Name: アカントアメーバ属の定量化運動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶ アカントアメーバの運動定量化法。顕微鏡と高コンテンツ画像解析を用いてアカントアメーバの運動を可視化・追跡し、アカントアメーバ角膜炎の理解とコンタクトレンズ衛生管理の改善に貢献する。

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<meta charset="utf8"></head><body>アカントアメーバ種の運動性の長期追跡と定量化

<ol><li>Randag, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rising+incidence+of+Acanthamoeba+keratitis%3A+A+7-year+nationwide+survey+and+clinical+assessment+of+risk+factors+and+functional+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes.</a> PLoS One. 14 (9), e0222092(2019).</li>
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<li>Rudell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+migration+in+an+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba migration in an electric field.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (6), 4225-4233 (2013).</li>
<li>Fukaya, S., Aoki, K., Kobayashi, M., Takemura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+the+motility+of+giant+virus-infected+amoebae+using+phase-contrast+microscopic+images%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of the motility of giant virus-infected amoebae using phase-contrast microscopic images.</a> Front Microbiol. 10, 3014(2019).</li>
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<li>Piltti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+time-lapse+imaging+and+single-cell+tracking+of+in+vitro+cultured+neural+stem+cells+-+Tools+for+analyzing+dynamics+of+cell+cycle%2C+migration%2C+and+lineage+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells - Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection.</a> Methods. 133, 81-90 (2018).</li>
<li>Campolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+real-time+motility+analysis+of+Acanthamoeba+reveals+sustained+movement+in+absence+of+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients.</a> Pathogens. 10 (8), 995(2021).</li>
<li>Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+recovery+of+Acanthamoeba+motility+among+surviving+organisms+after+contact+lens+care+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection.</a> Microorganisms. 11 (2), 299(2023).</li>
<li>Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+affecting+the+recovery+of+Acanthamoeba+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites.</a> Pathogens. 10 (2), 221(2021).</li>
<li>imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started">https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started</a> (2024).</li>
<li>Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Gaussianity%2C+population+heterogeneity%2C+and+transient+superdiffusion+in+the+spreading+dynamics+of+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells.</a> Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&frac14;リンガー'ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>BR0052G</td><td>Oxoid Ringers Solution Tablets の溶液。指示に従って、全強度のリンガーではなく4分の1の強度にします。&nbsp;</td></tr><tr><td>10 &micro;Lピペット</td><td>Eppendorf Research</td><td>3123000039</td><td>2 &micro;L-20 &マイクロ;Lシングルチャンネル</td></tr><tr><td>10 & マイクロ;Lピペットチップ</td><td>ネプチューンサイエンティフィック、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国</td><td>BT10.N</td><td>10 & マイクロ;L ユニバーサル バリア チップ</td></tr><tr><td>48 ウェル プレート</td><td>ミリポア シグマ,&nbsp;</td><td>CLS3548</td><td>Corning Costar TC 処理マルチウェルプレート:ポリスチレンプレート、平底ウェル、滅菌済み、蓋付き</td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ (各サンプルに 1 本、パスごとに 1 本、2 サンプル)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Falcon 352098</td><td>Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td><td>CLS3596</td><td>Corning Costar TC処理マルチプルウェルプレート:ポリスチレンプレート、平底ウェル、滅菌済み、蓋付き</td></tr><tr><td>Acanthamoeba&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td><td>ATCC 30461</td><td>このプロトコルは、ATCC 50655、30872、50702、30010、30461、50370、50703、30137、PRA-115、およびPRA-411</td></tr><tr><td>Axenic culture media (AC6)</td><td>Made in house</td><td>n/a</td><td>20 g biosate peptone、5 g glucose、0.3 g KH2PO4、10 & micro;gビタミンB12、および1杯5mg&nbsp;蒸留脱イオン水1リットル当たりのL-メチオニン。pHを6.6-6.95に調整し、1 M NaOHとオートクレーブを121°Cで調整します。Cで20分間、室温で最大3か月間保存します。&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離機と適切なローター</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Sorvall ST 40R</td><td>50 mLのコニカルチューブを500 x gで5分間回転させることができれば、同等の遠心分離機とローターを使用できます</td></tr><tr><td>走化性および移行ツール</td><td></td><td></td><td>ImageJに基づくフリーソフトウェア、</td></tr><tr><td>https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html ディスポーザブル血液計算盤</td><td>で利用可能Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA</td><td>DHC-N01</td><td>Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic</td></tr><tr><td>ImageJ software with Trackmate plugin (このプロトコルはTrackmateバージョン6.0.2で書かれています。</td><td></td><td></td><td>National Institutes of Healthによって開発されたフリーソフトウェアで、imagej.net で入手できます。https://imagej.net/plugins/trackmate/ Microscopeで利用可能なTrackmateプラグイン</td></tr><tr><td>、できれば自動移動ステージ付き</td><td>ニコン、東京、日本</td><td></td><td>この研究では、Nikon Eclipse Ti-U Microscopeを使用し、自動移動ステージを使用して、一度に複数のウェルに画像を記録できるようにしました。&nbsp;</td></tr><tr><td>NIS-Elementsソフトウェア</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清学ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、ハンプトン、ニューハンプシャー</td>州、米国 <td>BrandTech 26331</td><td>BrandTech accu-jet pro ピペットコントローラー</td></tr><tr><td>血清学ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088</td><td>VWR 血清学ピペット、非発熱性</td></tr><tr><td>滅菌アルミニウムトランスミッションフローセル</td><td>Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA</td><td>FC 81-AL</td><td>陽極酸化アルミニウムシングルチャンネル伝送フローセル、96ウェルプレートフットプリント、倒立顕微鏡用</td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>734-2316</td><td>VWR 組織培養フラスコ, 182.5 cm, 表面処理済み, プラグシールキャップ, 滅菌済み</td></tr></tbody></table>

