を示し、複雑な毛細血管ネットワークや内皮間裂を通過する際の変形に対する機械的汎用性を維持します5,6。この旅の間、赤血球は0.5〜1.0μmの狭い通路を横断しなければならず、引張や圧縮7,8,9を含む多数の機械的力にさらされます。また、循環中の血流によって発生するせん断応力に対しても高い感度を有する10。これらのプロセスは、機械的刺激に対する細胞応答において確立された役割を持つ重要なシグナル伝達イベントであるカルシウム流入を含む調節メカニズムの活性化を促進します11,12。カルシウムを介したメカノセンシングを支配する複雑なメカニズムは、現在進行中の研究の魅力的なテーマです。
これに関連して、fMPAは、精密に制御された機械的力の下でのカルシウム動員の程度を明らかにするための効果的なアプローチであり、機械的調節(マイクロピペット吸引システムを使用)とカルシウム強度の視覚化(蛍光インジケーターを使用)を同時に適用できます。特に、赤血球が狭窄した血管を通って移動する生理学的シナリオを模倣しています。特筆すべきは、当社が開発したfMPAシステムが1mmHgの分解能で圧力を発生させることです。実装された高速度カメラは、100msの時間分解能とサブミクロンメートルレベルの空間分解能を実現できます。これらの構成により、生細胞に機械的力を正確に適用し、同時に結果として生じる細胞シグナル伝達を捕捉することができます。さらに、このセットアップの統合的工学的性質により、マイクロピペット吸引アッセイは他の機器や技術を補完するために容易に適応することができ、細胞力学の複雑さをさらに探求することができます。この汎用性は、このアプローチのさらなる利点です。

<table><tbody><tr><td>&マイクロ;Manager</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>Version 2.0.0</td></tr><tr><td>1 mLシリンジ&nbsp;</td><td>テルモ</td><td>210320D</td><td>マイクロフィルに協力する&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &micro;Lピペット&nbsp;</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>3123000055</td><td>レッドクロードセル調製</td></tr><tr><td>22 x 40 mm カバースリップ</td><td>ニットガラス&nbsp;</td><td>MS0014</td><td>セルチャンバーアセンブリ</td></tr><tr><td>50 mL シリンジ&nbsp;</td><td>テルモ</td><td>220617E</td><td>給水塔に接続する</td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Tryode's&nbsp; バッファー調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および 5.5 mM D-グルコースに 1 mM CaCl2.最終pH = 7.2</td></tr><tr><td>遠心分離機 5425</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>5405000280</td><td>レッドクロード細胞製剤</td></tr><tr><td>クレキサン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1235820</td><td>採取した血液の凝固を防ぐため 10,000 U/mL</td></tr><tr><td>DAQami</td><td>勤勉な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光光源</td><td>CoolLED</td><td>pE-300</td><td>マイクロピペット吸引ハードウェアシステム</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>成重</td><td>G-1</td><td>マイクロピペット製造</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Tryode's&nbsp; バッファー調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および 5.5 mM D-グルコースに 1 mM CaCl2 を補給。最終pH = 7.2</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Tryode's&nbsp;緩衝液調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および5.5 mM D-グルコースに1 mM CaCl2を補給。最終pH = 7.2</td></tr><tr><td>高速GigEカメラ</td><td>Manta</td><td>G-040B</td><td>マイクロピペット吸引ハードウェアシステム</td></tr><tr><td>高速圧力クランプ</td><td>科学機器</td><td>HSPC-2-SB</td><td>圧力ポンプと協力</td></tr><tr><td>高速圧力クランプヘッドステージ&nbsp;</td><td>科学機器</td><td>HSPC-2-SB</td><td>圧力ポンプと協力</td></tr>する <tr><td>イマリス</td><td>・オックスフォード・インスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td>オリンパスIX83</td><td>マイクロピペット吸引ハードウェアシステム</td></tr><tr><td>Microfil&nbsp;</td><td>世界の精密機器&nbsp;</td><td>MF34G-5</td><td>34 G (67 mm Long) 切断したマイクロピペット内の気泡を回収し、ピペットチップの開口部をテストします&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー&nbsp;</td><td>サッター機器</td><td>P1000</td><td>マイクロピペット製造&nbsp;</td></tr><tr><td>Milli Q EQ 7000 超純水製造装置</td><td>Merck Millipore</td><td>ZEQ7000T0C</td><td>炭酸塩/重炭酸塩バッファー &Tryodeのバッファー調製</td></tr><tr><td>ピペットマイクロフォージ&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>マイクロピペット製造</td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Tryode's&nbsp;バッファー調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および5.5 mM D-グルコースに1 mM CaCl2を補給。最終pH = 7.2</td></tr><tr><td>Pressue Pump&nbsp;</td><td>科学機器</td><td>PV-PUMP</td><td>は、実験中に制御された圧力を誘導します</td></tr><tr><td>Prime 95Bカメラ&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95B sCMOS</td><td>Flourscent イメージング</td></tr><tr><td>ロータリーホイール リモートユニット&nbsp;</td><td>センサペックス&nbsp;</td><td>uM-RM3</td><td>マイクロピペット位置調整用コントロールパネル&nbsp;</td></tr><tr><td>Scepter 3.0 Handheld Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC340KIT</td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>炭酸塩/重炭酸塩緩衝液調製 - 2.65 g の NaHCO3 と 2.1 g の Na2</sub<><>> と 250 mL の Mili Q 水 - 最終 pH = 8-9。</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>炭酸塩/重炭酸塩緩衝液調製 - 2.65 g の NaHCO3 と 2.1 g の Na2CO3 を 250 mL の Mili Q 水に溶かして - 最終 pH = 8-9。</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Tryode's&nbsp;緩衝液調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および5.5 mM D-グルコースに1 mM CaCl2を補給。最終pH = 7.2</td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム一塩基 一水和物(NaH2PO4&bull;H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Tryode's&nbsp; バッファー調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および 5.5 mM D-グルコースに 1 mM CaCl2.最終pH = 7.2</td></tr><tr><td>タッチスクリーンコントロールユニット&nbsp;</td><td>センサペックス&nbsp;</td><td>uM-TSC</td><td>マイクロピペットの位置調整用コントロールパネル&nbsp;</td></tr><tr><td>Xドライ対物レンズ&nbsp;</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td>オリンパス 60x/0.70 LUCPlanFL</td><td>マイクロピペット吸引ハードウェアシステム</td></tr></tbody></table>