アカントアメーバ属の定量化運動

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

この方法を使用して成功を収めるには、考慮すべきいくつかの重要な全体的な要素があります。1つ目はアメーバと顕微鏡の物理的なセットアップ、2つ目はイメージングソフトウェアの適切な利用、3つ目はイメージングデータのエクスポートと分析です。
顕微鏡による記録を開始する前に、アメーバが顕微鏡のステージに適切に焦点を合わせていることを確認することが重要です(図1)。ここでは、個々の詳細に最適なZ平面でアメーバに焦点を当てるのではなく、細部まで見ると半透明の状態とは対照的に、黒一色の点になるように、焦点を少しずらして見るのが理想的です。このように表示することで、イメージングソフトウェアとトラッキングソフトウェアは、ファイルをバイナリに変換するときに、個々のアメーバをより簡単に見つけることができます(図2)。イメージングソフトウェアで目標が何であるか、つまり、各アメーバが明確に定義された白い円として表示されることを知ることは、読者が明視野で元の画像を撮影するときに適切な焦点を見つけるのに役立つ可能性があります。次に、各円が明確に定義されると、追跡ソフトウェアは各アメーバの運動性を適切に追跡し、各アメーバの個々の運動性指標を収集できるようになります。
イメージングソフトウェアとトラッキングソフトウェアについて上記のプロトコルのステップバイステップの指示に従い、イメージングソフトウェアの使用の重要な最初のステップを支援するために関連するビデオを参照した後、定量化とデータ分析のためにイメージングソフトウェアデータをエクスポートします。トラッキング・ソフトウェアからの生の出力は、 図3に示すものと似ています。ここでは、エクスポートしたトラックのスポット数が期待値に対して正しいことを確認することが重要です(たとえば、すべてのトラックにフレームの93%が存在するように要求し、ビデオに合計100フレームがある場合、エクスポートされたすべてのトラックは93以上のスポットを持つ必要があります)。スポットが要件に一致しない場合は、追跡ソフトウェアの手順を遡って、必要なパラメータが正しく設定されていることを確認する必要がある場合があります。
未加工のエクスポートから、データ分析シートの作成を開始します(図4)。すべてのトラックは、単一の複製内の単一のアメーバを表していることを覚えておくことが重要です。したがって、 図 4、 図 5、および 図 6 に見られるように、フレームセットまたはタイム ポイントのすべてのトラックを平均化する必要があり (図 4)、このプロセスは、シリーズ全体のフレーム セットまたはタイム ポイントごとに実行する必要があります (つまり、合計 3 時間のビデオが取得され、データ ポイントが時間で分割される場合)。 その後、反復ごとに分析するフレームセット/時間が3つになります( 図5)。最後に、各レプリケートに設定された各フレームの平均のこの組み合わせから、各レプリケートの平均データを 1 つのスペースに結合して、複数のレプリケート間のデータを分析して、時点ごとの真の平均と標準偏差を決定できるようにする必要があります(図 6)。
各反復の平均はデータ分析に使用され、すべての反復の平均と標準偏差の組み合わせまたは標準誤差はグラフ表現に使用されます( 図7の例を参照)。ここで行ったように、複数のサンプルが複数の時点で追跡されているデータを分析する場合は、事後テューキー検定で2元配置反復測定ANOVAを使用してデータを分析するのが最も適切です。これにより、各時点でのサンプル間の違いを判断し、各サンプル内の経時的な違いも判断できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig01.jpg"> 図1:アメーバは、明視野顕微鏡では不透明な暗い形態として現れます。 アメーバの代表的な画像を4倍の倍率で拡大し、わずかにピントが合っていないため、実線のくまとして現れます。スケールバー = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig02.jpg"> 図2:明視野顕微鏡で画像化されたアメーバをバイナリに変換して追跡。 アメーバを4倍倍に拡大し、明視野で(左)、アーチファクトを除去してバイナリに変換し(中央)、追跡後に選択したトラックを表示(右)しました。上段:4枚の画像をつなぎ合わせてウェル全体を撮影したもの、スケールバー=1000μm。下の行:ステッチ前の1つの画像のサイズ、スケールバー= 500 μm。 この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig03.jpg"> 図3:イメージングおよびトラッキングソフトウェアからの即時データ解析出力には、さまざまなデータタイプが含まれています。 トラッキングからの代表的な出力を 図 2 に示します。図 2 は、1 本のビデオです。トラック番号(赤い矢印)のスキップ番号は、トラッキングソフトウェアがパラメータと一致しないトラックを正しく削除したことを示しています。この例では、5385 本中 71 本のみがパラメーターに一致したトラックを特定しました。