赤血球メカノセンシングを調査するための蛍光マイクロピペット吸引アッセイ

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

マイクロピペット吸引アッセイは、長い間、生細胞力学の研究の基礎となっており、機械的ストレスに対する細胞の応答に関する洞察を提供してきました。この論文では、蛍光結合マイクロピペット吸引(fMPA)アッセイの革新的な適応について詳しく説明します。fMPAアッセイは、イオンチャネルによって媒介される生細胞のメカノトランスダクションプロセスを同時にモニタリングしながら、正確な機械的力を投与する機能を導入します。洗練されたセットアップには、精密に設計されたホウケイ酸ガラス製マイクロピペットが、細かく調整された貯水槽と空気圧吸引システムに接続されており、1mmHg±まで細かく刻みで制御された圧力適用を容易にします。重要な機能強化は、落射蛍光イメージングの統合であり、吸引中の細胞形態学的変化と細胞内カルシウムフラックスの同時観察と定量化を可能にします。fMPAアッセイは、落射蛍光イメージングとマイクロピペット吸引の相乗的な組み合わせにより、機械的に困難な環境下での細胞メカノセンシングの研究に新たな基準を打ち立てます。この多面的なアプローチは、さまざまな実験設定に適応可能であり、シングルセルのメカノセンシングメカニズムに関する重要な洞察を提供します。