このような厳格なガイドラインを考えると、この比率は正常です。このトラック数は、このプロトコルで使用されるアメーバの数とも一致しています(例えば、96ウェルプレートにウェルあたり7.5 x 10CFU /mLの200 μLを播種すると、ウェル内には約1,500個のアメーバが存在し、4ステッチの視野でほぼ同じ数が見えると予想されます。アメーバが視界を出たり入ったりするため、アメーバよりも多くのトラックが存在する可能性があります。このトラック番号は、 図 2 でも明らかであり、多数のスポットに対して少数のトラックしか見えません。トラック内のスポットの数(赤いボックス)を常に確認して、正しいトラックの長さのみが含まれていることを確認してください。たとえば、ここではフレームの 93% 以上が含まれており、このセクションには 127 フレームが含まれているため、すべてのスポット数が 118 を超える必要があります。黄色で強調表示されているのは、プロトコルに記載されている測定値です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig04.jpg"> 図4:初期データ出力に続いて必要に応じて再編成されたデータ。 エクスポート後の必要なデータの整理。(A)定量化するために選択された適切な測定値は、追跡ソフトウェアのエクスポート(図3)からコピーされ、新しいスプレッドシートに貼り付けられました。(B)目的の測定値が新しいスプレッドシートに整理された後、各トラックの平均を計算する必要があります。したがって、この代表的な例では、この特異なビデオで使用可能なすべてのトラックの合計距離、最大距離、閉じ込め、平均速度、および変位は、各測定値の特異な数値に平均化されています。ここでも、合計 71 トラックがフレーム 1 から 127 のパラメーターを満たしていることに注意してください。 図 5 に示すように、分析される各ビデオまたはフレーム セットから適切なトラックの数が異なる可能性があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig05.jpg"> 図5:画像シリーズまたはビデオ全体の分析用に設定されたシーケンシャルフレーム。 データ分析にシーケンシャル動画を追加している代表的なイメージです。フレーム 1 から 127 がビデオの 1 時間目を構成すると仮定します (ここでは、1 時間は 28 秒ごとに画像を撮影することで構成されています)。フレーム 128 から 254 はビデオの 2 時間目、フレーム 255 から 381 はビデオの 3 時間目になります。すべての時間からエクスポートされたデータ ( 図 3 でエクスポートされたデータ) を 1 つのシートに結合して、一度にすべてを操作します。 図4で行ったように、各フレームセット/hのすべての使用可能なトラックからのデータが平均化されます。 図5 のすべては、1つのレプリケートまたは1つのサンプルからのデータです。反復が 3 つある場合は、同じようにレイアウトされた 3 つの個別のスプレッドシート タブがあり、これらのデータは新しいタブに供給されます ( 図 6 参照)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig06.jpg"> 図6:各フレームセット内のすべてのアメーバからの合成データで、1回の複製を表すために使用。 (A) 図5 で設定した各フレームの平均をすべて中央に集めて、最終的なデータ解析を完了する必要があります。この代表的な画像では、最初の 3 つのフレーム セット (または時間) の合計距離の平均が表示されています。これは、実行するサンプル/条件/レプリケートごとに繰り返す必要があります。次に、各フレーム セットの各サンプルからの平均を平均化する必要があります (黄色のボックス)。これは、標準偏差と標準誤差を計算できる最終的なデータポイントです。各サンプルの個々の平均 (ここでは、合計距離サンプル 1 の B3、B4、B5 の数値。C3、C4、C5 (Total Distance Sample 2 など)統計分析を実行するために使用されます。このプロセスは、必要なすべての測定(最大距離、閉じ込め、平均速度、変位など)に対して繰り返されます(B)定量化をグラフで表現するには、黄色のボックス内の数値をデータポイントとして使用し、最終的なグラフに使用します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig07.jpg"> 図7:ATCC 30461およびATCC 50370の生の運動性データ。生データ(ここでは1時間あたりの平均±SEとして表される)は以前に収集されており、以前の研究18,19については発表されていません。この運動性の定量化は、これら2つのアメーバが、ガラス表面上の1/4リンガー溶液中の運動性の最初の6時間(その時間に移動したミクロン単位の合計距離で測定)で類似していることを示しています。各時点は 3 つの別々の反復を表し、それぞれが 20 から 200 のアメーバ トラックで構成されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential ...

quantification-of-acanthamoeba-spp-motility

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

phagokinetic運動追跡アッセイは、細胞の動きを評価するために使用される方法です。具体的には、アッセイは、定量的な方法で時間をかけてケモキネシス（ランダム細胞の運動性）を測定します。アッセイは、コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で彼らの動きの測定可能なトラックを作成する細胞の能力を活用しています。...

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

出典: Morales-Soto、N. et al.、 細菌表面運動性アッセイの調製、イメージング、および定量化。 J. Vis. 経験。...

細菌の表面運動性を可視化するためのスウォーミングアッセイ

このビデオは、骨髄由来マクロファージ(BMM)の寄生虫の細胞内増殖を定量化するアッセイを示しています。マクロファージ細胞は、リーシュマニアの運動性侵襲期と非運動性の浸潤期にそれぞれ感染し、メタサイクリック前胸茎と無形成性に浸潤します。寄生虫はマクロファージに侵入し、寄生虫の液胞に内在化され、内部で増殖します。細胞内寄生虫の増殖は、マクロファージと寄生虫核を蛍光染色した上で顕微鏡を用いて定量化されます。...

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

群れの運動性は、物理的および環境的要因の影響を受けます。ここでは、スウォームアッセイの調製とデータ収集に一般的に関連する課題を回避するための2段階のプロトコルとガイドラインについて説明します。巨視的なイメージング技術を使用して、現在の分析技術では提供されない群れの行動に関する詳細な情報を取得します。...

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。...

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

このプロトコルは、筋萎縮性側索硬化症の C.エレガンス モデルにおける軽度、中等度、重度の運動障害を識別するための2つの敏感なアッセイを記述し、 C.エレガンス...

筋萎縮性側索硬化症の C.エレガンス モデルにおける運動障害の評価

ここでは、複数の濃度応答を同時に取得しながら細菌群動性を評価するためのインデューサーグラジエントプレートの使用について説明します。...

インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

このプロトコルは、市販のタンパク質成分を使用してビーズの表面にアクチン彗星を生成する方法を説明しています。このようなシステムは、細胞に見られる突起構造を模倣しており、力生成の生理学的メカニズムを簡単な方法で調べるために使用できます。...

市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成

このプロトコルは、緑膿菌のさまざまなタイプの運動に関与する遺伝的要因を特定するための迅速かつ効率的な方法を提供します。...

緑膿菌における運動表現型を観察するためのハイスループット法

学ぶ アカントアメーバの運動定量化法。顕微鏡と高コンテンツ画像解析を用いてアカントアメーバの運動を可視化・追跡し、アカントアメーバ角膜炎の理解とコンタクトレンズ衛生管理の改善に貢献する。

アカントアメーバ属の定量化運動

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