マイクロピペット吸引アッセイを確立するために、まず、ハンドルで接続された2つの金属製の正方形(銅/アルミニウム)で構成されるカスタムセルチャンバーを構築しました。2枚の3次カットガラスカバーガラス(40 mm × 7 mm × 0.17 mm)を貼り付けて、Tyrodeの緩衝液に懸濁した200 μLの赤血球で満たされたチャンバーを作成しました。赤血球をチャンバーに導入した後、テーラードホウケイ酸マイクロピペットをホルダーに固定し、マイクロマニピュレーターを使用してチャンバー内に慎重に配置しました。続いて、マイクロピペットを近づけて、ターゲットの赤血球を捕捉しました。
細胞吸引では、空気圧式高速圧力クランプを使用して負の吸引圧力を微調整しました。次に、さまざまな負の吸引圧を適用した場合のカルシウムの動員を調べるために、蛍光イメージングを実施しました。
fMPAを用いて、赤血球がさまざまな負圧吸引にどのように反応するかを調べることで、加えられた陰圧と吸引された赤血球に存在するカルシウム流入の間には明確な比例関係があることが明らかになりました。カルシウム強度変化を求めるために、単一吸引細胞の最大強度(Fmax)からバックグラウンド強度(Fb)を差し引いたものを、静止強度(F0)からFbを引いた値で除算した。圧力を-10 mmHg(図3A)から-40 mmHg(図3D)の間で段階的に上昇させると、赤血球へのカルシウムイオンの流入がそれに応じて増加しました。このことは、赤血球がその機械的変化を感知し、急速なカルシウム特異的チャネル活性によって応答する能力を持っていることを示唆している14,15。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig03.jpg"> 図3:正規化された強度の経時変化をグラフで表現した蛍光イメージング。 横に横に、安静時の赤血球(左)とマイクロピペットで吸引されているヒト赤血球(中央)の蛍光スナップショットを示しています。複数の負の吸引圧力(Δp)で吸引されている赤血球の代表的な痕跡が右側に見られます。負の吸引圧は、(A) Δp = -10 mmHg、(B)Δp = -20 mmHg、(C)Δp = -30 mmHg、および(D)Δp = -40 mmHgから段階的に増加します。吸引中に赤血球の舌が伸びると、Cal-520 AMの倍率変化の増加によって示されるように、有意なカルシウム動員が観察されます。 F/F0 を使用して、吸引された赤血球内のカルシウム動員を調査しました。上記の曲線から、観測された傾向は、Cal-520 AM信号が印加された負の吸引圧力の増加に比例して増加することを示しています。スケールバー = 5 μm。略語:RBCs = 赤血球。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足表S1:fMPA調製プロトコルの重要なステップのチェックポイント。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supplementary%20File%20-%20Table%20S1%20-%20JoVE.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1: セグメンテーションを調整して実行するためのガイド付きプロセス。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supp%20File%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

機械的ストレス下での細胞の挙動の探索は、細胞力学とメカノバイオロジーの進歩にとって極めて重要です。蛍光マイクロピペット吸引(fMPA)技術は、制御された機械的刺激と単一細胞における細胞内シグナル伝達の包括的な解析を組み合わせた新しい方法です。この手法は、生細胞メカノバイオロジーの新しい詳細な研究を調査します。

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to ...

私たちの研究の範囲は、ライフスタイルメカノバイオロジー、特に機械的ストレスがかかる細胞の挙動に向けられています。私たちは、単一細胞における細胞内シグナル伝達について研究しています。提案されたFMPAシステムは、機械的刺激と組み合わせた蛍光イメージングを利用します。つまり、吸引圧です。現在、マイクロ流体工学や画像解析ソフトウェアなど、2つ以上の技術をマイクロ吸引セットアップと組み合わせようとするさらなる進歩があります。現在の実験上の課題は、セットアップが非常に労働集約的であり、オペレーターに依存するという事実にあります。システムは手動で操作されるため、特定のステップで不整合が生じます。たとえば、フィラメントの予熱。研究の結果、圧力をマイナス10ミリメートルの水銀からマイナス40ミリメートルの水銀まで徐々に上昇させると、赤血球へのカルシウムイオンの流入が対応する形で増加することが実証されました。このことは、赤血球が機械的環境の変化を感知し、カルシウム関連のチャネル活性を急速に高めることで応答する能力を持っていることを示唆しています。この研究は、さまざまな刺激下で赤血球によって示される微妙な機械感受性反応を明らかにするための重要なツールとしてのFMPAの適用に特に重点を置きます。

fluorescence-micropipette-aspiration-assay-to-investigate-red-blood

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 -...

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

ここでは、セルの剛性を測定するために迅速かつ簡単な方法を説明します。このアプローチの一般的な原則は、細胞表面にマイクロピペットを介して適用、明確に定義された負圧に応答して膜の変形を測定することです。この方法は、基板に接続された細胞の生体力学的特性を研究するための強力なツールを提供します。...

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メカノノードポアセンシング:マルチパラメータシングルセル粘弾性測定のための迅速でラベルフリーのプラットフォーム

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光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

学ぶ蛍光マイクロピペット吸引法による赤血球のメカノセンシング機構。機械的ストレス下でのカルシウムイオン流入と細胞内シグナル伝達を可視化し、メカノバイオロジー研究の新たな知見を提供します。

赤血球メカノセンシングを調査するための蛍光マイクロピペット吸引アッセイ

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